מתח הידוק פלואומטריה ב

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להטמיע חומצת אמינו לא טבעית פלורסצנטית בחלבון ממברנה המובע בציטות של Xenopus, ולקבוע בו-זמנית את תפקוד החלבון ואת הסידור המבני שלו, באמצעות פלואורימטריה בבלימת מתח (voltage-clamp fluorometry). טכניקה זו תסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הקשרים בין מבנה לתפקוד של חלבוני ממברנה. באמצעות פלואורימטריה בבלימת מתח, אנו יכולים להקיים מתאם ישיר בין סידורים מבניים לבין תפקוד החלבון.

הוספת סימון של חומצות אמינו לא טבעיות פלואורסצנטיות מסייעת להתגבר על מגבלות קודמות של הסימון. מגבלות אלו היו הנגישות של אתרי הסימון וכן סימון רקע הנובע מאתרי קישור אנדוגניים. ההשלכות של טכניקה זו הן להבנה ביופיזית טובה יותר של חלבוני ממברנה, שכן כעת ניתן לבחון דומיינים אשר לא היו נגישים בעבר באמצעות פלואורומטריית מתח-קבוע (voltage-clamp fluorometry) מסורתית.

לאחר הסרה כירורגית של ביצי ה-Xenopus, שטפו את הביציות שלוש פעמים עם תמיסת SOS. בחרו ביציות גדולות ובריאות באופן פרטני, והדגרימו אותן בטמפרטורה של 18 degrees Celsius למשך ארבע שעות לפחות בתמיסת Barth המועשרת באנטיביוטיקה וב-5% horse serum לפני ההזרקה. להזרקה גרעינית של DNA, הכינו קצה הזרקה ארוך ודק כדי להגיע לגרעין מבלי לפגוע בביציות.

לאחר מכן, מלאו את קצה ההזרקה בשמן, והרכיבו את קצה ההזרקה על מכשיר הננו-מזרק (nanoinjector). לאחר מכן, התקינו את הננו-מזרק תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי ושברו את קצה הסיכה באמצעות פינצטה. לאחר מכן, דחפו את השמן החוצה עד שלא תישאר בועית אוויר כלואה בקצה הסיכה.

לאחר מכן, הניחו מיקרוליטר אחד של 0.1 microgram per microliter pAnap במים נקיים מנוקלאז (nuclease-free water) על פיסת Parafilm תחת מיקרוסקופ סטריאו, ומלאו את קצה מחט ההזרקה ב-DNA. לאחר מכן, העבירו את התאי ביצירה (oocytes) לכלי הזרקה עם רשת המכיל תמיסת Barth's בתוספת אנטיביוטיקה. מכיוון שגרעין התא נמצא בקוטב האנימלי (animal pole), כוונו את קצה מחט ההזרקה למרכז הקוטב האנימלי והחדירו אותה כך שהקצה יגיע קרוב למרכז ההמיספירה האנימלית.

בשלב הבא, מזריקים 9.2 nanoliters של תמיסת ה-pAnap לתוך הגרעין של כל אווציט. לאחר מכן, מדגרים את האווציטים בשני milliliters של תמיסת Barth המועשרת באנטיביוטיקה ו-5% horse serum בטמפרטורה של 18 degrees Celsius למשך שש עד 24 שעות, כדי לאפשר ביטוי חזק של tRNAs ו-tRNA synthetases ספציפיים ל-Anap. כעת, מכינים שוב את הננו-מזרק, אך הפעם קצה ההזרקה אינו חייב להיות דק כמו זה ששימש להזרקת ה-DNA.

החל משלב זה, יש לעבוד תחת אור אדום בלבד כדי למנוע פוטו-בליצ'ינג (photobleaching) של ה-Anap. ערבבו 1 µL של Anap בריכוז 1 mM עם 1 µL של mRNA בריכוז 1-2 µg/µL ישירות על פיסת Parafilm, ומלאו את קצה מחט ההזרקה בתמיסת התערובת. החדירו את הקצה אל הקוטב הצמיגי (vegetal pole) ממש מתחת לממברנה, והזריקו 46 nL מתמיסת התערובת לכל אווציט שהוזרק לו pAnap.

לאחר מכן, הגנו על התאי ביצער (oocytes) מאור על ידי הנחתם בקופסה אטומה לאור או על ידי עטיפת הבקית בנייר אלומיניום. דגרו אותם בתמיסת Barth's המעשירה באנטיביוטיקה וב-5% horse serum בטמפרטורה של 18 degrees Celsius למשך יומיים עד שלושה ימים. החליפו את התמיסה בתמיסת Barth's רעננה מדי יום, והסירו את התאי ביצער המתים כדי למנוע זיהום.

