ניתוח אלקטרופיזי של האדם Pluripotent גזע גזע נגזר Cardiomyocytes (hPSC-CMs) באמצעות מערכים אלקטרודה רב (MEAs)
12 במאי 2017
אפיון אלקטרופיזיולוגי של cardiomyocytes הנגזר האדם בתאי גזע Pluripotent (hPSC-CMs) הוא קריטי עבור מודלים של מחלות לב ולקביעת תגובות סמים. פרוטוקול זה מספק את המידע הדרוש כדי לנתק צלחת hPSC-CMs על מערכים אלקטרודה רב, למדוד את פוטנציאל השדה שלהם, וכן שיטה לניתוח QT ו RR מרווחי.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לנתק קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ולפלוט אותם על מערכי מרובי אלקטרודות כדי למדוד ולכמת את משך ותדירות האות החשמלי האופייני שלהם הנקרא גם פוטנציאל שדה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום, כגון מהם ההבדלים האלקטרופיזיולוגיים בין קרדיומיוציטים הנושאים מוטציות ובקרות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת בדיקת תרופות על קרדיומיוציטים אנושיים שמקורם בתאי חולים.
הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית. מכיוון ששלבי הדיסוציאציה והציפוי חיוניים להקלטת אותות חשמליים מוצלחת. בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שזיהוי אותות חשמליים באיכות טובה או גרועה אינו טריוויאלי וניתוח הפוטנציאל החופשי דורש ניסיון.
כדי להתחיל בהליך זה, הניחו את הצ'יפס הנקי בצלחת פטרי סטרילית מפלסטיק בקוטר 10 סנטימטרים. לאחר מכן, הוסף שמונה מיליליטר מים מזוקקים סטריליים לצלחת הפטרי ליצירת תא לח שימנע מהנפח הקטן של מדיום התרבות על השבב להימשך כאשר הוא מונח בחממה. לאחר מכן השתמש בטבעות PolyTetraFluoroEthylene בהתאמה אישית כדי להבטיח ציפוי של הקרדיומיוציטים במרכז השבב שבו נמצא מערך האלקטרודות.
במכסה המנוע, הסר את הטבעות מהאתנול. מניחים אותם בצלחת פטרי סטרילית ללא מכסה ומניחים לטבעות להתייבש במכסה המנוע. לאחר מכן הניחו טבעת יבשה בתוך שבב MEA באמצעות פינצטה מעוקרת להבה.
מצפים את האלקטרודות על ידי הוספת 50 מיקרוליטר של 40 מיקרוגרם למיליליטר פיברונקטין בתוך הטבעת. לאחר מכן מכסים את צלחת הפטרי במכסה ומעבירים בזהירות את המנה המכילה את שבב MEA לחממה. לאחר מכן העבירו את הצלחת המכילה את שבב ה-MEA למכסה המנוע של תרבית התאים.
לפני השימוש בשבב MEA, שאפו 50 מיקרוליטר פיברונקטין באמצעות פיפטה P200 או מערכת ואקום במכסה המנוע מבלי לעקור את טבעת ה-PTFE. ודא שאף חפץ מוצק לא נוגע באלקטרודות על ידי שמירה על הקצה בזווית. לאחר מכן הוסף בעדינות 950 מיקרוליטר של מדיום LI-BPEL כדי להבטיח שהוא מפוזר באופן שווה ושהטבעת לא תצוף.
לאחר מכן החזירו את המנה לחממה. זוהי התרבות הראשונית של הקרדיומיוציטים הפועמים. במכסה המנוע של תרבית רקמות, שאפו היטב את המדיום מתרבית hPSC-CMs.
הוסף מיליליטר אחד עד שניים של PBS ללא סידן ומגנזיום לכל באר כדי לשטוף את התרבות ולשאוף את ה-PBS. לאחר מכן הוסף 500 מיקרו ליטר של אנזים הניתוק לכל באר. דגרו את הדגימה למשך 5 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס.
לאחר חמש דקות הוסף מיליליטר אחד של LI-BPEL לכל באר כדי לדלל את האנזים. נתק את השכבה החד-שכבתית של hPSC-CMs על ידי גירוד עדין עם פיפטה P1000. לאחר מכן אוספים את תרחיף התאים בצינור של 15 מיליליטר.
