Name: באמצעות טכניקה גל אלקטרופורזה פלורסנט PCR-נימי הגנוטיפ קריספר / Cas9 בתיווך נוק מוטאנטים בתוך פורמט תפוקה גבוהה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: למד טכניקת גנוטיפינג לזיהוי מוטנטי CRISPR/Cas9 באמצעות PCR פלואורסצנטי ואלקטרופורזת ג'ל קפילרית. שיטה זו מאפשרת סקרינג בקיבולת גבוהה לחקר גנטיקה וסרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לגב &#39;טאן שי מינימום, הגב&#39; הלן אונג, וד&quot;ר זאו יי שעזר עם ניסויי ג&#39;ל אלקטרופורזה נימים. עבודה זו נתמכה על ידי NMRC / IRG להעניק NMRC / 1314/2011 ו מענק קרן Tier 2 משרד החינוך AcRF MOE2011-T2-1-051.

<ol><li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2Fcas9%2C+a+novel+genomic+tool+to+knock+down+microRNA+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">CRISPR/cas9, a novel genomic tool to knock down microRNA in vitro and in vivo.</a> Sci. Rep. 6, 22312(2016).</li>
<li>O'Connell, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+RNA+recognition+and+cleavage+by+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9.</a> Nature. 516, 263-266 (2014).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154, 1380-1389 (2013).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24157548">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Perez, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+HIV-1+resistance+in+CD4%2B+T+cells+by+genome+editing+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Establishment of HIV-1 resistance in CD4+ T cells by genome editing using zinc-finger nucleases.</a> Nat. Biotechnol. 26, 808-816 (2008).</li>
<li>Santiago, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+knockout+in+mammalian+cells+by+using+engineered+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases.</a> P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5809-5814 (2008).</li>
<li>Sung, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockout+mice+created+by+TALEN-mediated+gene+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting.</a> Nat. Biotechnol. 31, 23-24 (2013).</li>
<li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343, 84-87 (2014).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+of+a+CRISPR%2FCas9+library+for+functional+genomics+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells.</a> Nature. 509, 487-491 (2014).</li>
<li>Guschin, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+general+assay+for+monitoring+endogenous+gene+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification.</a> Methods Mol. Biol. 649, 247-256 (2010).</li>
<li>Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+editing+in+human+cells+with+zinc+finger+nucleases+constructed+via+modular+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly.</a> Genome Res. 19, 1279-1288 (2009).</li>
<li>Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+genotyping+of+CRISPR%2FCas9-mediated+mutants+using+fluorescent+PCR-capillary+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis.</a> Sci. Rep. 5, 15587(2015).</li>
<li>Liu, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Responses+of+Stem+Cells+to+Telomere+Uncapping-A+Potential+Strategy+to+Improve+the+Safety+of+Cell+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Distinct Responses of Stem Cells to Telomere Uncapping-A Potential Strategy to Improve the Safety of Cell Therapy.</a> Stem cells. 34, 2471-2484 (2016).</li>
<li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+highly+active+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation.</a> Nat. Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+essential+genes+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of essential genes in the human genome.</a> Science. 350, 1096-1101 (2015).</li>
<li>Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+vectors+and+genome-wide+libraries+for+CRISPR+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.</a> Nat. Methods. 11, 783-784 (2014).</li>
<li>Urnov, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+endogenous+human+gene+correction+using+designed+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases.</a> Nature. 435, 646-651 (2005).</li>
<li>Kim, H., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+genome+engineering+with+programmable+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">A guide to genome engineering with programmable nucleases.</a> Nat. Rev. Genet. 15, 321-334 (2014).</li>
<li>Dahlem, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+methods+for+generating+and+detecting+locus-specific+mutations+induced+with+TALENs+in+the+zebrafish+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome.</a> PLoS Genet. 8, e1002861(2012).</li>
<li>Thomas, H. R., Percival, S. M., Yoder, B. K., Parant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+genome+editing+and+phenotyping+facilitated+by+high+resolution+melting+curve+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-throughput genome editing and phenotyping facilitated by high resolution melting curve analysis.</a> PLoS One. 9, 114632(2014).</li>
<li>Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotyping+with+CRISPR-Cas-derived+RNA-guided+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases.</a> Nat. Commun. 5, 3157(2014).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

הדפיקות מתוך גן ספציפי בקו תא מודל של בחירה הפכו לשגרת הבהרת התפקיד כי הגן מתנגן כי בהקשר הסלולר בפרט. למעשה, מספר מסכי הגנום זמינים כרגע המשתמשים במערכת קריספר / Cas9 למקד כמעט כל גנים אנושיים הידועים בגנום 14, 15, 16. עם מסכים גדולים בקנה מידה אלה (או אפילו בקנה מידה קטן מיקוד של גנים פרטיים בעלי עניין), חשוב לתכנן ולנצל sgRNAs מיקוד לוקוסים שונים של אותו גן. תוצאות עקביות ברחבי sgRNAs ...

