ביטוי חלבון רקומביננטי, התגבשות, מחקרים ביופיסיקליים של א

המטרה הכוללת של הליך זה היא להכין חלבון רקומביננטי מחיידקים שאינם פתוגניים, כדי לאפשר מחקרים ביו-פיזיקו-כימיים כגון קריסטלוגרפיית קרני X של חלבונים או קינטיקה אנזימטית. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בנוגע לאופן הכנת חלבון רקומביננטי רצוי באמצעות חיידקים שאינם פתוגניים לצורך אפיון ביו-פיזיקלי ראשוני. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לבצע אפיון ביו-פיזיקלי של החלבון הרצוי בכל מעבדה המצוידת במכשור נפוץ, כגון אינקובטורים לתרביות תאים וספקטרופוטומטרים.

כדי להתחיל בפרוצדורה זו, הכין את תגובת הליגציה כפי שפורט בפרוטוקול הטקסט. העבר בפיפטה three microliters מתגובת הליגציה שהוכנה אל מבחנה המכילה 50 microliters של תאי E.coli DH5 alpha בעלי כשירות כימית (chemically competent).

קררו את התמיסה על קרח למשך 30 דקות. לאחר מכן, בצעו הלם חום למשך 45 שניות בטמפרטורה של 42 °C. לאחר מכן, הוסיפו מילליטר אחד של מצע LB וגדלו את התאים תוך כדי ניעור חזק ב-250 rpm, בטמפרטורה של 37 °C למשך 45 דקות.

פרוס 100 microliters של תאים שעברו טרנספורמציה על גבי מצע LB בשיטת ה-auger, המתואח ב-100 micrograms per milliliter של kanamycin. דגריר למשך 18 שעות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. בעזרת טיפ סטרילי, בחר מושבות מתוך המצע.

גדלו את התאים בשלושה מיליליטר של מצע LB מועשר עם ניעור חזק ב-250 סל"ד בטמפרטורה של 18 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות. לאחר מכן, הכינו DNA פלסמי ואשרו את רצף הנוקלאוטידים כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב. לאחר טרנספורמציה חוזרת של זן E.coli BL21, בחרו מושבה באמצעות טיפ סטרילי והחדירו אותה ל-10 מיליליטר של מצע LB המכיל 150 מיקרוגרם למיליליטר kanamycin.

דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך 18 שעות עם ניעור חזק במהירות של 250 סל"ד. לאחר מכן, העבירו 10 mL של תרבית הלילה לליטר אחד של מצע LB וקנמיצין. גדלו בטמפרטורה של 37 °C עד שהצפיפות האופטית ב-600 nm תגיע ל-0.7.

לאחר מכן, טבלו את התרבית במים קריים בטמפרטורת קרח למשך 15 דקות. הוסיפו IPTG לתרבית, כך שהריכוז הסופי יהיה 1 millimolar. דגרו בטמפרטורה של 18 °C למשך 16 עד 18 שעות נוספות.

לאחר מכן, סבבו במרכזפוגה במהירות של 5,000 ×g למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. הסירו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant). השביו את התאים ב-50 µL של PBS המכיל 10 mM imidazole.

בשלב הבא, בצעו ליזיס של התאים פעמיים על קרח, כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב. סבבו במערך צנטריפוגה ב-25,000 ×g למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס כדי להבהיר את ליזיס התאים. לאחר מכן, ערבבו שלושה מיליליטרים של חרוזי ניקל ו-47 מיליליטרים של PBS המכיל 10 מילימולר imidazole בתוך מבחנה קונית של 50 מיליליטר.

הזרמו בכוח הכבידה את תמיסת הבאפר הנוספת כדי להשקיע את החרוזים שעברו שיווי משקל בעמודת כרומטוגרפיה מזכוכית בגודל 2.5 על 10 סנטימטרים. העבירו את הנוזל העליון לעמודה באמצעות פיפטה. דגרו בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים על גלגל סיבוב במהירות של 20 סיבובים לדקה.

לאחר מכן, הרשו לנוזל העילאי להתנקז בכבידה. שטפו את חרוזי הניקל שלוש פעמים באמצעות 100 milliliters של PBS המכיל 10 millimolar imidazole עבור כל שטיפה. לאחר מכן, הוסיפו חמישה milliliters של PBS המכיל 250 millimolar imidazole כדי להמיס את חלבון ה-RBC 1531.

נתחו 15 µL מהאלואציה באמצעות SDS Page כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב. העבירו בעזרת פיפטה את הפרקציות שנאספו לצינור דיאליזה. הניחו את הצינור בתוך כוס כימית המכילה ארבעה ליטרים של בופר התואם לפיצול על ידי thrombin בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך לילה.

ביום למחרת, העבירו באמצעות פיפטה את הפרקציות למבחנה קונית בנפח 15 מיליליטר. מדדו את הבליעה ב-280 ננומטר כדי להעריך את ריכוז החלבון, כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, העבירו 50 מיקרוליטר של חלבון RBC 1531 למספר מבחנות.

הוסיפו כמות שונה של thrombin לכל מבחנה והדגירו בטמפרטורה של 20 °C למשך שלוש שעות. לאחר קביעת הכמות המינימלית של thrombin הדרושה, הוסיפו 10 mg של חלבון ו-60 units של thrombin למבחנה בנפח 15 mL. הדגירו בטמפרטורה של 20 °C למשך שלוש שעות.

בשלב הבא, העבירו את החלבון שעבר עיכול על ידי תרומבין למסננת צנטריפוגלית. ביצעו צנטריפוגה ב-3,000 ×g בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס כדי להפחית את הנפח לפחות מחמישה מיליליטרים. לאחר מכן, ה([{अनुवाद: 적용/העבירו}]) את החלבון המרוכז לעמודת כרומטוגרפיית הפרדה לפי גודל (size exclusion chromatography) שהוכנה מראש.

