אבלציה כירורגית Assay עבור לימוד Regeneration Eye ב Planarians

פרוטוקול זה מראה כיצד שיחתוך עיני planarian בעקביות (כוסות אופטיות) מבלי להפריע רקמות סובבות. באמצעות מחט אינסולין במזרק, או אחת או בשתי העיניים יכול להיות מלוטשים על מנת להקל על חקירת מנגנוני ויסות התחדשות העין, את האבולוציה של התחדשות ויזואלית, ואת הבסיס העצבי של התנהגות האור המושרה.

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים כיצד להסיר באופן אמין את הכוס האופטית המישורית מבלי להפריע למוח או לרקמות הסובבות אותה, כך שהטכניקה תוכל להיות מיושמת על ידי חוקרים וסטודנטים בכל רמות החינוך. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ההתחדשות, כגון קביעת המנגנונים המווסתים תחזוקה והתמיינות של תאי גזע אנדוגניים בעין in vivo. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לחוקרים להסיר רק את רקמות העיניים עם הפרעה מינימלית של רקמות אחרות.

בדרך כלל, נדרש תרגול לפני שאנשים חדשים בשיטה זו יכולים להסיר באופן אמין את הכמות הנכונה של רקמה, תוך הסרת העין כולה תוך הימנעות מאבלציה של הרקמות הסובבות. כדי להתחיל, בחר תולעים שלא הוזנו במשך שבוע לפחות ואורכן לפחות חמישה עד שבעה מילימטרים. העבירו 15 עד 30 תולעים לצלחת פטרי בגודל 100 מילימטר שני שליש מלא במי תולעים והחליפו מיד את המכסה.

שימו לב לתולעים לאיתור רקמות חסרות או חסרות פיגמנט, כגון ראשים או זנבות לבנים, כדי לוודא שהן לא ניזוקו ולא התחדשו לאחרונה. ראשית, נגב את סביבת העבודה ואת בסיס המיקרוסקופ המנתח בתמיסת אתנול של 70%, ותן לו להתייבש לחלוטין. מניחים את המנה עם התולעים שנבחרו בצד שמאל של המיקרוסקופ.

לאחר מכן, בצד ימין של המיקרוסקופ, הניחו זוג מלקחיים מספר חמש, מחט אינסולין בגודל 31 בגודל 5/16 אינץ' עם מזרק מיליליטר אחד, פיפטת העברה נקייה וצלחת 12 בארות מסומנת לאיסוף תולעים מובטלות. הניחו קופסה של מגבוני טישו נטולי מוך, בקבוק כביסה מפלסטיק מלא במי תולעים טריים ופיפטות העברה נוספות כך שיהיו נגישות בקלות במהלך הניתוח. מקם לוחית פלטייר במרכז בסיס המיקרוסקופ המנתח, והגדר את הפלט על מקור הכוח DC כך שפני השטח של לוחית פלטייר יהיו קרירים מספיק כדי לשתק תולעים.

לחלופין, ניתן להשתמש בצלחת פטרי מלאה בקרח במקום צלחת פלטייר. כדי להכין את משטח הניתוח, חתכו תחילה חתיכת סרט פרפין מפלסטיק בגודל חמישה סנטימטרים על עשרה סנטימטרים והניחו אותה מעל מרכז צלחת פלטייר. לאחר מכן, קפלו מגבון טישו נטול מוך לריבוע של כשני סנטימטרים, והניחו אותו על גבי הסרט.

לאחר מכן, החזיקו את המגבון המקופל במקומו, הרטיבו אותו במי תולעת וגלגלו את המגבון שטוח בעזרת פיפטת העברה. לבסוף, חותכים פיסת נייר סינון לבן בגודל 1.5 עד שני סנטימטרים בריבוע, ומניחים אותה על גבי המגבון. כדי להתחיל בניתוח, הנח צד גבי אחד של תולעת כלפי מעלה על נייר הסינון, באמצעות פיפטת ההעברה.

הדליקו את האור ומקדו את האלומה שלו בתולעת. התאם את המיקוד וההגדלה של מיקרוסקופ החיתוך כך שעיני התולעת ייראו בבירור. סובב את סרט הפרפין כדי להתאים את מיקום התולעת כך שראשה יופנה לכיוון החוקר ובזווית של 30 עד 40 מעלות ימינה.

