מתח הידוק פלואומטריה ב קסנופוס ביציות באמצעות חומצות אמינו פלואורסצנטי לא טבעי

מאמר זה מתאר שיפור של קונבנציונאלי מתח פלמורומטריה (VCF) שבו פלואורסצנט טבעי חומצות אמינו (fUAA) משמשים במקום צבעים maleimide, כדי לבדוק סידורים מבניים בערוצי יון. ההליך כולל הזרקת Xenopus ביצית דנ"א, RNA / מטבע fUAA, ומדידות בו זמנית ו פלואורסצנטי.

המטרה הכוללת של הליך זה היא להכניס חומצת אמינו פלואורסצנטית לא טבעית לחלבון ממברנה המתבטא בביציות קסנופוס ולקבוע את תפקוד החלבון ואת הסידור מחדש המבני בו זמנית, באמצעות פלואורומטריה מהדק מתח. טכניקה זו תעזור לענות על שאלות מפתח בתחום יחסי תפקוד המבנה של חלבוני הממברנה. באמצעות פלואורומטריה של מהדק מתח, אנו יכולים לתאם ישירות סידורים מבניים עם תפקוד החלבון.

הוספת תיוג חומצות אמינו פלואורסצנטיות לא טבעיות עוזרת להתגבר על מגבלות קודמות על התיוג. זו הייתה פעם הנגישות של אתרי התיוג כמו גם תיוג רקע עקב אתרי קשירה אנדוגניים. ההשלכה של טכניקה זו משתרעת לקראת הבנה ביופיזית טובה יותר של חלבוני הממברנה מכיוון שכעת ניתן לחקור תחומים, שבעבר לא היו נגישים עם פלואורומטריה מסורתית של מהדק מתח.

לאחר הסרה כירורגית של ביציות ה-Xenopus, יש לשטוף את הביציות שלוש פעמים בתמיסת SOS. בחרו ביציות גדולות ובריאות בנפרד, ודגרו אותן בטמפרטורה של 18 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות לפחות בתמיסה של בארת' בתוספת אנטיביוטיקה וסרום סוסים 5% לפני ההזרקה. להזרקה גרעינית של DNA, הכינו קצה הזרקה ארוך ודק כדי להגיע לגרעין מבלי לפגוע בביציות.

לאחר מכן, מלאו את קצה ההזרקה בשמן, והרכיבו את קצה ההזרקה על מכשיר הננו-מזרק. לאחר מכן, התקן את הננו-מזרק מתחת למיקרוסקופ סטריאו ושבר את קצה הקצה בעזרת מלקחיים. לאחר מכן, הוצא את השמן עד שאין בועת אוויר כלואה בקצה הקצה.

לאחר מכן, הניחו מיקרוליטר אחד של 0.1 מיקרוגרם למיקרוליטר pAnap במים נטולי נוקלאז על פיסת פרפילם מתחת לסטריאוסקופ, ומלאו את קצה ההזרקה ב-DNA. לאחר מכן, העבירו את הביציות לצלחת הזרקה המכילה רשת המכילה את התמיסה של בארת' בתוספת אנטיביוטיקה. מכיוון שגרעין הביצית ממוקם בקוטב החיה, כוון את קצה ההזרקה למרכז קוטב החי והטביע כך שהקצה יגיע קרוב למרכז חצי הכדור של החיה.

לאחר מכן, הזרקו 9.2 ננוליטר מתמיסת ה-pAnap לגרעין של כל ביצית. לאחר מכן, דגרו את הביציות בשני מיליליטר של תמיסת בארת' בתוספת אנטיביוטיקה וסרום סוס 5% ב-18 מעלות צלזיוס למשך שש עד 24 שעות כדי לאפשר ביטוי חזק של tRNAs וסינתזות tRNA ספציפיות ל-Anap. כעת, הכינו שוב את הננו-מזרק, אך הפעם, קצה ההזרקה לא צריך להיות דק כמו זה של הזרקת DNA.

עבדו באור אדום בלבד מנקודה זו כדי למנוע פוטוהלבנה של האנאפ. מערבבים מיקרוליטר אחד של Anap של מילי-מולרית אחת עם מיקרוליטר אחד של 1-2 מיקרוגרם למיקרו-ליטר mRNA ישירות על פיסת פרפילם, וממלאים את קצה ההזרקה בתמיסת התערובת. תקעו את הקצה בקוטב הצמחי ממש מתחת לממברנה, והזריקו 46 ננוליטר מתמיסת התערובת בכל ביצית המוזרקת ב-pAnap.

לאחר מכן, הגן על הביציות מפני אור על ידי הנחתן בקופסה אטומה לאור או על ידי עטיפת הבקבוק בנייר אלומיניום. דגרו אותם בתמיסה של בארת' בתוספת אנטיביוטיקה וסרום סוסים 5% ב-18 מעלות צלזיוס למשך יומיים-שלושה. החליפו אותו בתמיסה טרייה של בארת' מדי יום, והסירו את הביציות המתות כדי למנוע זיהום.

