בידוד אגל ליפידים על ניתוח כמותי ספקטרומטריית מסה

המטרה הכוללת של בידוד טיפות שומן לספקטרומטריית מסה כמותית היא להבין את תפקודם של אברונים אלה, למשל, בשכפול של פתוגנים כמו נגיף הפטיטיס C. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום המחלות הזיהומיות, כגון מדוע פתוגנים נקשרים לטיפות לצורך שכפול. בידוד טיפות שומנים יכול להיעשות תוך שש עד שבע שעות.

ובמהלך הליך זה, חשוב להימנע מזיהום קרטין. כדי להתחיל, הסר 50 מיליליטר מכל בקבוק של מדיום DMEM והוסף 50 מיליליטר של סרום עגל עוברי בדיאליזה. לאחר מכן, ממיסים 50 מיליגרם פחמן 13 המסומן ליזין ו-50 מיליגרם פחמן 13 המסומן ארגינין במיליליטר אחד של מדיום.

מערבבים היטב ומוסיפים את חומצות האמינו למדיום DMEM בתוספת FCS. לאחר מכן הוסיפו PenStrep ותחליף גלוטמין. מסננים סטריליים את המדיום באמצעות מסנן 0.45 מיקרון, ומסמנים את הבקבוק כמדיום SILAC כבד.

כדי להכין את המדיום הבהיר, חזור על שלבים אלה באמצעות 50 מיליגרם ארגינין ו-50 מיליגרם ליזין. סמן את הבקבוק כמדיום SILAC בהיר. נסה את התאים, ופצל לשתי בארות של צלחת תרבית של שש בארות.

באר אחת צריכה להכיל שני מיליליטר של מדיום SILAC הכבד, והשנייה, שני מיליליטר של מדיום SILAC קל. תרבית התאים לפחות שישה מעברים. לאחר שישה מעברים, שילוב חומצות האמינו הכבדות צריך להיות יותר מ-95%קצור מיליון תאים מאוכלוסיות התאים הכבדות והקלות המסומנות כדי לנתח את יעילות השילוב.

לאחר שטיפת התאים ב- 1X PBS, גלולה אותם בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב -160 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס. השעו מחדש את כדורי התא ב-150 מיקרוליטר של מאגר MS. לאחר מכן, דגרו את התאים על הקרח למשך 30 דקות.

לאחר מכן, ליזה את התאים על ידי סוניקציה בארבע מעלות צלזיוס. הסר את פסולת התאים על ידי צנטריפוגה למשך 10 דקות בטמפרטורה של 11, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס. העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש, וקבעו את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת חלבון תואמת דטרגנטים.

לאחר מכן, מערבבים 75 מיקרוגרם חלבון עם שישה x מאגר דגימה. לאחר רתיחה ב-95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, הפרד את החלבונים על ידי SDS-PAGE במאגר ריצה SDS ב-180 ברגים למשך כשעה. לאחר צביעת Coomassie, הסר את אותה רצועת חלבון ונתח את יעילות השילוב על ידי ניתוח טרשת נפוצה.

הדביקו את אוכלוסיית התאים הקלה בנגיף מדווח הפטיטיס C על ידי דגירה שלהם עם מלאי סיבי למשך ארבע שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הרחב תאים קלים נגועים ב-HCV ותאים כבדים לא נגועים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. אם אתה משתמש בזן HCV הנושא גן עמיד לבלסטיצידין, הוסף 10 מיקרוגרם למיליליטר של בלסטיצידין S למדיום הקל כדי לבחור תאים חיוביים ל-HCV.

יום אחד לפני בידוד טיפות השומנים, שטפו את התאים עם PBS, נסו והשעו מחדש במדיום הקל או הכבד המתאים. ספרו את התאים באמצעות תא ספירה של נויבאואר. לאחר מכן, זרעו שבעה מיליון תאים מכל אוכלוסייה בצלחת תרבית תאים בגודל 150 סנטימטר רבוע.

הכינו לפחות חמש מנות לכל אוכלוסיית תאים קלה וכבדה. תרבית את התאים ב -30 מיליליטר בינוני למנה למשך הלילה. למחרת, הסר את המדיום ושטוף את התאים ב-1X PBS.

נתק את התאים ב- 1X PBS באמצעות מגרד תאים. לאחר ספירת שתי אוכלוסיות התאים כמו קודם, משוך מספרי תאים שווים בצינורות צנטריפוגה של 50 מיליליטר. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה למשך חמש דקות ב -160 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס.

הסר את ה-PBS, והשהה מחדש את כדור התא במיליליטר אחד של מאגר סוכרוז. העבירו את תרחיף התאים להומוגניזטור אונקיה הדוק לפני הליזציה של התאים ב-200 משיכות על קרח. לאחר מכן, העבירו את הליזאט לצינור מיקרופוגה של 1.5 מיליליטר, וסובבו את הגרעינים ואת פסולת התאים למשך 10 דקות בטמפרטורה של 1,000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס.