גישות גנטיות הפוכות אפשרו למדענים להבהיר את ההשפעות של שינויים ספציפיים בגנום על התא או אורגניזם שלם. לדוגמא, הביטוי של גן מסוים יכול להיות נחלש ידי גן מציאת 1, 2 (הפחתה חלקית) או נוקאאוט גנטי 3, 4 (אבלציה שלם) כדי לקבוע את ההשפעה שיש לכך על הפונקציה של התא או על התפתחות האורגניזם. ג&#39;ין ניסויים בנוקאאוט הפכו קלים יותר מאז כניסתה של nucleases לתכנות ספציפי ברצף, כגון nucleases אצבע אבץ (ZFNs) ו nucleases מפעיל דמוי מפעיל שעתוק (TALENs). עם זאת, האפיון היחסי האחרון של התקבץ וביניהם חוזר palindromic קצר בקביעות (קריספר) / מערכת Cas9 עשה את זה קל מאוד עבור כל מעבדה ברחבי העולם לבצע genניסויים בנוקאאוט דואר. בעיקרו של דבר, המערכת קריספר / Cas9 מורכב משני רכיבים-A חיוני RNA מדריך יחיד (sgRNA), אשר מכיר נקשר באמצעות השלמה הבסיס רצף מסוים בגנום, וכן endonuclease שנקרא Cas9. מה שבא אחרי מחייב פעולה מסוימת של מורכבות sgRNA-Cas9 על הדנ&quot;א הגנומי הוא מחשוף פעמיים גדיל של דנ&quot;א. זה, בתורו, מפעיל את מנגנון תגובת ניזק DNA בתא, אשר תוקן לאחר מכן באמצעות הצטרפותו קצה שאינם הומולוגיים (NHEJ) או הומולוגי המסלולים (HR). היות ומנגנון תיקון NHEJ (אבל לא את מנגנון HR) לעתים קרובות תוצאות ההחדרה האקראית או המחיקה של נוקלאוטידים באתר של תיקון, וכתוצאה מכך מוטציות החדרה / מחיקה (indel), הוא עלול לגרום מסגרת הקריאה של אקסון להעביר. מצב זה יכול לגרום נוק אאוט של הגן עקב סיום מוקדם של התרגום וריקבון בתיווך שטויות 5, 6,7. למרות הנוחות המוענקת על ידי כניסתה של מערכת קריספר / Cas9 ב שחסל גן, גנוטיפ של שיבוטים של תאים ממוקדים נותר צוואר בקבוק, במיוחד תפוקה גבוהה הגדרה 8, 9. טכניקות קיימות או סובלות מגבלות מובנות גדולות או הם יקרים כלכליים. לדוגמה, assay שמאי T7E1, המהווה assay האנזימטית שמזהה חוסר התאמה ב- DNA דופלקסים 10, הוא לא מסוגל להבחין בין שיבוטים wildtype מוטנטים הומוזיגוטים (שיבוטים אשר אללים הם מוטציה זהה), שכן יש שיבוטים אלה אללים זהים ובכך לא מציג חוסר התאמה ב- DNA הרצף שלהם 11. בנוסף, שימוש רצף סנגר, הנחשב את תקן זהב genotyping שיבוטי מוטציה, או בהתקנת תפוקה גבוהה אינו רצוי בשל עלותו הגבוהה. כאן, אנו מציגים Detפרוטוקול שמציק של טכניקת אלקטרופורזה PCR-נימי ג&#39;ל ניאון, אשר יכולה לעקוף את המגבלות של הטכניקות גנוטיפ קיימות האחרות, והוא שימושי במיוחד בביצוע מסך תפוקה גבוהה של שיבוטים בנוקאאוט בתיווך nuclease. שיטה זו היא טכנית פשוטה לביצוע, חוסך זמן ועלות.

