ביטוי חלבון רקומביננטי, התגבשות, מחקרים ביופיסיקליים של א Bacillus -שמר Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

המטרה הכוללת של הליך זה היא להכין חלבון רקומביננטי מחיידקים לא פתוגניים כדי להקל על מחקרים כימיים ביופיזיים כגון קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן של החלבון או קינטיקה אנזימטית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח כיצד להכין חלבון רקומביננטי מעניין באמצעות חיידקים לא פתוגניים לאפיון ביופיזיקלי ראשוני. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאפיון ביופיזי לחלבון מעניין יכול להיעשות בכל מעבדה המצוידת במכשירים נפוצים כגון אינקובטורים של תרביות תאים וספקטרופוטומטרים.

כדי להתחיל בהליך זה, הכן את תגובת הקשירה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הכניסו שלושה מיקרוליטרים של תגובת הקשירה המוכנה לתוך צינור המכיל 50 מיקרוליטר של תאי אלפא E.coli DH5 בעלי יכולת כימית. בעזרת פיפטה מערבבים בעדינות את התמיסה.

קרח את התמיסה למשך 30 דקות. לאחר מכן, הלם חום למשך 45 שניות ב-42 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של מדיום LB וגידלו את התאים תוך כדי ניעור נמרץ ב-250 סיבובים לדקה, ב-37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.

מורחים 100 מיקרוליטר של תאים שעברו טרנספורמציה על צלחת מקדחה LB בתוספת 100 מיקרוגרם למיליליטר קנמיצין. דגירה למשך 18 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. בעזרת קצה סטרילי, בחר מושבות מהצלחת.

גדל את התאים בשלושה מיליליטר של מדיום LB בתוספת עם ניעור נמרץ ב -250 סיבובים לדקה ב -18 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות. לאחר מכן, הכינו DNA פלזמה ואשרו את רצף הנוקלאוטידים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר שינוי מחדש של זן E.coli BL21, בחר מושבה באמצעות קצה סטרילי וחסן 10 מיליליטר של מדיום LB המכיל 150 מיקרוגרם למיליליטר קנמיצין.

דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות עם טלטול נמרץ ב-250 סיבובים לדקה. לאחר מכן, העבירו את 10 מיליליטר תרבית הלילה לליטר אחד של מדיום LB וקנמיצין. גדל ב-37 מעלות צלזיוס עד שהצפיפות האופטית ב-600 ננומטר מגיעה ל-0.7.

ואז טבלו את התרבות במים קרים כקרח למשך 15 דקות. הוסף IPTG לתרבית, כך שהריכוז הסופי הוא מילימול אחד. דגירה בטמפרטורה של 18 מעלות צלזיוס למשך 16 עד 18 שעות נוספות.

לאחר מכן, צנטריפוגה בטמפרטורה של 5,000 פעמים G למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. הסר בזהירות את הסופרנטנט. השעו מחדש את התאים ב-50 מיקרוליטר PBS המכילים 10 מילי-מולרי אימידזול.

לאחר מכן, ליזר את התאים פעמיים על קרח כמפורט בפרוטוקול הטקסט. צנטריפוגה בטמפרטורה של 25,000 פעמים G למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לנקות את ליזאט התא. לאחר מכן, מערבבים שלושה מיליליטר של חרוזי ניקל ו-47 מיליליטר PBS המכילים 10 מילי-מולרי אימידזול בצינור חרוטי של 50 מיליליטר.

כוח הכבידה זורם את המאגר הנוסף כדי ליישב את החרוזים המאוזנים בעמודת כרומטוגרפיה מזכוכית בגודל 2.5 על 10 סנטימטרים. בעזרת פיפטה, העבירו את הסופרנטנט לעמוד. דגירה בארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים על גלגל מסתובב ב-20 סיבובים לדקה.

לאחר מכן, אפשר לסופרנטנט להתנקז על ידי כוח הכבידה. שוטפים את חרוזי הניקל שלוש פעמים באמצעות 100 מיליליטר PBS המכיל 10 מילי-מולרי אימידזול לכל שטיפה. לאחר מכן, יש למרוח חמישה מיליליטר של PBS המכיל 250 מילי-מולרי אימידזול כדי לחסל את חלבון RBC 1531.

נתח 15 מיקרוליטר של הפליטה באמצעות דף SDS כמתואר בפרוטוקול הטקסט. פיפטה את השברים שנאספו לתוך צינור דיאליזה. הנח את הצינור בכוס המכילה ארבעה ליטר מאגר תואם מחשוף תרומבין בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.

למחרת, השתמש בפיפטה כדי להעביר את השברים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. מדוד את הספיגה ב-280 ננומטר כדי להעריך את ריכוז החלבון כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן העבירו 50 מיקרוליטר של חלבון RBC 1531 למספר צינורות.

מוסיפים כמות שונה של טרומבין לכל צינור ודוגרים בחום של 20 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות. לאחר קביעת הכמות הנמוכה ביותר של תרומבין יש להוסיף 10 מיליגרם חלבון ו-60 יחידות תרומבין לשפופרת של 15 מיליליטר. דגירה בחום של 20 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות.

