Name: מתח הידוק פלואומטריה ב קסנופוס ביציות באמצעות חומצות אמינו פלואורסצנטי לא טבעי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: למד מתח הידוק פלואומטריה משופרת בביצי Xenopus באמצעות חומצות אמינו פלואורסצנטיות לא טבעיות. שיטה זו מאפשרת מדידה סימולטנית של זרם ופלואורסצנציה לחקר שינויים מבניים בערוצי יונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

PAnap היה מתנה אדיבה של ד&quot;ר פיטר שולץ (מכון המחקר Scripps). עבודה זו מומנה על ידי המכון הקנדי לבריאות מענקי מחקר MOP-102689 ו MOP-136894 (ל RB) וקרן קנדה למענק חדשנות 950-225005.

מניפולציות של צפרדעים בוצעו בהתאם להנחיות הקנדיות ואושרו על ידי ועדת האתיקה (CDEA, פרוטוקול מס &#39;15-042) של אוניברסיטת מונטריאול. 1. mRNA הכנה עבור FUAA התאגדות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אתר מעניין של חלבון שבו שינויים קונפורמטיביים צפויים להתרחש. בחר חומצת אמינו באזור זה כדי להחליף את fUAA. הערה: בחירת המיקום מבוססת על ההסדרים המבניים הצפויים. אם קיים מבנה בעל רזולוציה גבוהה והשערה של התנועות הצפויות, יש להציב את האנאפ כך שהסביבה הכימית תשתנה; זה עשוי להיות שינוי בקבוע דיאלקטרי (הידרופובי לעומת הידרופילי) או, סביר יותר, מרווה על ידי חומצת אמינו אחרת. מיטב quenchers הם tryptophans. אנאפ צריך להיות במגע עם quencher במדינה אחת (חפיפה של רדיד ואן- der-Waals) ו חינם ממנוהאחר. אם אין מבנים ברזולוציה גבוהה או מודלים קיימים, אחד יצטרך לסרוק את האזור של עניין. בכל מקרה, רצוי לבחור מספר מקומות בקרבת מקום כדי להגדיל את ההסתברות לקבל ביטוי אות הקרינה. על מנת למזער את ההשפעות הסטריות במהלך התבגרות החלבון ו / או הפונקציה, ניתן לבחור להחליף חומצות אמינו גדולות וארומטיות (Phe, Trp, Tyr). המחברים, לעומת זאת, חוו כי סריקה אזור עניין עבור הכניסה fUAA ללא קשר חומצה אמינית תחליף, הוא פרודוקטיבי יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס קודון לעצור ענבר (TAG) באתר הנבחר באמצעות mutagenesis מכוונת האתר 15 . ודא כי חלבון של עניין אינו מסתיים על קודון לעצור ענבר (TAG). אם כך, מוטציה אחרת (אוקר או אופל להפסיק קודון). להגביר, לבודד את רצף ה- DNA. להשיג חלבון mRNA עם שעתוק במבחנה 16 ולאחסן את mRNA ב 20 מעלות צלזיוס או 80 מעלות צלזיוס. </li> &lt;/ Ol&gt; 2. הכנה ביצית הזרקת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כירורגי להשיג ביציות שלב V או VI מ Xenopus laevis צפרדעים defolliculate עם collagenase כפי שתואר לעיל 17 . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים צפרדעים עם הרדמה מתאימה על פי פרוטוקול חיה מאושר (כאן: 3-aminobenzoic חומצה אתיל אסתר). כאשר הם נכשלים להגיב קמצוץ עדין על קצה האצבע (אובדן רפלקס נסיגה), אז הם הרדימו כראוי לניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד להסיר את הצפרדעים מן הפתרון הרדמה ולשטוף ביסודיות את העור במים מתוקים. שטיפה זו תמנע את החיה ליפול לרמות עמוקות יותר של הרדמה על ידי הסרת כימית unabsorbed מפני העור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר צמתים השחלה מצד אחד כירורגי בזהירות לפתוח את הצמתים באמצעות שני מלקחיים. דגירה ו לגרות