<table><tbody><tr><td>תאי HEPG2</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>pSpCas9(BB)-2A-GFP פלסמיד</td><td>Addgene</td><td>PX458</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>11668027</tr><tr><td>טריפסין-EDTA (0.25%), פנול אדום</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.5%), ללא פנול אדום</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Water, ביולוגיה מולקולרית דרגה</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30538.02</td><td></td></tr><tr><td>CRISPR sgRNA הכנס אוליגונוקלאוטיד (חוש)</td><td>AITbiotech</td><td>ללא</td><td>רצף: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3'CRISPR</td></tr> <tr><td>sgRNA הכנס אוליגונוקלאוטיד (אנטי-סנס)</td><td>AITbiotech</td><td>ללא</td><td>רצף: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGTAGC-3'פריימר</td></tr> <tr><td>הגברת PCR ללא תווית</td><td>AITbiotech</td><td>אין</td><td>רצף: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; פריימר זה משמש גם לרצף אללים מוגברים של PCR</td></tr><tr><td>פריימר 6-FAM פלואורסצנטי PCR קדימה</td><td>AITbiotech</td><td>ללא</td><td>רצף: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCTCAGTTTC-3'HEX</td></tr> עם <tr><td>תווית פריימר PCR פלואורסצנטי קדימה</td><td>AITbiotech</td><td>ללא</td><td>רצף: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'פריימר</td></tr> <tr><td>הפוך PCR ללא תווית</td><td>AITbiotech</td><td>אין</td><td>רצף: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3'Taq</td></tr> <tr><td>PCR Core Kit</td><td>QIAGEN</td><td>201223</td><td></td></tr><tr><td>Hi-Di Formamide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4311320</td><td></td></tr><tr><td>GeneScan 500 LIZ גודל צבע סטנדרטי</td><td>תרמו פישר</td><td>4322682</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו אמפר אופטי 96-באר צלחת תגובה</td><td>תרמו פישר 4306737</td><td></td><td></td>מדעי</tr><tr><td>3500xL גנטי מנתח</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4405633</td><td></td></tr><tr><td>3500 סדרה 2 תוכנית</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4476988</td><td></td></tr><tr><td>Gene Mapper 5 תוכנית</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4475073</td><td></td></tr><tr><td>Gentra Puregene Cell Kit</td><td>QIAGEN</td><td>1045696</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV ג'ל ומערכת ניקוי PCR</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>NAP1L1 נוגדן ( N-term)</td> <td>Abgent</td><td>AP1920b</td><td></td></tr><tr><td>חלבון מטריקס גרעיני p84 נוגדן [5E10]</td> <td>GeneTex</td><td>GTX70220</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-035-144</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>515-035-003</td><td></td></tr></tbody></table>

באמצעות טכניקה ג&#39;ל אלקטרופורזה פלורסנט pcr-נימי הגנוטיפ קריספר / cas9 בתיווך נוק מוטאנטים בתוך פורמט תפוקה גבוהה

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

פיתוחם של כלים הגנום עריכה לתכנות יש להקל את השימוש של גנטיקה הפוכה כדי להבין את תפקידי רצפים גנומיים ספציפיים לשחק בתפקוד של תאים ואורגניזמים כולו. הגורם הזה כבר סייע מאוד על ידי הקדמה האחרונה של קריספר / מערכת-a Cas9 כלי תכליתי המאפשר לחוקרים כדי לתפעל את הגנום transcriptome כדי, בין שאר, לדפוק, להפיל, או לדפוק בגנים בתוך ממוקד דֶרֶך. לצורך לדפוק גן, קריספר / Cas9 בתיווך הפסקות פעמי גדיל לגייס את מסלול תיקון DNA שאינו הומולוגי שהצטרף-סוף להציג החדרה או מחיקת frameshift-גרימת נוקלאוטידים באתר ההפסקה. עם זאת, RNA מדריך פרט עלול לגרום תופעות מחוץ היעד רצויים, ועל מנת לשלול אלה, שימוש RNAs מדריך המרובה הכרחי. ריבוי זה של מטרות גם אומר הקרנה בנפח גבוה של שיבוטים נדרש, אשר בתורו מעלה את השימוש EFficient טכניקת תפוקה גבוהה כדי גנוטיפ השיבוטים בנוקאאוט. טכניקות גנוטיפ נוכחיות או סובלות מגבלות מובנות או לגרום לעלות גבוהה, ולכן טיווחו אותם מתאימים למטרות תפוקה גבוהה. כאן, פרט לנו את הפרוטוקול לשימוש פלורסנט PCR, אשר משתמש DNA הגנומי של תא lysate הגולמי כתבנית, ולאחר מכן לפתור את שברי PCR באמצעות ג&#39;ל אלקטרופורזה נימים. טכניקה זו היא מדויקת מספיק כדי לבדל הבדל בסיס-זוג אחד בין שבר ולכן היא מתאימה המעידה על הנוכחות או היעדר frameshift ברצף הקידוד של הגנים הממוקדים. ידיעה מדויקת זה מונע את הצורך ביעילות צעד רצף מאשר ומאפשרת למשתמשים לחסוך זמן ועלויות בתהליך. יתר על כן, טכניקה זו הוכיחה להיות תכליתי genotyping בתאי יונקים שונים של מקורות רקמות שונים הממוקדים ידי RNAs מדריך נגד גנים רבים, כפי שמוצג כאן ובמקומות אחרים.