לאחר הצנטריפוגה, אחסן מינוס של 25 מיקרוליטר של השבר הפוסט-גרעיני, או PNS, במינוס 20 מעלות צלזיוס כבקרת קלט. הנח את שאר שבר ה-PNS בתחתית צינור הצנטריפוגה, וכסה כשלושה מיליליטר של מאגר שטיפת טיפות השומן. צנטריפוגה למשך שעתיים בטמפרטורה של 100, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס.

לאחר הצנטריפוגה, קצרו את שבר טיפת השומן הצף מהחלק העליון של הצינור באמצעות צינורית קהה כפופה. לאחר מכן, הניחו את שבר טיפות השומן בצינור צנטריפוגה, כסו את מאגר שטיפת טיפות השומנים וחזרו על שלב הצנטריפוגה. קצירת טיפות השומן מראש השיפוע דורשת ניסיון.

וקל יותר ככל שהשבר גדול יותר. אתה יכול להשתמש בתאי שומן לתרגול. לחלופין, אתה יכול להזין את התאים שלך באולאט כדי להגדיל את כמות טיפות השומנים.

שוב, קצרו את שבר טיפות השומן הצף באמצעות צינורית קהה כפופה מהחלק העליון של הצינור. העבירו את טיפות השומן לצינור מיקרופוגה חדש של 1.5 מיליליטר, והוסיפו 500 מיקרוליטר של מאגר שטיפת טיפות שומנים. לאחר מכן, סובב את הדגימה למשך 20 דקות בטמפרטורה של 21, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס.

הסר את מאגר הכביסה באמצעות קצה פיפטה לטעינת ג'ל, וחזור על שלב הכביסה שלוש פעמים. לאחר ההסרה הסופית של מאגר הכביסה, מערבבים חמישה מיקרוליטרים של שברי טיפות שומנים עם 10 מיקרוליטר של מאגר ליזה NP 40 לקביעת תכולת החלבון. דגרו את הדגימה על קרח למשך שעה כדי לנטרל את הנגיף אם עובדים עם חומר זיהומי.

בשלב זה, ניתן לאחסן את שברי טיפות השומנים במינוס 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, מערבבים את הנפח המתאים לפחות 35 מיקרוגרם חלבון עם צבע טעינה פי 4. דגרו את התערובת על קרח למשך שעה כדי לנטרל את הנגיף אם עובדים עם חומר זיהומי.

מרתיחים את הדגימה בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן, בצע SDS-PAGE ואחריו צביעת Coomassie כדי להכין את הדגימה לזוג כרומטוגרופיה נוזלית לספקטרונומיית מסה טנדם כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי לנתח את טוהר טיפות השומנים, יש לדלל את הכמות של שברי טיפות השומנים, אחד עד שניים, עם מאגר ליזה NP 40.

דילול שברי בקרת קלט אחד עד עשר עם אותו מאגר. דגרו את הדגימות על קרח למשך שעה כדי לנטרל את הנגיף אם עובדים עם חומר זיהומי. לאחר מכן, קבע את רמת החלבון באמצעות בדיקת חלבון תואמת חומר ניקוי.

לאחר מכן, ערבבו כמות שווה של חלבון עם מאגר דגימה פי 6, ודגרו את הדגימות על קרח למשך שעה אחת כדי לנטרל את הנגיף אם עובדים עם חומר זיהומי. לבסוף, המשך עם SDS-PAGE, והעביר את החלבונים לקרום ניטרוצלולוזה על ידי ספיגת מיכל ב-80 וולט למשך 90 דקות. מוצג כאן ניתוח כתם מערבי מייצג של שברי טיפות פוסט-גרעיניות ושומנים.

הכתם המערבי מראה בבירור העשרה שחלבוני סמן טיפות השומן פריליפין שתיים ופריליפין שלוש בשברי טיפות שומנים, ודלדול סמנים של תאים תאיים אחרים. ניתן לנתח בנוסף שברי טיפות פוסט-גרעיניות ושומנים על ידי צביעה כחולה וכסף של Coomassie. מפת חום זו ממחישה את מספר הפפטידים ואחוז כיסוי החלבון של חלבונים שזוהו בשברי טיפות שומן של התאים המנותחים.

מפת החום הסופית מתארת כיצד זיהום HCV משנה את טיפת השומנים ליום. חלבונים הקשורים לטיפות שומן מועשרים מסומנים באדום, וחלבונים הקשורים לטיפות שומן מדוללים מסומנים בכחול. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שאנו מערבבים את התאים לפני הבידוד ובידוד טיפות השומן הקודם, וכך אנו יכולים למזער טעויות שעלולות להתרחש במהלך ליזיס התאים ובמהלך שלבי הבידוד.