בידוד אגל ליפידים על ניתוח כמותי ספקטרומטריית מסה

המטרה הכללית של בידוד טיפות ליפידים עבור ספקטרומטריית מסות כמותית היא להבין את תפקודן של אורגנלות אלו, למשל, בשעת שכפול של פתוגנים כגון נגיף הדלקת הכבד C. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום המחלות הזיהומיות, כגון הסיבה לכך שפתוגנים נקשרים לטיפות עבור השכפול. בידוד טיפות הליפידים יכול להתבצע בתוך שש עד שבע שעות.

במהלך הליך זה, חשוב למנוע זיהום של קרטין. ראשית, הוציאו 50 milliliters מכל בקבוק של מצע DMEM והוסיפו 50 milliliters של סרום עגל עוברי דיאלייז. לאחר מכן, המיסו 50 milligrams של ליזין מסומן בפחמן 13 ו-50 milligrams של ארגינין מסומן בפחמן 13 בתוך one milliliter של מצע.

ערבב היטב, והוסף את החומצות האמינויות למצע ה-DMEM בתוספת FCS. לאחר מכן, הוסף PenStrep ותחליף גלוטמין. סנן את המצע באופן סטרילי באמצעות פילטר של 0.45 micron, וסמן את הבקבוק כמצע SILAC כבד.

להכנת המצע הקל, חזרו על שלבים אלו תוך שימוש ב-50 milligrams של arginine וב-50 milligrams של lysine. סמנו את הבקבוק כמצע SILAC קל. בצעו טריפסינציה לתאים, ופזרו אותם לשתי בארות בצלחת תרבית בעלת שש בארות.

בבאר אחת יש להכיל שני מיליליטרים של מצע SILAC כבד, ובבאר השנייה שני מיליליטרים של מצע SILAC קל. יש לגדל את התאים למשך שישה מעברים לפחות. לאחר שישה מעברים, שילוב החומצות האמינו הכבדות צריך להיות גבוה מ-95%. יש לקצור מיליון תאים מאוכלוסיות התאים המסומנות ככבדות וקלות על מנת לנתח את יעילות השילוב.

לאחר שטיפת התאים ב-1X PBS, השקיעו אותם על ידי צנטריפוגציה למשך חמש דקות ב-160 ×g ובטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. השעיקו מחדש את משקעי התאים ב-150 µL של MS-buffer. לאחר מכן, דגרו את התאים על קרח למשך 30 דקות.

לאחר מכן, קרעו את התאים באמצעות סוניקציה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. הסירו את שיירי התאים על ידי סנטריפוגה למשך 10 דקות ב-11,000 times g ובטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. העבירו את הסופרנטנט למבחנה חדשה, וקבעו את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת חלבון התואמת לדטרגנט.

לאחר מכן, ערבבו 75 µg של חלבון עם 6x sample buffer. לאחר הרתחה ב-95 °C למשך חמש דקות, הפרידו את החלבונים באמצעות SDS-PAGE ב-SDS running buffer ב-180 V למשך כשעה אחת. לאחר צביעה ב-Coomassie, גזרו את פס החלבון הרלוונטי ונתחו את יעילות השילוב באמצעות אנליזת MS.

הדביקו את אוכלוסיית התאים הקלה עם נגיף הדגל (reporter virus) של הפטיטיס C על ידי דגירה של התאים עם מלאים סיביים למשך ארבע שעות בטמפרטורה של 37 °C. הרחיבו את התאים הקלים שהודבקו ב-HCV ואת התאים הכבדים שאינם נגועים כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. אם נעשה שימוש בזן HCV הנושא גן עמידות לבלסטיצידין, הוסיפו 10 µg/mL של blasticidin S למצע הקל כדי לבחור תאים חיוביים ל-HCV.

יום אחד לפני בידוד טיפות השומן, שטפו את התאים ב-PBS, בצעו טריפסיניזציה ותלו אותם מחדש במדיום הקל או הכבד המתאים. ספרו את התאים באמצעות תא ספירה של Neubauer. לאחר מכן, זרעו שבעה מיליוני תאים מכל אוכלוסייה בתוך צלח לתרבית תאים של 150 סנטימטר רבוע.

הכינו לפחות חמישה צלחים לכל אוכלוסיית תאים קלה וכבדה. תרבטו את התאים ב-30 milliliters של מצע לכל צלח למשך לילה. למחרת, הסירו את המצע ושטפו את התאים ב-1X PBS.

נתקו את התאים ב-1X PBS באמצעות גורף תאים (cell scraper). לאחר ספירת שתי אוכלוסיות התאים כפי שנעשה קודם לכן, העבירו מספרים שווים של תאים למבחנות צנטריפוגה של 50 מיליליטר. השקיעו את התאים על ידי צנטריפוגה למשך חמש דקות ב-160 times g ובטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.

הסיר את ה-PBS, והשהה מחדש את משקע התאים במיליליטר אחד של בופר סוכרוז. העבר את תרחיף התאים להומוגנייזר Ounce בעל התאמה הדוקה לפני ליזיס התאים באמצעות 200 תנועות על קרח. לאחר מכן, העבר את הליזאט לשפרועת מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, ושקע את הגרעינים ושאריות התאים למשך 10 דקות ב-1,000 ×g ובטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.