לאחר מכן שטפו את הבאר עם מיליליטר אחד של LI-BPEL כדי לאסוף את כל התאים הנותרים וגושי התאים. הוסף עוד שניים עד שלושה מיליליטר של LI-BPEL כדי להגיע לנפח סופי של כחמישה עד שישה מילימטרים ופיפטה בעדינות למעלה ולמטה שלוש עד חמש פעמים עם פיפטה של חמישה מיליליטר כדי להפריד גושי תאים. לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות ב -300 פעמים גרם.
לאחר מכן הסר את הסופרנטנט מבלי לעקור את כדור התא. לאחר מכן השעו מחדש את גלולת התא ב-250 מיקרוליטר של LI-BPEL. לאחר מכן הפץ 50 מיקרוליטר של תרחיף תאים לכל MEA על ידי צנרת מתלה התא ישירות למרכז טבעת ה-PTFE על גבי מערך האלקטרודות.
העבירו בזהירות את ה-MEA לאינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ואפשרו לתאים להיצמד למשך הלילה. יום לאחר הציפוי, הסר בזהירות את הטבעת בסביבה סטרילית באמצעות פינצטה סטרילית. שוטפים את הטבעת ב 80 אחוז אתנול.
ואחסן אותו בשפופרת של 50 מיליליטר המכילה 80 אחוז אתנול טרי. לאחר מכן, הסר בעדינות 500 מיקרו ליטר מדיום משבב MEA. והוסיפו לו 500 מיקרו ליטר LI-BPEL טרי.
אלו הם הקרדיומיוציטים הפועמים לאחר הסרת הטבעת. לאחר מכן העבירו את ה-MEA לחממה ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן מדוד את הפעילות החשמלית של hPSC-CMs ב-MEA החל מיום אחד לאחר הסרת הטבעת ועד שבוע.
כעת הפעל את חבילת התוכנה המקושרת להגדרת MEA. לאחר מכן הגדר את הטמפרטורה ל-37 מעלות צלזיוס ב-TCX-Control כדי לתעד את המדידות. לאחר מכן הוציאו את המנה המכילה את שבב ה-MEA מהחממה.
הוציאו את שבב ה-MEA מהצלחת והניחו אותו על טישו כדי לספוג את שאריות המים. נגב בזהירות את ההקשר החיצוני של הצלחת עם טישו ונקה אותו באמצעות צמר גפן רטוב ב-100 אחוז אתנול כדי להסיר שאריות מים או פסולת שעלולים לגרום לרעש אות. לאחר מכן העבירו את לוחית ה-MEA לשלב ראש הקלטה של 37 מעלות צלזיוס כדי לזהות פעילות ספונטנית.
פתח את MC Rack ולחץ על ערוך כדי לטעון את חומרת המזרח התיכון. כדי ליצור פרוטוקול חדש, השתמש בעריכת התפריט הנפתח כדי להוסיף מקליט וחלונות תצוגה שונים לפרוטוקול. לאחר מכן הפעל את הפרוטוקול במצב הפעלה על ידי לחיצה על כפתור ההפעלה.
אם האותות מציגים פסגות R ו-T גלויות, המתן בבירור 10 עד 15 דקות כדי לסיים את שלב ההסתגלות. כדי להתחיל את הניסוי, לחץ על הקלטה ולאחר מכן הפעל ורכוש נתונים במשך 10 דקות בתנאי הבסיס כדי לקבוע מצב יציב. הוסף ביאורים לאלקטרודות בעלות האות הטוב ביותר כך שניתן יהיה לזהות אותן בקלות ולייצא אותן מאוחר יותר לניתוח.
להערכת תגובה לתרופות, הוסף ריכוזים הולכים וגדלים של התרופה כל 10 דקות. לחץ על עצור כדי לסיים את ההקלטה בסוף הפרוטוקול. להלן העקבות המייצגים שהוקלטו עם MEA המראים עקבות באיכות טובה עם פסגות RQ ו-T הנראות בבירור עם יחס אות לרעש גבוה.
עקבות באיכות גרועה ללא שיאי RQ ו-T הנראים בבירור ועקבות רועשים עם שיאי RQ ו-T נראים בבירור אך עם יחס אות לרעש נמוך. והנה הדוגמאות המייצגות של עקבות פוטנציאל שדה באיכות טובה עם מורפולוגיות שונות שניתן לרשום במהלך ניסויי MEA באמצעות hPSC-CMs. האזור המוצל מייצג את מרווח ה-QT שנמדד במהלך הניתוח.