במעמד זה, ציוד בקרה של מתח (voltage-clamp) פתוח משולב במערכת של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. תא ההקלטה מותקן על גבי מגלשה המאפשרת את העברתו בין הסטריאוסקופ הסטנדרטי להצבת התא ביצה (oocyte) לבין המיקרוסקופ לביצוע מדידות פלואורסצנציה. מערכת זיהוי פוטודיודה מחוברת לפתח יציאת ה-C-mount של המיקרוסקופ הפלואורסצנטי, וקריאת זרם הפוטונים מחוברת לערוץ קלט שני במעבד אותות דיגיטלי.

נורה הלוגנית של 100-watt ו-12-volt משמשת כמקור אור לעירור הפלואורסצנציה. העירור נשלט באמצעות תריס מכני הממוקם בין מקור אור העירור לבין המיקרוסקופ. ההפעלה מופעלת באמצעות פולס TTL המגיע ממעבד אותות דיגיטלי, אשר תזמונו נקבע בתוכנת ההקלטה כך שהתריס נפתח כ-100 milliseconds לפני תחילת ההקלטה, ונדרש קוביית פילטר מתאימה במגדל קוביית הפילטרים.

עבור VCF בשני צבעים, דגרו את הביציות שהוכנו ב-TMR maleimide בריכוז five-micromolar בתמיסת סימון למשך 15 דקות מיד לפני ההקלטה. לאחר מכן, שטפו את הביציות עם תמיסת הסימון שלוש פעמים כדי להסיר עודפי צבע לפני ההקלטה. בשלב זה, החלבון מסומן באופן ספציפי בשני פלואורופורים שונים.

לאחר קיבוע הביצית, כאשר הקוטב החייתי פונה כלפי מעלה והמעטפת חדירה, החלק את התא אל המיקרוסקופ ומקד אותה באמצעות עדשה של 4X. לאחר מכן, דקור את הביצית באמצעות אלקטרודת V1 לחשיפת מתח. לאחר מכן, עבור לעדשת טבילה במים של 40X.

התמקדו בקוטב החייתי, הפונה כלפי מעלה. לאחר מכן, כבו את האור האדום. בחרו בקוביות המסנן Anap על ידי סיבוב צריח קוביית המסנן ובפתח היציאה האופטית המחוברת לפוטודיודה.

לאחר מכן, הדלק את מנורת ההלוג בעוצמה המקסימלית, ופתח את התריס למשך שתי עד חמש שניות כדי לקרוא את עוצמת הפלואורסצנציה של הרקע המגיעה מהביצית. לאחר מכן, הפעל את התפסן (clamp), העבר את מתג האמבט/מגן (bath/guard) למצב פעיל, וכוון את פוטנציאל הממברנה לפוטנציאל הפקודה על ידי סיבוב הכפתור בראש הבמה (headstage). לאחר מכן, בחר בתוכנת ההקלטה את פוטנציאל ההחזקה (holding potential), את פרוטוקול המדרגות, את מספר הפולסים ואת אורכם.

לאחר מכן, רשמו את הזרמים התלויים במתח ואת עוצמות הפלואורסצנציה של Anap. עבור VCF דו-צבעי, בחרו את קוביית המסנן של TMR על ידי סיבוב המגדל של הקובייה. קראו את הפלואורסצנציה של הרקע עבור TMR, כפי שמתואר עבור Anap, ורשמו בו-זמנית את הזרמים התלויים במתח ואת עוצמת הפלואורסצנציה של TMR.

איור זה מציג אותי פלואורסצנציה של Anap ו-TMR באמצעות פרוטוקולים מדורגים שהתקבלו מאותה ציטה המבטאת מוטציה של Shaker. על ידי הוספת ציסטאין, הנגיש מהתמיסה החיצונית, לרקע של L382 stop W434F וסימונו באמצעות TMR maleimide, ניתן לבחון תנועות בזמן אמת באזורים שונים של אותו חלבון בו-זמנית. הקשר בין הפלואורסצנציה למתח מתקבל על ידי שרטוט עוצמת הפלואורסצנציה במצב יציב מול המתח.

לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של אופן הביטוי של חומצות אמינו פלואורסצנטיות לא טבעיות בתוך ציטות של Xenopus, וכיצד לבצע פלואורומטריה בשיטת Voltage-clamp בצבע אחד או בשני צבעים. ברגע שתשלטו בטכניקה, היא אמורה לדרוש בערך את אותה כמות זמן כמו ניסויי אלקטרופיזיולוגיה מסורתיים, למעט השלב הנוסף של הזרקת DNA לגרעין הציטה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לבדוק את קיומו של ביטוי דליפה (leak expression) בהיעדר החומצה האמינוית הלא טבעית.

יש לבצע זאת עבור כל מוטציה, כיוון שכמות ביטוי הדליפה תלויה באתר ההכנסה של קודון העצירה בתוך החלבון. טכניקה זו מאפשרת כעת לחוקרים ללמוד שינויים קונפורמציוניים באתר הצוליוטרי של החלבון, שבו מתרחשים רבים מהמנגנונים הרגולטוריים.