אספו 60 מקטעי אלוציה בנפח של 0.5 milliliters לכל מבחנה. הריצו 15 microliters מכל מקטע על ג'ל SDS Page בריכוז 15%, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, שלבו את המקטעים המכילים את החלבון RBC 1531.

כדי להתחיל, העבירו את הפראקציות המאוחדות למבחנה עם מסנן צנטריפוגלי. בצעו צנטריפוגה ב-3,000 ×g בטמפרטורה של 4 °C כדי לרכז את החלבון לריכוז של כ-18.5 mg/mL. לאחר מכן, הוסיפו 50 µL מכל תמיסת סריקת גביש לבארות של פלטת גביש מסוג sitting drop בעלת 96 בארות.

הוסף 0.5 µL של תמיסת החלבון המרוכזת על גבי משטח תמיכה. ערבב בנפרד את תמיסת החלבון עם 0.5 µL של תמיסת הבאר. כסה את הפלטה בסרט דביק שקוף.

דגרו בטמפרטורה של 18 °C ואפשרו דיפוזיית אדים. בעזרת מיקרוסקופ אור, סרקו את הטיפות בהגדלה של 20 עד 40 פעמים כדי לנטר את היווצרות הגבישים מדי יום במשך שבועיים עד שלושה שבועות. לאחר הכנת תתי-המצעים של NTP, הוסיפו כל אחד מהם לפלטה בעלת 96 בארות.

הוסף 20 µg של חלבון RBC 1531 לכל באר באמצעות פיפט לערבוב. כסה את הפלטה במכסה שלה והדגר בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות. לאחר מכן, העבר את הפלטה למקלח מים בטמפרטורה של 70 °C למשך 15 דקות כדי לעצור את התגובות הקטליטיות המתווכות על ידי RBC 1531.

בשלב הבא, הוסף מיקרוליטר אחד של S.cerevisiae inorganic pyrophosphatase לכל באער. הדגר בטמפרטורה של 20 degrees Celsius למשך 30 דקות. לאחר מכן, הוסף 16 מיקרוליטר של תמיסת חומצה מוליבדאטית ללוח התגובה כדי לפתח את הצבע.

לאחר 15 דקות, קראו את הצפיפות האופטית באורך גל של 690 nanometers. במחקר זה, מוצר החלבון של הגן BC1531 מסדרת B מאופיין ברמה המולקולרית. לאחר טיהור באמצעות כרומטוגרפיית זיקה לניקל (nickel affinity chromatography), נערך ניסוי עיכול באמצעות תרומבין.

נמצא כי 0.3 units של thrombin היא הכמות הנמוכה ביותר הנדרשת להסרה מלאה של תג האפיניות מ-RBC 1531. לאחר העיכול, החלבון נקי התג מטהר לרמה של כ-99% purity, באמצעות כרומטוגרפיית הדירה של גודל (size exclusion chromatography). לאחר מכן, המצב האוליגומרי מוערך באמצעות כרומטוגרפיית הדירה של גודל.

מכיוון ש-RBC 1531 אלוואה בנפח של כ-84 milliliters, משקלו המולקולרי מוערך ב-55 kilodaltons. המשקל המולקולרי המחושב של המונימר הוא כ-13 kilodaltons. לפיכך, RBC 1531 מתגבש כטטראמר.

לאחר מכן מבוצע סריקת התגבשות באמצעות שיטת דיפוזיה של אדי טיפה יושבת. גבישים נצפים לאחר יומיים עם sodium citrate בריכוז 1 M ו-20% polyethylene glycol 3,000, וכן עם sodium cacodylate בריכוז 0.1 M ו-sodium citrate בריכוז 1 M. לאחר מכן נקבעת הפעילות של NTPase.

לא נצפה שינוי צבע גלוי לאחר הוספת מוליבדאט לתגובת ההידרוליזה המתווכת על ידי RBC 1531. עם זאת, כאשר מוסיפים פירופוספאטאז, נראה כי הצבע משתנה לכחול עמוק. לאחר מכן, הצפיפות האופטית ב-690 ננומטר וריכוז ה-NTP מנותחים באמצעות רגרסיה לא ליניארית.

נקבע כי לאנזים RBC 1531 מהירות מקסימלית של 0.75 וקבוע מיכאלס של 10 micromolar. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להכין את דגימות החלבון ללא דיחוי ולהשליך פראקציות המכילות זיהומים העשויים לעכב את התגבשות החלבון או להוביל לשגיאות במבחנים אנזימטיים. לאחר פיתחו, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום האנזימולוגיה ומדעי החלבון האחרים לאפיין חלבונים רלוונטיים באמצעות ספקטרופוטומטרים הנמצאים ברוב המעבדות.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי רעיונות כלליים של הכנת חלבון רקומביננטי, סריקות התגבשות וקינטיקה אנזימטית, ניתן ליישמה גם לניתוח כימי ביופיזיקלי עבור חלבונים אחרים המעניינים אותנו. אל תשכחו לנקוט במשנה זהירות בעבודה עם חלבונים, שכן הם עלולים להיות לא יציבים ביותר. מומלץ לנקוט באמצעי זהירות כגון השארת דגימות על קרח והקפאה ב-80°C לאחסון לטווח ארוך.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן הכנת חלבון רקומביננטי מחיידקים שאינם פתוגניים להשגת גבישי חלבון לצורך קביעת מבנה באמצעות קריסטלוגרפיה של קרני X, וכן כיצד לאפיין פעילות אנזימטית באמצעות שיטה קולורימטרית.