מכיוון שפוטנציאל השדה ב-MEA דומה לנגזרת הראשונה של פוטנציאל הפעולה, האינטגרל של עקבות פוטנציאל השדה חושב כהדגמות תיאורטיות של גלי T הקרובים לקיטוב מחדש של פוטנציאל הפעולה השלם. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור ללכת על המספר הגבוה ביותר של אלקטרודות כדי להבטיח אותות אמינים ועקביים. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות כמו PCR זמן שוק קוונטי או מהדק תיקון תא בודד על מנת לענות על שאלות נוספות כמו ביטוי גנים ספציפי הקשור לפנוטיפ חשמלי או צפיפות זרם יונים ספציפית.
לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום תאי הגזע, לחקור הפרעות קצב לב ופרמקולוגיה חוץ גופית באמצעות קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. לאחר צפייה בסרטון זה אמורה להיות לך הבנה טובה כיצד לנתק ולצלחת קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים על MEAs למדידות אלקטרופיזיולוגיות וסינון תרופות. אל תשכח שעבודה עם תרופות עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון GLP סטנדרטי בעת ביצוע הליך זה.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט את תהליכי הדיסוציאציה וההזרעה של תאי שריר לב (cardiomyocytes) המופקים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC-CMs) על מערכי אלקטרודות רב-נקודתיות (MEAs) לצורך אפיון אלקטרופיזיולוגי. הוא מפרט את השיטות למדידת פוטנציאל שדה וניתוח מרווחי QT ו-RR, החיוניים למידול מחלות לב ולהערכת תגובה לתרופות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אלקטרופיזיולוגיה של הלב
- ביולוגיה של תאי גזע
- סריקת תרופות
רקע
- הבנת התכונות האלקטרופיזיולוגיות של hPSC-CMs חיונית למחקר לבבי.
- שיטה זו מאפשרת להעריך תגובות לתרופות בקרדיומיוציטים אנושיים.
- מדידות פוטנציאל שדה מספקות תובנות לגבי הפעילות החשמלית התאית.
- הדגמה חזותית של הפרוטוקול היא קריטית ליישום מוצלח.
מטרת המחקר
- לאפיון האותות החשמליים של hPSC-CMs.
- להשוואת הבדלים אלקטרופיזיולוגיים בין קרדיומיוציטים מוטנטיים לברי ארגמן.
- לסיוע בסריקת תרופות באמצעות תאים המופקים ממטופלים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- פירוק של hPSC-CMs באמצעות אנזים לפירוק.
- זריעת תאים על MEAs עם ציפוי פיברונקטין.
- מדידה של פעילות חשמלית באמצעות תוכנה ייעודית.
- הערכת תגובות לתרופות על ידי שינוי ריכוזי התרופות במהלך ההקלטות.
תוצאות עיקריות
- דיסוציאציה וזריעה מוצלחות של hPSC-CMs על MEAs.
- מדידה ברורה של פוטנציאלים של שדה וזיהוי של שיאי R ו-T.
- יכולת להערכת תגובות לתרופות בזמן אמת.
- הדגמה של איכות אות משתנה בהתבסס על תנאי הניסוי.
מסקנות
- פרוטוקול זה מספק שיטה מהימנה לחקר hPSC-CMs.
- אפיון אלקטרופיזיולוגי חיוני להבנת מחלות לב.
- השיטה תומכת במאמצי סריקת תרופות ברפואה מותאמת אישית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרופיל אלקטרופיזיולוגי של תאי שריר לב (hPSC-CMs) המופקים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות מערכים רב-אלקטרודיים (MEAs) מאפשר הערכה בקיבולת בינונית עד גבוהה של תפקוד תעלות יונים בלב ושל שינויים אלקטרופיזיולוגיים המושרים על ידי תרופות. גישה זו תומכת בזיהוי מוקדם של סיכוני רעילות לבבית ובצמצום סיכונים מנגנוני של תרכובות אריתמוגניות בשלבי סריקה של פיתוח תרופות. באמצעות אספקת פרמטרים כמותיים של פוטנציאל שדה, כגון מרווחי QT ו-RR, השיטה מגבירה את הביטחון החזוי במחקר קרדיווסקולרי תרגומי ובתהליכי עבודה של פרמקולוגיית בטיחות.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות השוואת פנוטיפים אלקטרופיזיולוגיים בין hPSC-CMs מוטנטיים לבקרה, כדי להבהיר את מנגנוני התפקוד הלקוי של תעלות יונים.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות תיקוף תפקודי של מטרות תעלות יונים בלב באמצעות מודלים תאיים רלוונטיים לבני אדם.