ביציות ב &quot;פתרון ביצית תקן&quot; (SOS) המכיל 1% (w / v) collagenase עבור 20-30 דקותכדי defolliculate. לשטוף שלוש פעמים עם פתרון SOS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר ביציות גדולות ובריאות באופן אישי ו דגירה אותם הפתרון של בארת &#39;בתוספת אנטיביוטיקה (100 U / מ&quot;ל ​​פניצילין, סטרפטומיצין 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל, 10 מ&quot;ג / 100 מ&quot;ל קנמיצין) ו 5% בסרום בסרום 18 מעלות לפחות 4 שעות לפני ההזרקה . הערה: לאחר 2 - 4 ניתוחים עם עיכוב של 4 חודשים בין, Xenopus laevis הם מורדמים על ידי הדגירה ממושכת (&gt; 1 h) עם 3-aminobenzoic חומצה אתיל אסתר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הזרקה גרעינית של DNA, להכין קצה הזרקת דק ורזה כדי להיות מסוגל להגיע לגרעין כדי למנוע נזק הביצית. ממלאים את קצה הזרקת עם שמן הר אותו על המכשיר nanoinjector. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקן את ננו מזרק תחת מיקרוסקופ סטריאו להשתמש מלקחיים כדי לשבור את קצה הקצה. הוצא שמן עד שאין בועות אוויר לכודים בתוך קצה הקצה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 1 μL של 0.1 מיקרוגרם / &amp;# 181; L pAnap במים nuclease ללא המכיל NaOH (1% של 1 N NaOH) על פיסת parafilm תחת stereoscope ולמלא את קצה הזרקת עם ה- DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 40 ביציות לצלחת הזרקת מצופה רשת המכילים פתרון של בארת בתוספת אנטיביוטיקה. הערה: כדי להפוך את צלחת הזרקת מצופה רשת, לחתוך חתיכת בגודל מתאים של 800 מיקרומטר רשת ניילון למלא צלחת פטרי קלקר. הוסף כלורופורם למרכז ולאחר מכן למקם את הרשת למעלה. החזק את רשת שטוח עד הפלסטיק מגדיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו הגרעין הביצית ממוקם בקוטב החיה (כהה), לכוון את קצה ההזרקה במרכז מוט החיה לדלד כך קצה להגיע ליד מרכז של חצי הכדור החיה (או 2-3x את עומק לעומת הזרקת רנ&quot;א ). להזריק 9.2 nL של pAnap לתוך הגרעין של כל ביצית. קצה דק וקצב הזרקה קטן עלול לגרום הזרקת לא סדיר או קצה חסום. מדי פעם לבדוק אם הזרקת עובד על ידי הזרקת לאוויר. הערה: אם הדנ&quot;א מזריק כראוי לתוך הגרעין הוא לא ברור. צפו ולכן 10 - 40% ביציות לא להביע את זוג tRNA / synthetase. ראה דיון לפרט נוסף. </li></ol><img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55598/55598fig2.jpg" /> איור 2 : איור של דנ&quot;א ו- RNA הזרקה לתוך ביציות Xenopus עבור התאגדות אנאפ. ראשית, pAnap מוזרק לתוך הגרעין של הביצית Xenopus ( 1 ). לאחר 6-24 שעות, Anap ואת ערוץ רנ&quot;א הם coinjected לתוך מוט הצמח ( 2 ). Anap יהיה אורתוגונלית aminoacylated עם tRNA נושאת לעצור ענבר אנטי קודון, על ידי synethtase aminoacyl-tRNA אשר מקודד על ידי pAnap. בדרך זו, amina-tRNAs aminoacylated מזוהים על ידי הריבוזום על קודון לעצור הענבר מוכנס ב התקשרL RNA, וכתוצאה מכך דיכוי של קודון להפסיק והכנסת Anap. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55598/55598fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ביציות בפתרון 2 מ&quot;ל Barth בתוספת אנטיביוטיקה סרום 5% סוס (HS) ב 18 מעלות צלזיוס למשך 6-24 שעות כדי לאפשר ביטוי חזק של tRNAs ספציפיים ANAP ו synthtases tRNA. הערה: זמן הדגירה DNA יכול להימשך מספר ימים לפני הזרקת רנ&quot;א, אבל זה לא להגביר את הביטוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מזרק ננו עבור הזרקת רנ&quot;א (כמו צעד 2.2 אבל את הזרקת קצה לא צריך להיות רזה כמו הזרקת דנ&quot;א). עבודה רק תחת אור אדום מנקודה זו כדי למנוע photobleaching של Anap. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 1 μL של 1 מ&quot;מ אנאפ עם 1 μL של 1-2 מיקרוגרם / μL mRNA ישירות על פיסת parafilm ולמלא את קצה הזרקת עם הפתרון המעורב. אימפל מתחת לממברנה בצמח(בהיר) מוט ולהזריק 46 nL בכל ביצית מוזרק pAnap. הערה: הריכוז הנדרש mRNA תלוי בחלבון של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ביציות מוגן מפני אור בתיבה או עטוף בנייר אלומיניום, פתרון של בארת &#39;בתוספת אנטיביוטיקה 5% בסרום בסרום ב 18 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים. שערי עם פתרון של בארת &#39;טרי כל יום ולהסיר ביציות מתים כדי למנוע זיהום. </li></ol> 3. הגדרת VCF <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקן את הציוד המתחבר ביצי מתח, כפי שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר את מערכת הקלטה electrophysiology על מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף על ידי התקנת תא ההקלטה על המחוון המאפשר להעביר את זה בין stereoscope סטנדרטי עבור הצבת הביצית ואת המיקרוסקופ לבצע מדידות הקרינה ( איור 2 ג ). הערה: הגיאומטריה של החדר לחתוך ביציות פתוח אינו מתאים לשימוש tra רגילההדלקת אור להארה במהלך מניפולציה. לכן, מנורת הלוגן &quot;gooseneck&quot; עם מסנן אדום משמש להאיר הצדה מלמעלה. הקבל של המיקרוסקופ ניתן להסיר את החלל כדי להנמיך את הבמה עבור תא electrophysiology. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיבור מערכת גילוי photodiode ליציאת היציאה C- הר של מיקרוסקופ פלואורסצנטי ( איור 2 א ). לחבר את readout פוטו אל ערוץ קלט השני מעבד אותות דיגיטליים (DSP, אנלוגי / דיגיטלי - דיגיטלי / ממיר אנלוגי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 100 W, מנורת הלוגן 12 V כמקור אור עבור עירור פלואורסצנטי. הערה: לחלופין, ניתן להשתמש במבערי HG, אך יש להפחית את עוצמתם כדי למנוע צילום מהיר מדי במהלך ההקלטות. תאורת LED מומלצת רק אם נוריות LED בהתאמה להראות עוצמה משמעותית בטווח עירור ( למשל, ~ 350 ננומטר עבור Anap). רוב נוריות LED הלבנות לא מגיעים רחוק לתוך הספקטרום UV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> InsErt תריס מבוקרת חשמלית בין מקור האור עירור מיקרוסקופ ולחבר את השליטה שלה (בדרך כלל TTL- הדופק) כדי פלט דיגיטלי של DSP. זמן הדופק TTL בתוכנת ההקלטה (עיין בתיעוד היצרן), כך שהתריס ייפתח ~ 100 אלפיות השנייה לפני תחילת ההקלטה. בדרך זו, כל הרטט במהלך תהליך הפתיחה אינו מפריע להקלטה. הזמן תלוי במהירות ורטט של התריס. סיים את 5 הדופק לפני סוף ההקלטה, כפי שמוצג באיור 4 . בדרך זו, הערך עבור הקרינה הכולל נרשם גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס קוביית מסנן מתאים (מסנן עירור, המראה dichroic ו מסנן פליטה) של הצריח קוביה מסנן. עבור