ניאון טכניקת ג&#39;ל אלקטרופורזה PCR-נימים המתוארות כאן צפויה לחול בכל אזור ניתן למיקוד בגנום כמעט בכל קו תא ניתן למסירת דנ&quot;א זרה. הוכחנו היישום שלה בעבר על ידי מיקוד שלושה גנים בקו תא סרטן מעי גס 12. הנה, אנחנו מראים את יעילותו genotyping שורת תאי קרצינומה hepatocellular, HEPG2, ממוקדת עם קריספר / Cas9 לבנות כנגד חלבון הנוקלאוזום עצרת 1 כמו 1 (NAP1L1) גן. למעשה, יש לנו בהצלחה ניצלו את הטכניקה ג&#39;ל אלקטרופורזה PCR-ני...

טכניקת גנוטיפ המתוארת כאן, אשר זוגות תגובת השרשרת של פולימראז פלורסנט (PCR) כדי נימי ג&#39;ל אלקטרופורזה, מאפשרת גנוטיפ תפוקה גבוהה של שיבוטים בנוקאאוט בתיווך nuclease. זה עוקף מגבלות בפני טכניקות גנוטיפ אחרות הוא יותר חסכוני מאשר שיטות סידור.

באמצעות טכניקה ג&#39;ל אלקטרופורזה פלורסנט PCR-נימי הגנוטיפ קריספר / Cas9 בתיווך נוק מוטאנטים בתוך פורמט תפוקה גבוהה

