כרוני אוטואימונית יבש עין עכברוש דגם עם הגדלת זיכרון תאי זיכרון T ב Eyeball רקמות

המטרה הכוללת של הליך זה היא לגרום למאפיינים קליניים של תפקוד לקוי של דמעות ודלקת בבלוטת הדמעות בחולדות באמצעות חיסון תת עורי והזרקת תמציות בלוטות דמעות תת-לחמית ותוך דמעות להערכת טיפולים בעין יבשה אוטואימונית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בעין יבשה, כגון האם תרופות המדכאות תאי T במחלות אוטואימוניות יעילות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מייצרת סימנים של מחלת עיניים בדומה לעין יבשה אנושית וגם מכמתת את תאי ה-T החודרים לבלוטת הדמעות ולעין.

ההשלכות של מודל בעלי חיים זה משתרעות לקראת הבנת סחר בלימפוציטים מכיוון שניתן לחקור טחול ובלוטות לימפה. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בגלל היעדר מכשור מתאים לתיעוד שינויים בעין החולדה הקטנה. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון ששלבים מסוימים קשים ללמידה בגלל הייבוש המהיר של עין החולדה והיעדר מצמוץ לאחר ההרדמה.

לאחר המתת חסד של נקבת חולדת ספראג דולי על פי פרוטוקול הטקסט, הנח את החיה שטוחה עם אוזן אחת על השולחן והשנייה כלפי מעלה. בעזרת מספריים, בצע חתך של 10 מילימטר עליון-נחות מתחת לאוזן החשופה. לאחר מכן, הסר את בלוטת הדמעות על ידי ניתוחה מרקמת החיבור שמסביב ומצינור הניקוז.

לאחר מכן, בעזרת מספריים, טוחנים את הרקמה דק ככל האפשר על קרח. לאחר מכן, הוסף 150 מיקרוליטר PBS עם מעכב פרוטאז 1X לכל בלוטת דמעות. כאשר הסוניקטור מוגדר ל-10 שניות דולק, 10 שניות כבוי ומשרעת של 30%, סוניקטור את הדגימות על קרח ב-20 קילו-הרץ למשך חמש דקות.

לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימות הסוניקטיביות ב-13,000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש. לאחר מכן, יש להקצות את הסופרנטנט לצינורות של 1.5 מיליליטר, ולאחסן אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס.

העבירו את האדג'ובנט השלם של פרוינד המכיל חמישה מיליגרם למיליליטר של Mycobacterium tuberculosis H37Ra או את האדג'ובנט הלא שלם של פרוינד לשפופרת של 50 מיליליטר, וודא שנפח האדג'ובנט לתערובת האנטיגן הוא ביחס של אחד לאחד. הוסף את תערובת האנטיגן המכילה שני מיליגרם למיליליטר אובאלבומין ו-10 מיליגרם למיליליטר תמצית בלוטת הדמעות טיפה אחר טיפה לתמיסת האדג'ובנט תוך כדי מערבולת במהירות הגבוהה ביותר שאינה גורמת לשפיכה. המשיכו במערבולת במשך חמש דקות לאחר הוספת כל האנטיגן.

העבירו את האמולסיה למזרק של חמישה מיליליטר, והשתמשו במחבר מזרק כדי לקשר אותו למזרק נוסף של חמישה מיליליטר. לאחר מכן, דחפו את האמולסיה ממזרק אחד למשנהו כדי לערבב אותו. ביום האפס, חלקו 200 מיקרוליטר של האמולסיה, המכילה מיליגרם אחד של תמצית בלוטת הדמעות ו-200 מיקרוגרם של אובאלבומין באדג'ובנט מלא של פרוינד, למזרקי נעילת לואר מיליליטר אחד, וציידו את המזרקים במחטים בגודל 27

ללא שימוש בהרדמה, יש להזריק תת עורית את האמולסיה בבסיס זנבות החולדה. ואז, ביום ה-14, באופן דומה, הזריקו 200 מיקרוליטר מאותו אנטיגן באדג'ובנט של פרוינד לא שלם. באותו יום, יש להזריק תוך צפקית 300 ננוגרם של רעלן שעלת ב-100 מיקרוליטר PBS.

ביום ה-48, שקלו את הכמות הנדרשת של אובאלבומין והמיסו אותה ב-PBS. לאחר מכן, שלבו אובאלבומין עם תמצית בלוטת הדמעות שהוכנה מוקדם יותר בסרטון זה, וצרו תמיסת אנטיגן המכילה מיליגרם אחד למיליליטר אובאלבומין ומיליגרם אחד למיליליטר תמצית בלוטת הדמעות. לאחר הרדמת החולדה, יש להזריק חמישה מיקרוליטרים של אנטיגן לתת-הלחמית הפורניסאלית של העין.

