באמצעות טכניקה ג'ל אלקטרופורזה פלורסנט PCR-נימי הגנוטיפ קריספר / Cas9 בתיווך נוק מוטאנטים בתוך פורמט תפוקה גבוהה

המטרה הכוללת של טכניקה זו היא ביצוע גנוטיפינג של שיבוטים מוטנטיים עם מחיקות והחדרות שנוצרו על ידי CRISPR/Cas9 באופן בעל תפוקה גבוהה. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הגנטיקה, כגון ההשפעה הפנוטיפית של השבתה (knock-out) של גן מסוים במודל SAIL נבחר. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היכולת לבצע סריקה ברמת תפוקה נמוכה עד גבוהה שהיא רב-גמישה.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי גנטיקה של סרטן בבני אדם, ניתן להחילה אותה גם על מערכות אחרות, כגון תאי אדם, תאי גזע, תאים ראשוניים או תאים ממקור שאינו אנושי. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר ביצענו בדיקות טיפוס של חזרות טנדם קצרות (STR typing assays). כדי להתחיל את הפרוצדורה, בצעו טרנספקציה לתאים שנבחרו עם פלסמיד, המבטא יחד סימון פלואורסצנטי, Cas9 ו-single guide RNA.

בצעו טריפסינזציה לתאים ובחרו כ-3,500 שיבוטים המסומנים פלואורסצנטית. פזרו את השיבוטים בחלקים של 500, 1,000 ו-2,000 תאים בצלחות בעלות קוטר של 10 סנטימטר, ב-8 מיליליטר של מצע גידול המועשר ב-penicillin streptomycin. דגרו את התאים באטמוספירה של 5% CO2 בטמפרטורה של 37 degrees celsius, והחליפו את המצע בכל חמישה ימים עד להופעת מושבות של תאים בודדים הנראות לעין.

לאחר מכן, שאיאו מושבות בודדות באמצעות פפטה של 200 microliter עם כ-5 microliter של מצע גידול. העבירו כל מושבה לבאר נפרדת המכילה 200 microliter של מצע גידול. בצעו פפיתה חוזרת של כל תערובת למעלה ולמטה כדי לתלות מחדש את התאים.

דגרו את התאים בתנאים שתיארו קודם לכן עד שהתאים יגיעו ל-50 עד 90% confluence. הסירו את עודפי מצע התרבית מהבארים, והוסיפו 25 µL של 0.05% trypsin EDTA ללא phenol red לכל באר. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך 7 דקות.

לאחר מכן, בצעו פיפטינג חוזר של התערובות כדי להחזיר למצב תליה (resuspend) את התאים שעברו טריפסינזציה. בחנו את הבארים תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים ניתקו מדפנות הבאר. להכנת שכמיות של הכלונים הבודדים, העבירו 5 µL מכל תליה של תאים לפלטת תרבית ריקה בעלת 96 בארים.

הוסיפו 200 µL של מצע גידול לכל באר. לאחר מכן, מלאו את הבארה של פלטת PCR ריקה בעלת 96 בארות ב-10 µL של בופר ליזיס (lysis buffer). העבירו 5 µL נוספים מכל תרחיף תאים לפלטה זו בעלת 96 הבארות.

סובב את הפלטה בצנטריפוגה למשך זמן קצר עד שהנוזל ישקע לתחתית הבארים. הוסף 200 microliters של מצע גידול ל-15 microliters הנותרים של כל תרחיף תאים. אחסן את התרחיף המקורי ואת החזרות תחת תנאי ההדגרה לצורך אימות מאוחר יותר של סטטוס ה-knockout של השיבובים.

לאחר מכן, השתמש במחזוריות תרמית כדי ללוות את התאים באופן מלא במאפה ליזיס. סבב את התמניות בצנטריפוגה לזמן קצר. דלל את התמניות עם 40 µL של מים נקיים מנוקלאז.

ערבבו במערבל Vortex וסבבו בנפקוד (centrifuge) לזמן קצר את הליזאטים המדוללים. לפני ביצוע PCR פלואורסצנטי, תכננו ובחנו את הספציפיות של מספר זוגות של פריימרים לא מסומנים על תאים של טיפוס פרוע (wild-type) שעברו ליזה. זהו את זוג הפריימרים האופטימלי והשיגו את הפריימרים הקדמיים המסומנים פלואורופור ואת הפריימר האחורי שאינו מסומן.