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

המטרה הכוללת של טכניקה זו היא ביצוע גנוטיפינג של שיבוטים מוטנטיים עם מחיקות והחדרות שנוצרו על ידי CRISPR/Cas9 באופן בעל תפוקה גבוהה. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הגנטיקה, כגון ההשפעה הפנוטיפית של השבתה (knock-out) של גן מסוים במודל SAIL נבחר. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היכולת לבצע סריקה ברמת תפוקה נמוכה עד גבוהה שהיא רב-גמישה.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי גנטיקה של סרטן בבני אדם, ניתן להחילה אותה גם על מערכות אחרות, כגון תאי אדם, תאי גזע, תאים ראשוניים או תאים ממקור שאינו אנושי. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר ביצענו בדיקות טיפוס של חזרות טנדם קצרות (STR typing assays). כדי להתחיל את הפרוצדורה, בצעו טרנספקציה לתאים שנבחרו עם פלסמיד, המבטא יחד סימון פלואורסצנטי, Cas9 ו-single guide RNA.בצעו טריפסינזציה לתאים ובחרו כ-3,500 שיבוטים המסומנים פלואורסצנטית. פזרו את השיבוטים בחלקים של 500, 1,000 ו-2,000 תאים בצלחות בעלות קוטר של 10 סנטימטר, ב-8 מיליליטר של מצע גידול המועשר ב-penicillin streptomycin. דגרו את התאים באטמוספירה של 5% CO2 בטמפרטורה של 37 degrees celsius, והחליפו את המצע בכל חמישה ימים עד להופעת מושבות של תאים בודדים הנראות לעין.לאחר מכן, שאיאו מושבות בודדות באמצעות פפטה של 200 microliter עם כ-5 microliter של מצע גידול. העבירו כל מושבה לבאר נפרדת המכילה 200 microliter של מצע גידול. בצעו פפיתה חוזרת של כל תערובת למעלה ולמטה כדי לתלות מחדש את התאים.דגרו את התאים בתנאים שתיארו קודם לכן עד שהתאים יגיעו ל-50 עד 90% confluence. הסירו את עודפי מצע התרבית מהבארים, והוסיפו 25 µL של 0.05% trypsin EDTA ללא phenol red לכל באר. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך 7 דקות.לאחר מכן, בצעו פיפטינג חוזר של התערובות כדי להחזיר למצב תליה (resuspend) את התאים שעברו טריפסינזציה. בחנו את הבארים תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים ניתקו מדפנות הבאר. להכנת שכמיות של הכלונים הבודדים, העבירו 5 µL מכל תליה של תאים לפלטת תרבית ריקה בעלת 96 בארים.הוסיפו 200 µL של מצע גידול לכל באר. לאחר מכן, מלאו את הבארה של פלטת PCR ריקה בעלת 96 בארות ב-10 µL של בופר ליזיס (lysis buffer). העבירו 5 µL נוספים מכל תרחיף תאים לפלטה זו בעלת 96 הבארות.סובב את הפלטה בצנטריפוגה למשך זמן קצר עד שהנוזל ישקע לתחתית הבארים. הוסף 200 microliters של מצע גידול ל-15 microliters הנותרים של כל תרחיף תאים. אחסן את התרחיף המקורי ואת החזרות תחת תנאי ההדגרה לצורך אימות מאוחר יותר של סטטוס ה-knockout של השיבובים.לאחר מכן, השתמש במחזוריות תרמית כדי ללוות את התאים באופן מלא במאפה ליזיס. סבב את התמניות בצנטריפוגה לזמן קצר. דלל את התמניות עם 40 µL של מים נקיים מנוקלאז.ערבבו במערבל Vortex וסבבו בנפקוד (centrifuge) לזמן קצר את הליזאטים המדוללים. לפני ביצוע PCR פלואורסצנטי, תכננו ובחנו את הספציפיות של מספר זוגות של פריימרים לא מסומנים על תאים של טיפוס פרוע (wild-type) שעברו ליזה. זהו את זוג הפריימרים האופטימלי והשיגו את הפריימרים הקדמיים המסומנים פלואורופור ואת הפריימר האחורי שאינו מסומן.יש לוודא את סגוליות הפריימרים באמצעות תאי vortex, ולבצע ליסיס באמצעות תמיסת הליסיס שהוכנה במעבדה, שכן התוצאות עשויות להשתנות בהשוואה לשימוש ב-DNA גנומי מטוהר. באמצעות הפריימרים המסומנים, בצע תגובות PCR פלואורסצנטיות בנפח של 20 µL עם שלושה µL של הליזאטים המדוללים כדי להגביר את אזורי המטרה. העריך את הגודל והכמויות היחסיות של תוצרי ה-PCR על ידי הרצת חמישה µL מהתוצרים על ג'ל אגרוז בריכוז של 1%.כדי להתחיל בהכנת הדגימות, השתמש במים נקיים מנוקלאז כדי לדלל אמפליקונים של DNA מסוג בר (wild-type) ושל DNA שעבר עריכה באמצעות CRISPR/Cas9 לריכוז מקורב של 2.5 nanograms per microliter. ערבב נפחים שווים של דגימות ה-DNA המדולל מסוג בר והדגימות שעברו עריכה. טען את הבארות של פלטת PCR בעלת 96 בארות עם תשעה microliters של תערובת ביחס של 29 ל-1 של פורממיד דה-יוני וסולם גודל מסומן בצבע, ומיקרוליטר אחד של האמפליקונים המעורבבים.אטמו את הפלטה היטב וחממו את הדגימות בטמפרטורה של 95 °C למשך שלוש דקות באמצעות תרמוסייקלר ל-PCR. מיד לאחר החימום, קררו את הפלטה על קרח למשך שלוש דקות. בצעו אלקטרופורזה של ג'ל קפילרי באמצעות מנתח גנטי.לאחר השלמת האלקטרופורזה, ייבאו את הנתונים לתוכנת הניתוח והוציאו אותם כגרף. ודאו את איכות סטנדרט הגודל על ידי סקירת הנתונים בערוץ הצבע המתאים. לאחר מכן, ייצאו את ערכי ערוץ הצבע עבור בקרי הפרא (wild-type) שאינם מטargeted ועבור השיכלו닝ים (clones) המטargeted בפורמט txt.מתוך קובץ זה, ייבא את זהות הצבעים, שמות קובצי הדגימות, גדלי הפגרמנטים וערכי גובה השיאים לתוכנת גיליונות אלקטרוניים. חשב את ההפרש בגודל הפגרמנט בין השיבון המטרה לבין בקרת סוג הפרא (wild type) שאינה מטרה בכל דגימה. זהה את השיבונים עם מוטציות indel שאינן כפולות של שלושה זוגות בסיסים.בצעו הרחבה סדרתית של השיבוטים שנבחרו מהשכפולים המאוחסנים. בצעו ריצוף סנגר (Sanger sequencing) ואנליזת Western blot כדי לקבוע את הגנוטיפים של השיבוטים ולאמת את מצב הנוק-אאוט (knockout) של השיבוטים. קו התאים של קרצינומה התאית של הכבד HEPG2 סומן באמצעות מבנה CRISPR/Cas9 נגד הגן Nap1L1.האללים של סוג הבר (wild-type) שאינם ממוקדים והאללים הממוקדים באמצעות CRISPR/Cas9 הועתקו ב-PCR באמצעות פריימרים המסומנים בפלואורופורים ירוקים וכחולים, בהתאמה. על ידי שימוש בפרוטוקול PCR פלואורסצנטי שעבר אופטימיזציה ספציפית, התקבלו האמפליקונים של השיבוטים הממוקדים בניב גבוה. לא נצפתה הפרעה בין הצבעים הפלואורסצנטיים הירוק והכחול בתוך דגימות של שיבוטים בודדים.ניתוח גדלי הפסגמנטים, שנקבע באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל נימי, חשף מחיקה של בסיס אחד ו-10 בסיסים משני השיבוטים המוצגים כאן. תוצאות ריצוף סנגר היו תואמות לניתוח האלקטרופורזה של הג'ל הנימי. ניתוח Western blot אישר כי השיבוטים שנבחרו לא הביעו NAP1L1.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לסמן את הדגימות בקפידה, מכיוון שמעורבים דגימות רבות, וכן למזער את זמן החשיפה של האמפליקונים המסומנים בפלואורופור, שכן הם רגישים לאור. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו quantitative RT PCR, אנליזת Western blot וריצוף סנגר (Sanger sequencing), כדי לענות על שאלות נוספות, כגון האם הגנים המדוברים הושביתו לחלוטין. לאחר צפייה בסרטון זה, אמירה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבצע גנוטיפ של שיבוטים מוטנטיים שהשריו CRISPR/Cas9 באופן בעל תפוקה גבוהה, באמצעות PCR פלואורסצנטי המשולב עם אלקטרופורזה של ג'ל קפילרי.