אם התולעת ממוקמת בצד הגחון כלפי מעלה, ופתח הלוע גלוי, השתמש בצד העמום של המלקחיים כדי לשנות בעדינות את מיקום התולעת לצד הגבי כלפי מעלה כשהעיניים גלויות. התאימו מחדש את הגדרות המיקרוסקופ כך שהעיניים יהיו ממוקדות בבירור. כמו כן, ודא שגם העיניים וגם רקמות הראש שמסביב נראות לעין.

החזיקו מזרק נקי ביד ימין בין האגודל לאצבע המורה. תמכו בחלקו התחתון של המזרק באגודל שמאל, המוצמד לצלחת פלטייר. הסתכל דרך המיקרוסקופ כדי לוודא שהשיפוע של המחט נראה לעין.

הנח את האצבע המורה השמאלית על משטח הניתוח כך שהיא תיצור זווית של 40 מעלות עם האגודל השמאלי כדי להבטיח שהמשטח יישאר יציב במהלך ההליך. מקם את המחט בזווית של 90 מעלות לעין כששיפוע המחט פונה כלפי מעלה. עם קצה המחט, חודרים בעדינות לשכבת הרקמה הדקה המכסה את הראייה של העין הנראית כאזור לבן וללא פיגמנט.

יש לגרוף מימין לשמאל, להסיר בעדינות רבה את כל הרקמות הפיגמנטיות השחורות הנמצאות בתוך הגביעונית האופטית וכן את כל הרקמות הלבנות. אם מבצעים אבלציה של עין כפולה, יש להוציא את העין השנייה כעת. לאחר השלמת הניתוח, העמיסו את הפיפטה בכמות קטנה של מי תולעים, ושחררו את המים על התולעת כדי להרים אותה מנייר המסנן.

משוך מיד את התולעת לתוך פיפטת ההעברה. העבירו את התולעת לצלחת מסומנת של 12 בארות עם שני שליש מלאים במי תולעים טריים. לאחר העברת כל התולעים, שטפו אותן על ידי החלפת המים מהבארות במי תולעים מתוקים.

דגרו על התולעים המוגנות מפני אור באינקובטור של 20 מעלות צלזיוס ועקבו אחר תהליך ההתחדשות. כדי להקריב תולעים חיות, הסר מי תולעים מהצלחת והחלף אותם באתנול 70%. דגרו על התולעים במשך שלוש עד חמש דקות ושימו לב אם התולעים הופכות לאפורות.

מוצגים כאן תצלומים של תולעים שטוחות שעברו אבלציה של עין כפולה ואבלציה של עין אחת, שצולמו לפני, ארבעה ימים אחרי ושבועיים לאחר ההליך הכירורגי. התמונות מדגימות את התקדמות ההתחדשות לאורך זמן. התחדשות העיניים בתולעים שעברו כריתה אושרה גם על ידי צביעה אימונוהיסטוכימית של עצירה ונוירונים קולטני אור שפותחו לאחרונה.

התאוששות מערכת הראייה בתולעים שטוחות לאחר אבלציה כפולה של העין נחקרה גם במבחן תפקודי המבוסס על התגובה הפוטופובית של הפרא לאור. 24 שעות לאחר האבלציה, תולעים חסרות עיניים אינן נמנעות מאור ונעות דרך כתמי אור. פוטופוביה משוחזרת עד שבעה ימים לאחר ההליך, מה שמעיד על כך שמערכת הראייה המחודשת מתפקדת.

לאחר השליטה, ניתן לבצע את ההליך של אבלציה של עין כפולה של תולעת אחת כשלוש דקות. בעת האבלטור, חשוב לכרות את כל הרקמות הפיגמנטיות והלא פיגמנטיות של העין, תוך הקפדה לא לפגוע ברקמה שבין העיניים או לקרוע את הרקמה מאוחר יותר לתוך העין. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו אימונוהיסטוכימיה והפרעות RNA על מנת לבחון את תפקידם של גנים ספציפיים ואת תהליך ההתחדשות שלהם.

בנוסף, ניתן לבצע בדיקות התנהגותיות כדי לבדוק את תפקוד העיניים לאחר צמיחה מחודשת. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לכרות עיניים מישוריות מבלי להפריע לרקמות שמסביב. אל תשכח שעבודה עם מחטים עלולה להיות מסוכנת, ויש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות והחזקת המחט המכוונת ממך.