הכנה ואפיון של נוזל HDL מחקה ננו-חלקיקים עבור אנקפסולציה גורם העצב הגדילה

המטרה הכללית של מאמר זה היא להציג שיטות להכנה ולאפיון של ננו-חלקיקים המדמים ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL) וטעונים בגורם צמיחה עצבי (NGF). להכנת ננו-חלקיקים רגילים המדמים ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה נעשה שימוש בהומוגניזציה פשוטה. ההליך פשוט וניתן להרחבה.

יתרה מכך, הננו-חלקיק שיפר משמעותית את יעילות הכלוא, גם עבור NGF ו-APOA1 בננו-חלקיקים. הושגו פתרונות למספר אתגרים באפיון הננו-חלקיק, כולל הפרדת NGF שאינו כלוא מננו-חלקיקי NGF, ביצוע מחקרי רדיוס אמינים in vitro, והזמינות הביולוגית של ננו-חלקיקי NGF. לתחילת הפרוטוקול, ערבבו 10 µL של NGF עם 10 µL של protamine USP במבחנה של מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 mL והניחו לתערובת לעמוד במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר להיווצרות הקומפלקס.

בשלב הבא, הוסיפו 59 µL של phosphatidylcholine ו-11 µL של sphingomyelin לבקבוק זכוכית. הוסיפו גם 4 µL של phosphatidylserine,‏ 15 µL של cholesteryl oleate ו-45 µL של tocopheryl polyethylene glycol succinate. ערבבו ואפרו את האתנול תחת זרם עדין של חנקן למשך כחמש דקות.

כל החומרים העזרים צריכים ליצור שכבה שומנית דקה בתחתית מבחנת הזכוכית. הוסף מיליליטר אחד של מים אולטרה-טהורים למבחנה והומוגניז ב-9,500 rpm למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי ליצור את הננו-חלקיקים הראשוניים, או NPs. לאחר מכן, הוסף את התצורה שהוכנה ל-NPs הראשוניים.

דגרו את התרחיף בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות תוך כדי ערבוב, באמצעות מוט ערבוב קטן בתוך מבחנה מזכוכית. קררו את ה-NPs על ידי ערבוב בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות נוספות. לאחר הקירור, הוסיפו 106 µL של apolipoprotein A-1 וערבבו בטמפרטורת החדר למשך הלילה כדי ליצור את ה-NGF HDL-mimicking NPs הסופיות.

מדוד את גודל החלקיקים ואת פוטנציאל הזטא באמצעות מנתח חלקיקים בהתאם להוראות היצרן. עמודת כרומטוגרפיית סינון ג'ל בעלת קשרי צלב משמשת להפרדת ה-NGF שלא נטען מהננו-חלקיקים המדמים HDL-NGF, ולקביעת יעילות הכליאה של ה-NGF. להכנת העמודה, העבר 15 milliliters של תרחיף sepharose 4B CL לכלי כימי של 50 milliliters.

ערבבו את תגלי התמיסה של החרוזים ושפכו חלק ממנה לתוך עמודה. הקישו בעדינות על העמודה כדי להסיר בועות אוויר. המתינו מספר דקות עד שהממס ינוער והחרוזים ישקעו.

המשיכו להוסיף את שאר התמיהה. שטפו את הדופן הפנימית של העמודה כדי לנקות את החרוצים. נקזו את הממס עד שגובה הממס יהיה מעט מעל החלק העליון של הפאזה הנייחת.

לאחר מכן, שטפו והכינו את העמודה באמצעות 20 milliliters של 1X phosphate-buffered saline. כדי למדוד את יעילות הלכידה של ה-NGF, טענו 200 microliters של NGF HDL-mimicking NPs על העמודה ובצעו אלוציה עם 1X PBS. כפי שנעשה קודם לכן, אספו סך הכל 12 פראקציות של one-milliliter.

הכינו שמונה צינורות דיאליזה על פי הוראות היצרן. הוסיפו 30 מיליליטר של מzיווים לשחרור (release medium) לתוך מבחנה לצנטריפוגה בנפח של 50 מיליליטר. לאחר מכן, חממו את התמיסה ל-37 degrees Celsius במכשיר ניעור במהירות של 135 rpm.

סגרו את צינור הדיאליזה והניחו אותו בתוך תמיסת השחרור. שאבו במהירות 100 µL מתמיסת השחרור מהחלק שמעבר לצינור הדיאליזה כדגימה לזמן אפס. העבירו מיד את הדגימה לטמפרטורה של 20°C- לצורך ניתוח מאוחר יותר.

הוסיפו 100 µL של תווך שחרור טרי לתוך מבחנת הצנטריפוגה כדי להחליף את הדגימה שהוצאה. לאחר מכן, הפעילו את הטיימר. בנקודות הזמן של 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 ו-72 שעות, הוציאו 100 µL מתווך השחרור והחליפו אותם ב-100 µL של תווך טרי.

העבירו מיד את הדגימות שנשאבו לטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס לצורך אנליזה מאוחרת. לאחר הומוגניזציה של שלוש דקות, התקבלו גודלי חלקיקים עקביים עבור ננו-חלקיקי הפרוטוטיפ. לננו-חלקיקי ה-NGF הסופיים היה גודל חלקיקים של 170 ננומטר עם התפלגות גדלים צרה ומונו-דיספרסית.

NGF שאינו טעון וננו-חלקיקים הופרדו באופן מלא בעמודת סינון ג'ל. הננו-חלקיקים נשטפו בפרקשנים שתיים עד ארבע. מדידת ELISA הצביעה על כך ש-NGF חופשי נשטף בפרקשן 7 עד פרקשן 10.

יעילות הכליאה המחושבת של NGF הייתה כ-66%. שחרור in vitro של ננו-חלקיקי NGF מוצג כאן. על ידי הוספת PBS ו-BSA למדיום השחרור, NGF חופשי עבר דרך ממברנת הדיאליזה עם התאוששות של מעל 85%. לעומת זאת, ננו-חלקיקי NGF הראו פרופיל שחרור איטי, כאשר כ-10% מה-NGF השתחרר מהננו-חלקיקים לאורך 72 שעות. ננו-חלקיקי NGF עוררו צמיחת נוריטים בתאי PC12 במידה דומה לזו של NGF חופשי.

צמיחת נוריטים נצפתה בבירור תחת המיקרוסקופ עבור שתי הקבוצות כאשר המינון היה 50 ng/mL. ננו-חלקיקי NGF הגדילו באופן משמעותי את הריכוז בפלזמה והפחיתו את הספיגה של NGF בכבד, בכליות ובטחול של העכברים. ננו-חלקיקים המדמים HDL סייעו ל-NGF, ובכך אפשרו זמן מחצית חיים ארוך ויציבות in vivo.

לאחר השליטה בטכניקה, ניתן להכין ננו-חלקיקים מונו-דיספרסיים תוך שלוש דקות באמצעות שיטת הומוגניזציה, אם היא מבוצעת כהלכה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להשתמש בזרם חנקן עדין כדי לאדות את הממס, ולוודא שלא נשאר שארית ליפידים הדבקה על דופן המכל לאחר ההומוגניזציה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן הכנת ננו-חלקיקים דמויי HDL באמצעות שיטת הומוגניזציה, וכיצד לאפיין ננו-חלקיקים טעונים NGF.