using-fluorescent-pcr-capillary-gel-electrophoresis-technique-to

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

CRISPR/Cas9 היא מערכת חזקה ליצירת שיבוש של גנים ואלמנטים גנטיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול ליצירה יעילה של מחיקות גנומיות בשורות תאים של יונקים באמצעות CRISPR/Cas9.

דור של מחיקות הגנומי בשורות תאים יונקים באמצעות CRISPR / Cas9

ההתקדמות האחרונות ביכולת לתמרן גנטית קווי תאים סומטיים להחזיק פוטנציאל גדול עבור מחקר בסיסי ויישומי. כאן, אנו מציגים שתי גישות עבור CRISPR / Cas9 שנוצר נוקאאוט הייצור והקרנה שורות תאים יונקים, עם וללא שימוש סמנים לבחירה.

הבחירה תלויה עצמאית הדור של CRISPR / Cas9 בתיווך גין Knockouts בתאי יונקים

הגנום יישוב עריכה במערכת מודל רזבורה rerio (דג זברה) כבר באופן משמעותי בהנחייתם של הופעתה של גישות CRISPR. במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול יעילים, חזקים הדור, זיהוי של אללים נגזר CRISPR שטויות המשלבת וזמינותו ניידות heteroduplex וזיהוי מוטציות באמצעות הדור הבא רצפי.