לאחר הצנטריפוגציה, אחסן מנה של 25 µL מהfrakציה הפוסט-גרעינית, או PNS, בטמפרטורה של 20- °C כבקרת קלט. השאר את שאר פראקציית ה-PNS בתחתית מבחנת הצנטריפוגה, והוסף מעליה כ-3 mL מתוך תמיסות השטיפה של טיפות הליפידים. בצע צנטריפוגציה למשך שעתיים ב-100,000 ×g ובטמפרטורה של 4 °C.

לאחר הסרימרגזציה, אספו את פראקציית טיפות הליפידים הצפה מהחלק העליון של המבחנה באמצעות קנולה קהה וכיפופה. לאחר מכן, העבירו את פראקציית טיפות הליפידים למבחנה לצנטריפוגה, כסו אותה בתמיסת שטיפה לטיפות ליפידים וחזרו על שלב הסרימרגזציה. איסוף טיפות הליפידים מחלקו העליון של הגרדיאנט דורש ניסיון.

וזה קל יותר ככל שהשבר גדול יותר. ניתן להשתמש בתאי שומן לצורך תרגול, או שניתן להזין את התאים באולאט (oleate) כדי להגדיל את כמות טיפות הליפידים.

שוב, אספו את פראקציית טיפות השומן הצפה מחלקו העליון של הנבובת באמצעות קנולה קהה וכפופה. העבירו את טיפות השומן לנבובת מיקרופוגה חדשה בנפח 1.5 milliliter, והוסיפו 500 microliters של תמיסת שטיפה לטיפות שומן. לאחר מכן, סבבו את הדגימה במשך 20 דקות ב-21,000 ×g ובטמפרטורה של ארבעה degrees Celsius.

הסיר את בופר השטיפה שמתחת בעזרת טיפ של פפיפט לטעינת ג'ל, וחזור על שלב השטיפה שלוש פעמים. לאחר ההסרה הסופית של בופר השטיפה, ערבב 5 µL של פרקציות טיפות ליפיד עם 10 µL של בופר ליזיס NP 40 כדי לקבוע את תכולת החלבון. דגיין את הדגימה על קרח למשך שעה אחת כדי לנטרל את הויראליות אם עובדים עם חומרים זיהומיים.

בשלב זה, ניתן לשמור את פראקציוני טיפות הליפידים בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. לאחר מכן, ערבבו נפח התואם לפחות ל-35 µg של חלבון עם loading dye בריכוז 4x. במידה ועובדים עם חומרים זיהומיים, הדגרירו את התערובת על קרח למשך שעה אחת כדי לנטרל את הנגיף.

הרתח את הדגימה בטמפרטורה של 95 °C למשך חמש דקות. לאחר מכן, בצע SDS-PAGE ולאחריו צביעת Coomassie כדי להכין את הדגימה לכרומטוגרפיה נוזלית המשולבת עם ספקטרומטריית מסות טנדם, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. כדי לנתח את טהרות טיפות הליפידים, דלל מנות של פראקציות טיפות ליפידים, ביחס של 1:1 עד 1:2, באמצעות באפר ליזיס NP 40.

דללו את מנות הבקרת הקלט ביחס של אחד לעשרה עם אותו באפר. הדגירו את הדגימות על קרח למשך שעה אחת כדי להשבית את הווירוס במידה ועובדים עם חומר זיהומי. לאחר מכן, קבעו את רמת החלבון באמצעות בדיקת חלבון התואמת לדטרגנטים.

לאחר מכן, ערבבו כמות שווה של חלבון עם 6x sample buffer, והדגירו את הדגימות על קרח למשך שעה אחת כדי להשבית את הווירוס במידה ועובדים עם חומרים זיהומיים. לבסוף, בצעו SDS-PAGE, והעבירו את החלבונים לממברנת ניטרוסלולוז באמצעות tank blotting במתח של 80 volts למשך 90 דקות. מוצג כאן ניתוח western blot מייצג של פראקציות פוסט-גרעיניות ושל טיפות ליפידים.

ה-western blot מראה בבירור העשרה של חלבוני הסמן של טיפות שומן, perilipin two ו-perilipin three, בfraktsiot של טיפות שומן, והדלרה של סמנים של מדורים תאיים אחרים. ניתן לנתח fracciones פוסט-גרעיניות ושל טיפות שומן באופן נוסף באמצעות צביעת Coomassie blue וצביעת כסף. מפת חום זו ממחישה את מספר הפפטידים ואת אחוז כיסוי החלבון של חלבונים שזוהו בfraktsiot של טיפות שומן בתאים שנחקרו.

מפת החום הסופית מתארת כיצד זיהום ב-HCV משנה את טיפות הליפידים ליום. חלבונים הקשורים לטיפות ליפידים שהועשרו מסומנים באדום, וחלבונים הקשורים לטיפות ליפידים שרמתם ירדה מסומנים בכחול. היתרון המרכזי של שיטה זו הוא שאנו מערבבים את התאים לפני הבידוד ולפני בידוד טיפות הליפידים, ובכך אנו יכולים למזער שגיאות שעלולות להתרחש במהלך ליזיס התאים ובמהלך שלבי הבידוד.