במערך זה, ציוד מהדק המתח הפתוח משולב במערך מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. תא ההקלטה מותקן על מחוון המאפשר לו לנוע בין הסטריאוסקופ הסטנדרטי להצבת הביצית למיקרוסקופ לביצוע מדידות פלואורסצנטיות. מערכת גילוי פוטו-דיודה מחוברת ליציאת תושבת-C של מיקרוסקופ הקרינה, וקריאת הפוטו-זרם מחוברת לערוץ כניסה שני במעבד האותות הדיגיטלי.

מנורת הלוגן של 100 וואט 12 וולט משמשת כמקור אור לעירור הקרינה. העירור נשלט על ידי תריס מכני בין מקור אור העירור למיקרוסקופ. ההפעלה מופעלת באמצעות דופק TTL המגיע ממעבד האותות הדיגיטלי המתוזמן בתוכנת ההקלטה כך שהתריס נפתח כ-100 אלפיות השנייה לפני תחילת ההקלטה, ונדרשת קוביית סינון מתאימה בצריח קוביית המסנן.

עבור VCF דו-צבעוני, דגרו את הביציות המוכנות ב-TMR maleimide בעל חמישה מיקרו-מולרים בתמיסת תיוג למשך 15 דקות מיד לפני ההקלטה. לאחר מכן, שטפו את הביציות בתמיסת התיוג שלוש פעמים כדי להסיר עודפי צבע לפני ההקלטה. בשלב זה, החלבון מסומן באופן ספציפי בשני פלואורופורים שונים.

לאחר הרכבת הביצית, כאשר מוט החיה פונה כלפי מעלה וחדיר, החלק את החדר למיקרוסקופ והתמקד בביצית באמצעות מטרה פי 4. לאחר מכן, חבטו את הביצית באלקטרודת V1 עם חישת מתח. לאחר מכן, עבור ליעד הטבילה במים פי 40.

התמקדו בקוטב החיות, הפונה כלפי מעלה. לאחר מכן, כבה את האור האדום. בחר את קוביית המסנן Anap על-ידי סיבוב צריח קוביית המסנן ויציאת היציאה האופטית המחוברת לפוטו-דיודה.

לאחר מכן, הפעל את מנורת הלוגן בעוצמה הגבוהה ביותר, ופתח את התריס למשך שתיים עד חמש שניות כדי לקרוא את עוצמת הקרינה ברקע שמקורה בביצית. לאחר מכן, הפעל את ה-clamp, הפוך את מתג האמבטיה/מגן למצב פעיל והתאם את פוטנציאל הממברנה לפוטנציאל הפקודה על ידי סיבוב הכפתור על הבמה הראשית. לאחר מכן, בחר את פוטנציאל ההחזקה, פרוטוקול הצעד, מספר ואורך הפולסים בתוכנת ההקלטה.

לאחר מכן, רשום את הזרמים התלויים במתח ואת עוצמות הקרינה של Anap. עבור VCF דו-צבעוני, בחר את קוביית המסנן TMR על ידי סיבוב צריח הקובייה. קרא את הקרינה ברקע עבור TMR, כמתואר עבור Anap, ורשום זרמים תלויי מתח ועוצמת הקרינה של TMR בו זמנית.

איור זה מציג אותות פלואורסצנטיים של Anap ו-TMR באמצעות פרוטוקולי צעדים המתקבלים מאותה ביצית המבטאת מוטציה של שייקר. על ידי הוספת ציסטאין, הנגיש מהתמיסה החיצונית, לרקע L382 stop W434F ותיוג שלו עם TMR maleimide, ניתן לחקור תנועות בזמן אמת באזורים שונים של אותו חלבון בו זמנית. יחסי מתח הקרינה מתקבלים על ידי התוויית עוצמת הקרינה במצב יציב כנגד מתח.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבטא חומצות אמינו פלואורסצנטיות לא טבעיות לביציות Xenopus וכיצד לבצע פלואורומטריה מהדק מתח בצבע אחד או בשני צבעים. ברגע שאתה שולט בטכניקה, זה אמור לקחת בערך את אותו פרק זמן כמו ניסויים אלקטרופיזיולוגיים מסורתיים, יש לך רק את הצעד הנוסף של הזרקת DNA לגרעין הביצית. כאשר מנסים הליך זה, חשוב לזכור לבדוק אם יש ביטוי דליפה בהיעדר חומצת אמינו לא טבעית.

זה צריך להיעשות עבור כל מוטציה, מכיוון שכמות ביטוי הדליפה תלויה באתר ההחדרה של קודון העצירה בתוך החלבון. טכניקה זו מאפשרת כעת לחוקרים לחקור שינויים קונפורמציוניים באתר הציטוזולי של החלבון, שבו מתרחשים רבים ממנגנוני הרגולציה.