יש לוודא את סגוליות הפריימרים באמצעות תאי vortex, ולבצע ליסיס באמצעות תמיסת הליסיס שהוכנה במעבדה, שכן התוצאות עשויות להשתנות בהשוואה לשימוש ב-DNA גנומי מטוהר. באמצעות הפריימרים המסומנים, בצע תגובות PCR פלואורסצנטיות בנפח של 20 µL עם שלושה µL של הליזאטים המדוללים כדי להגביר את אזורי המטרה. העריך את הגודל והכמויות היחסיות של תוצרי ה-PCR על ידי הרצת חמישה µL מהתוצרים על ג'ל אגרוז בריכוז של 1%.

כדי להתחיל בהכנת הדגימות, השתמש במים נקיים מנוקלאז כדי לדלל אמפליקונים של DNA מסוג בר (wild-type) ושל DNA שעבר עריכה באמצעות CRISPR/Cas9 לריכוז מקורב של 2.5 nanograms per microliter. ערבב נפחים שווים של דגימות ה-DNA המדולל מסוג בר והדגימות שעברו עריכה. טען את הבארות של פלטת PCR בעלת 96 בארות עם תשעה microliters של תערובת ביחס של 29 ל-1 של פורממיד דה-יוני וסולם גודל מסומן בצבע, ומיקרוליטר אחד של האמפליקונים המעורבבים.

אטמו את הפלטה היטב וחממו את הדגימות בטמפרטורה של 95 °C למשך שלוש דקות באמצעות תרמוסייקלר ל-PCR. מיד לאחר החימום, קררו את הפלטה על קרח למשך שלוש דקות. בצעו אלקטרופורזה של ג'ל קפילרי באמצעות מנתח גנטי.

לאחר השלמת האלקטרופורזה, ייבאו את הנתונים לתוכנת הניתוח והוציאו אותם כגרף. ודאו את איכות סטנדרט הגודל על ידי סקירת הנתונים בערוץ הצבע המתאים. לאחר מכן, ייצאו את ערכי ערוץ הצבע עבור בקרי הפרא (wild-type) שאינם מטargeted ועבור השיכלו닝ים (clones) המטargeted בפורמט txt.

מתוך קובץ זה, ייבא את זהות הצבעים, שמות קובצי הדגימות, גדלי הפגרמנטים וערכי גובה השיאים לתוכנת גיליונות אלקטרוניים. חשב את ההפרש בגודל הפגרמנט בין השיבון המטרה לבין בקרת סוג הפרא (wild type) שאינה מטרה בכל דגימה. זהה את השיבונים עם מוטציות indel שאינן כפולות של שלושה זוגות בסיסים.

בצעו הרחבה סדרתית של השיבוטים שנבחרו מהשכפולים המאוחסנים. בצעו ריצוף סנגר (Sanger sequencing) ואנליזת Western blot כדי לקבוע את הגנוטיפים של השיבוטים ולאמת את מצב הנוק-אאוט (knockout) של השיבוטים. קו התאים של קרצינומה התאית של הכבד HEPG2 סומן באמצעות מבנה CRISPR/Cas9 נגד הגן Nap1L1.

האללים של סוג הבר (wild-type) שאינם ממוקדים והאללים הממוקדים באמצעות CRISPR/Cas9 הועתקו ב-PCR באמצעות פריימרים המסומנים בפלואורופורים ירוקים וכחולים, בהתאמה. על ידי שימוש בפרוטוקול PCR פלואורסצנטי שעבר אופטימיזציה ספציפית, התקבלו האמפליקונים של השיבוטים הממוקדים בניב גבוה. לא נצפתה הפרעה בין הצבעים הפלואורסצנטיים הירוק והכחול בתוך דגימות של שיבוטים בודדים.

ניתוח גדלי הפסגמנטים, שנקבע באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל נימי, חשף מחיקה של בסיס אחד ו-10 בסיסים משני השיבוטים המוצגים כאן. תוצאות ריצוף סנגר היו תואמות לניתוח האלקטרופורזה של הג'ל הנימי. ניתוח Western blot אישר כי השיבוטים שנבחרו לא הביעו NAP1L1.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לסמן את הדגימות בקפידה, מכיוון שמעורבים דגימות רבות, וכן למזער את זמן החשיפה של האמפליקונים המסומנים בפלואורופור, שכן הם רגישים לאור. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו quantitative RT PCR, אנליזת Western blot וריצוף סנגר (Sanger sequencing), כדי לענות על שאלות נוספות, כגון האם הגנים המדוברים הושביתו לחלוטין. לאחר צפייה בסרטון זה, אמירה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבצע גנוטיפ של שיבוטים מוטנטיים שהשריו CRISPR/Cas9 באופן בעל תפוקה גבוהה, באמצעות PCR פלואורסצנטי המשולב עם אלקטרופורזה של ג'ל קפילרי.