- ערך חיזוי: מסייע במיון תיקי פיתוח על ידי זיהוי תרכובות המאריכות את מרווח ה-QT או משנות את מורפולוגיית פוטנציאל השדה, דבר המעיד על סיכון פרו-אריתמי.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מוכנות הבדיקה: הכנת שכבות מונו-שכבה (monolayers) מאושרות של hPSC-CM על גבי MEAs להקלטה עקבית וניתנת לשחזור של פוטנציאל שדה על פני מספר אלקטרודות.
- פלט כמותי: מאפשר הפקת מדדים מבוססי מרווחים (QT, RR) ומורפולוגיית גל כנתונים מהימנים להערכת השפעת תרכובות.
- סביליות ושימוש חוזר: תומך בפרופיל תגובה לתרופות בתפוקה בינונית עם יכולת בחינת תגובה למינון, מה שמאפשר שימוש חוזר במסעות סריקה ובספריות תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מידול מחלות: שימוש ב-hPSC-CMs המופקים מחולים עם תסמונות של הפרעות בקצב הלב (arrhythmia syndromes) כדי למדל אלקטרופיזיולוגיה לבבית אנושית במערכת הרלוונטית למחלה.
- המשכיות תרגומית: גישור בין שלב גילוי האלקטרו-פנוטיפ (electrophenotyping) לבין תיקוף פרה-קליני, באמצעות אספקת נתונים ממקור אנושי המנבאים תגובות לתרופות in vivo.
- הפחתת סיכונים מנגנונית: מאפשר זיהוי מוקדם של השפעות המתווכות על ידי תעלות יונים, ובכך מפחית נשירה בשלבים מאוחרים עקב ממצאי בטיחות לבבית.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
הבדיקה האלקטרופיזיולוגית מבוססת ה-MEA משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה, דרך זיהוי מובילים ועד להערכת בטיחות פרה-קלינית, ובכך מאפשרת קבלת החלטות מבוססת נתונים בכל שלב.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי מעורבות של תעלות יונים במנגנוני הפרעות קצב על ידי מדידת שינויים בפוטנציאל השדה ב-hPSC-CMs המוגדרים גנטית.
- סריקה: מספק תוצאות אלקטרופיזיולוגיות הניתנות לשחזור ומוכנות לבדיקה, עם רכישת אותות אוטומטית ובקרת טמפרטורה לצורך אפיון ספריות של תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת מדידות כמותיות של משתנים תלויים (מרווחי QT, RR, מורפולוגיה של גלי הלב) המאפשרות השוואה אובייקטיבית של מצבים אלקטרופיזיולוגיים בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין אלקטרו-פנוטיפינג in vitro לרלוונטיות קלינית על ידי מידול של אלקטרופיזיולוגיה לבבית אנושית ותגובה לתרופות בפורמט הניתן להרחבה (scalable).
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה אלקטרופיזיולוגית רב-שימושית הישימה במגוון פרויקטים, מטרות ותחומים טיפוליים במחקר קרדיו-וסקולרי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית באלקטרופיזיולוגיה של הלב באמצעות מדידה ישירה מבוססת תאי אדם.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות באמצעות פריסה, ציפוי ותנאים סביבתיים מבוקרים, ובכך ממזער את השונות בין מעבדות.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) על ידי מתן אפשרות לגילוי מוקדם של תרכובות קרדיוטוקסיות, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים וחוסר יעילות הונית.
- השפעה על פורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים על ידי זיהוי מוקדם של ליאביליות אלקטרופיזיולוגית, דבר המנחה את הקצאת המשאבים לעבר מועמדים בטוחים יותר.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרביות תאי גזע, בידול לבבי ובפירוש אותות אלקטרופיזיולוגיים כדי להבטיח את איכות הנתונים.
- תלוי במיכשור התואם ל-MEA, ביחידות בקרה של טמפרטורה ובתוכנה לרכישת אותות לצורך הקלטה מהימנה של פוטנציאל שדה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של הכנת התאים, צפיפות הזריעה ופרוטוקולי הניתוח כדי להבטיח השוואתיות בין מחקרים.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבה לתרביות תלת-ממדיות (3D) או למצבי הבשלה חלופיים של hPSC-CMs כדי לשמור על נאמנות האות.
- מוגבל על ידי הצורך באופטימיזציה של תנאי הפירוק והזריעה כדי למנוע עקה תאית שעלולה להטות את המדדים האלקטרופיזיולוגיים.