ייצור יעיל והסתרות שנוצרו על-ידי זיהוי של CRISPR/Cas9 ג'ין, מערכת מודל רזבורה rerio

עבור פרוטוקול מהיר CRISPR/Cas9-מתווכת ' שיבוש גנטי עכבר, התאים hematopoietic העיקרי של האדם מתואר במאמר זה. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins הם הציגו ויה אלקטרופורציה עם sgRNAs שנוצר דרך במבחנה שעתוק ו Cas9 מסחרי. יעילות העריכה גבוהה מושגות עם זמן מוגבל ועלות פיננסיים.

שיבוש גנטי יעילים ביותר מאתר ואנושי Hematopoietic ובתאים מאת CRISPR/Cas9

כאן, אנו מציגים שיטה להנדס את הגנום של C. elegans שימוש CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins ותבניות תיקון התלויים הומולוגיה.

מהירה עם צינור נתיישב עבור יצירת מוטציות נקודה גנומית ב- C. elegans באמצעות CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR-Cas9 הטכנולוגיה מספקת שיטה יעילה בדיוק לערוך את הגנום היונקים בסוג תא כלשהו ומייצג את האמצעים הרומן לבצע מסכי גנטי רחב הגנום. פרוטוקול מפורט לדון בצעדים הנדרשים עבור ביצועים מוצלחים של מסכי CRISPR-Cas9 הגנום הרחב מסופק כאן.

מסכי גנטי מבוססי CRISPR במאגר תאים ממיונקים

מסירה ישירה של טרום התאספו Cas9/מדריך RNA ribonuאופאנפרוטאין מתחמי הוא אמצעי מהיר ויעיל לעריכת הגנום בתאי המטפאות. כאן, אנו מנצלים את הגישה הזאת כדי למחוק משתיק RUNX1 ביטרוניק ולבחון את התגובות הטרנדיות בתאי OCI-AML3 לוקמיה.

חקירת התפקיד הטרנססאני של משתיק הRUNX1 נית על ידי CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein בתאי לוקמיה מיאלואיד חריפה

כתב יד זה מתאר גישה מבוססת הגנום בקנה מידה מבוססי לזהות קולטן מסחטות-ליגניות ואינטראקציות.

זיהוי של פני שטח התא באמצעות הגנום בקנה מידה CRISPR/Cas9 מסכים גנטיים

פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה של עריכת גנים של גנים חוזרים פלינדרומיים קצרים (CRISPR) בתפוקה גבוהה, המקובצים באופן קבוע, עבור ניתוח רשת של אשכולות מיקרו-רנ"א, המאפשרת ייצור מהיר של פאנל של קווי תאים מהונדסים גנטית הנושאים שילובי מחיקה ייחודיים של חברי אשכול miRNA בגודל של עד 35 קילו-בתים בתוך ניסוי יחיד.

כלי עריכת גנים CRISPR לניתוח רשת אשכולות מיקרו-רנ"א

טכנולוגיות CRISPR-Cas חוללו מהפכה בתחום עריכת הגנום. עם זאת, מציאת ובידוד עריכת קו הנבט הרצויה נותרה צוואר בקבוק משמעותי. לכן, פרוטוקול זה מתאר שיטה חזקה לסינון מהיר של זרע דג זברה מוזרק F0 CRISPR לעריכות קו הנבט באמצעות טכניקות PCR סטנדרטיות, תקציר הגבלה ואלקטרופורזה בג'ל.

בדיקת זרע לבידוד מהיר של עריכות נבט בדגי זברה

כאן, אנו מתארים פרוטוקול ליצירת מוטציה אימהית המצמיד קו נוק-אין יציב של zpc:cas9 עם מסירה בתיווך Tol2 של קלטות ביטוי sgRNA.

דור של מוטציות אימהיות באמצעות zpc:cas9 Knock-in Zebrafish

למד טכניקת גנוטיפינג לזיהוי מוטנטי CRISPR/Cas9 באמצעות PCR פלואורסצנטי ואלקטרופורזת ג'ל קפילרית. שיטה זו מאפשרת סקרינג בקיבולת גבוהה לחקר גנטיקה וסרטן.

באמצעות טכניקה ג'ל אלקטרופורזה פלורסנט PCR-נימי הגנוטיפ קריספר / Cas9 בתיווך נוק מוטאנטים בתוך פורמט תפוקה גבוהה

גלה סרטונים נוספים