לאחר מכן, הזריק 20 מיקרוליטר אנטיגן לבלוטת הדמעות. תוך כדי החזקת חולדה מורדמת על פי פרוטוקול הטקסט, כדי למדוד את נפח הדמעות בחוט אדום פנול, השתמש בזוג מלקחיים אחד כדי להחזיק את החוט ובאחר כדי למשוך את העפעף התחתון של החולדה. הניחו את החוט בפינה הפרוקסימלית של הפורניקס התחתון למשך דקה אחת, ולאחר מכן הסירו את החוט.

לאחר מכן, הניחו את החוט ליד סרגל עם סימונים מילימטריים, וצלמו תמונה של אורך החלק הרטוב של החוט. כדי למדוד את חלקות הקרע בקרנית, הניחו את החולדה מתחת למיקרוסקופ סטריאו המצויד בתאורת טבעת ומצלמה. לאחר מכן, מרחו חמישה מיקרוליטרים של מי מלח על קרנית החולדה.

בעזרת אצבעות עטויות כפפות, מצמץ באופן פסיבי על ידי הזזת העפעפיים העליונים והתחתונים כחמש פעמים כדי לפזר את מי המלח. בהגדלה של פי 1.6, מקדו את תאורת הטבעת במרכז משטח הקרנית. לאחר מכן, לאחר 10 שניות, רכשו תמונות צילום.

השתמש בסריקת פלואורסצאין כדי למדוד נזק לקרנית על ידי הוספת שני מיקרוליטרים של 0.2% פלואורסצאין לקרנית החולדה. בעזרת אצבע עטויה כפפה, פתחו וסגרו את עפעפי החולדה באופן פסיבי שלוש פעמים כדי לפזר את צבע הפלואורסצאין על פני העין. לאחר דקה אחת, השתמש במזרק של שלושה מיליליטר כדי לשאוב מיליליטר אחד של מי מלח.

לאחר מכן, מקם את המזרק כשניים עד שלושה מילימטרים לפני הקרנית ומרח בעדינות מי מלח על העין. כאשר אור הרקע כבוי, רכוש תמונות מתחת לפילטר כחול קובלט של מיקרוסקופ הדמיה עיני. לאחר המתת חסד של החולדה על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש במספריים כדי להסיר את העפעפיים העליונים והתחתונים.

שחררו את הגלובוס על ידי ניתוק השרירים החוץ-עיניים, עצב הראייה והלחמית הפורניסאלית. בצע חתך כדי לפתוח את גלגל העין. הסר את העדשה בזגוגית.

לאחר מכן, הכניסו את גלגלי העיניים המנותחים לצינורות של 1.5 מיליליטר על קרח. לבסוף, אסוף את בלוטות הדמעות כפי שתואר קודם לכן בסרטון זה. איור זה מציג תמונות מייצגות של חוטי פנול אדומים מחולדת ביקורת וחולדת DED.

אורך החוטים האדומים של הפנול בקבוצת DED קצר יותר מקבוצת הביקורת, מה שמעיד על פחות נפח קרעים. פלואורסצאין נקשר לאפיתל הקרנית הפגום ולכן משמש למדידת היקף הנזק. בניסוי זה, כתמי פלואורסצאין על פני הקרנית של חולדות DED דורגו מאפס לשניים והושוו לחולדות ביקורת.

לחולדות עם DED יש יותר צביעת פלואורסצאין מאשר לחולדות ביקורת, מה שמרמז על נזק לקרנית. כפי שניתן לראות כאן, אם משטח הקרנית חלק עם יציבות קריעה גבוהה, התמונה של טבעת התאורה על פני העין היא עגולה ומושלמת. עיוות של התמונה מצביע על חלקות קרנית מופחתת וסרט דמעות לא יציב, כפי שנצפה בדרגת עיוות גבוהה יותר בקבוצת DED.

ניתוח ציטומטריית זרימה זה מראה כי תת-קבוצת תאי ה-T הדומיננטית ברקמות גלגל העין הרגילות של חולדה הם תאי T זיכרון אפקטור. בגלגלי העיניים של חולדות DED, כ-70% מתאי ה-T החיוביים ל-CD3 הם תאי זיכרון אפקטור, בעוד שבחולדות ביקורת מספר זה הוא כ-50%גלגלי העיניים של חולדות DED מכילים תאי T אפקטיביים גבוהים משמעותית מאלה של חולדות הביקורת. לאחר הליך זה, ניתן לבצע צביעה לסוגים אחרים של תאים חיסוניים כדי לענות על שאלות נוספות.

לדוגמה, אתה יכול להכתים תאי חיסון מולדים או לימפוציטים מסוג B. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים להבין את האימונולוגיה של פני העין ובהמשך, לחקור עין יבשה בבני אדם ותסמונת סיוגרן. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לגרום ליובש בעין אוטואימונית בחולדות ולבצע תיעוד חזק של התוצאות.