לאחר מכן, העבירו את החלבון המעוכל תרומבין לצינור פילטר צנטריפוגלי. צנטריפוגה ב-3,000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס כדי להקטין את הנפח לפחות מחמישה מיליליטר. לאחר מכן, החל את החלבון המרוכז על עמודת כרומטוגרפיה של אי הכללה בגודל מוכן.

אסוף 60 שברים עם 0.5 מיליליטר לצינור. הפעל 15 מיקרוליטר מכל שבר על ג'ל 15% SDS Page כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן שלב את השברים המכילים את חלבון RBC 1531.

כדי להתחיל, העבירו את השברים המשולבים לצינור פילטר צנטריפוגלי. צנטריפוגה ב-3,000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס כדי לרכז את החלבון לכ-18.5 מיליגרם למיליליטר. לאחר מכן הוסף 50 מיקרוליטר מכל תמיסת סינון התגבשות לבארות של צלחת התגבשות טיפה יושבת 96 באר.

הוסף 0.5 מיקרוליטר מתמיסת החלבון המרוכזת על מיטת ישיבה. מערבבים בנפרד את תמיסת החלבון עם 0.5 מיקרוליטר מתמיסת הבאר. מכסים את הצלחת בסרט דבק שקוף.

דגירה בטמפרטורה של 18 מעלות צלזיוס ואפשר פיזור אדים. בעזרת מיקרוסקופ אור, סרוק את הטיפות בהגדלה של פי 20 עד 40 כדי לעקוב אחר היווצרות הגבישים מדי יום במשך שבועיים-שלושה. לאחר הכנת מצעי ה- NTP הוסף כל אחד לצלחת של 96 באר.

הוסף 20 מיקרוגרם של חלבון RBC 1531 לכל באר בעזרת פיפטה לערבוב. מכסים את הצלחת במכסה ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן, העבירו את הצלחת לאמבט מים של 70 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי לעצור את התגובות הקטליטיות בתיווך RBC 1531.

לאחר מכן, הוסף מיקרוליטר אחד של S.cerevisiae פירופוספטאז אנאורגני לכל באר. דוגרים בחום של 20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן הוסף 16 מיקרוליטר של תמיסת חומצה מוליבדט לצלחת התגובה כדי לפתח את הצבע.

לאחר 15 דקות, קרא את הצפיפות האופטית ב-690 ננומטר. במחקר זה תוצר החלבון של הגן BC1531 רציני B מאופיין ברמה המולקולרית. לאחר הטיהור על ידי כרומטוגרפיה של זיקה לניקל מבוצע שובל עיכול תרומבין.

0.3 יחידות תרומבין נתפסת ככמות הנמוכה ביותר הנדרשת כדי להסיר לחלוטין את תג הזיקה מ-RBC 1531. לאחר העיכול החלבון נטול התגים מטוהר לטוהר של כ-99%, באמצעות כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל. לאחר מכן, הסטטוס האוליגומרי מוערך על ידי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל.

מכיוון ש-RBC 1531 נפלט בכ-84 מיליליטר, משקלו המולקולרי מוערך ב-55 קילודלטון. המשקל המולקולרי המחושב של המונומר הוא כ-13 קילודלטון. לכן, RBC 1531 מתאסף כטטרמר.

לאחר מכן מבוצע סינון התגבשות בשיטת דיפוזיה של אדי טיפה בישיבה. גבישים נראים לאחר יומיים עם נתרן ציטראט טוחנת אחת ו-20% פוליאתילן גליקול 3,000, ועם 0.1 טוחנות נתרן קקודילאט ונתרן ציטראט טוחנת אחת. לאחר מכן נקבעת פעילות NTPase.

לא נראה שינוי צבע נראה לעין לאחר הוספת מוליבדט לתגובת ההידרוליזה בתיווך RBC 1531. עם זאת, כאשר מוסיפים פירופוספטאז נראה שהצבע משתנה לכחול עמוק. לאחר מכן מנתחים את הצפיפות האופטית ב-690 ננומטר וריכוז NTP באמצעות רגרסיה לא ליניארית.

האנזים RBC 1531 נקבע כבעל מהירות מקסימלית של 0.75 וקבוע מיכאליס של 10 מיקרומולר. בזמן ניסיון הליך זה חשוב להכין דגימות חלבונים ללא דיחוי ולהשליך שברים המכילים זיהומים המעכבים את התגבשות החלבון או מכניסים שגיאות במבחנים אנזימטיים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האנזימולוגיה ומדעי החלבונים האחרים לאפיין חלבונים מעניינים באמצעות ספקטרופוטומטרים המעוטרים ברוב המעבדות.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי רעיונות כלליים של הכנת חלבון רקומביננטי, מסכי התגבשות וקינטיקה אנזימטית, ניתן ליישם אותה גם בניתוח כימי ביופיזיקלי עבור חלבונים אחרים שמעניינים אותנו. אל תשכחו להיזהר בעבודה עם חלבונים מכיוון שהם עלולים להיות מאוד לא יציבים. אמצעי זהירות כמו השארת דגימות מעל הקרח וקירור ב-80 מעלות לאחסון לטווח ארוך יתבקשו.

לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד להכין חלבון רקומביננטי מחיידקים לא פתוגניים כדי להשיג גבישי חלבון לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן וכיצד לאפיין פעילות אנזימטית בשיטה קולורימטרית.