Anap, השתמש Expass: 377/50 nm bandpass, dichroic 409 nm longpass, ו: 470/40 nm bandpass. </li></ol><img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55598/55598fig3.jpg" /> איור 3<html> / Strong&gt; : הגדרת VCF. ( A ) בצד תצוגת VCF מראה את הנתיב האור בתוך המיקרוסקופ. קוביית המסנן מכילה מסנן עירור, מראה דיכרואי ומסנן פליטה. ( B ) נבחרים מימדים תאיים הביצית הם 3.4 ס&quot;מ עבור רדיוס החדר העליון (1), 5.5 ס&quot;מ אורך החדר התחתונה (2), 1.4 ס&quot;מ עבור רוחב החדר התחתונה (3) ו 1.7 ס&quot;מ עבור רוחב החדר האמצעי (4). ( ג ) תצוגה קדמית של הגדרת VCF. הראשון ocular בצד שמאל הוא הרכבה את הביצית בתא פתוח לחתוך מתח מהדק עבור permeabilization. ואז, החדר הוא החליק מתחת למיקרוסקופ בעין השנייה ימינה. כאן, האלקטרודה V1 מוכנס לתוך הביצית באמצעות המטרה 4X, פלואורסצנטי נרשם באמצעות המטרה 40X מים טבילה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55598/55598fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> Itle &quot;&gt; 4. הקלטה VCF <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את השלבים הכנה לחתוך לפתוח ביצית מתח מלחציים כפי שתואר לעיל דמיינו 18 (הכנה גשר אגר, הרכבה ביצית, permeabilization saponin). עם זאת, עבודה תחת אור אדום בכל עת, כדי למנוע הלבנת fluorophore לפני הקלטות. בעת הנחת הביצית, ודא כי מוט החיה פונה כלפי מעלה. פיגמנטציה תחת קרום המוטות מוט בעל חיים נגד autofluorescence שמקורם cytosol ולכן מפחית הקרינה רקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלק את החדר אל המיקרוסקופ ולהתמקד באמצעות המטרה 4X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את הביצית עם מתח V1 אלקטרודה חישה (3 M KCl), לעבור למים טבילה 40X (NA 0.8 - 0.9) המטרה. דגש על מוט החיה אשר פונה כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את האור האדום. בחר את קוביית המסנן המתאימה על-ידי סיבוב הצריח הקובני של המסנן ויציאת היציאה האופטית המחוברת לפוטודיודה. הפעל את הלוגEn המנורה בעוצמה הגבוהה ביותר ו לעבור את הצמצם פתוח עבור 2-5 s כדי לקרוא את עוצמת הקרינה רקע שמקורה הביצית. עם ההתקנה המתוארת הערך צריך להיות סביב 50-200 הרשות הפלסטינית עבור Anap. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדליק את מהדק, להעיף את האמבטיה / השומר לעבור פעיל ולהתאים את פוטנציאל הממברנה (V1 - V2) לפוטנציאל הפקודה על ידי סיבוב הכפתור על headstage אני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר להחזיק פוטנציאל, שלב פרוטוקול, מספר ואורך של פולסים וכו &#39;בתוכנת ההקלטה. שיא מתח תלוי זרמים ועוצמות הקרינה אנאפ. </li></ol> 5. שני צבעים VCF <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לפקח על שני מיקומים באותו חלבון בו זמנית, מוטציה חומצה אמינו תאית ונגישה לתוך ציסטאין, ולהסיר ציסטאין אחרים כדי להבטיח תיוג ספציפי עם כימיה טיול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את שלב 2.1-2.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הקלטות VCF, דגירה ביציות ב 5 מיקרומטר TMR-maleimide ב תיוג פתרון במשך 15 דקות (או צבע אחרעם ספקטרה שאינה חופפת בהשוואה ל- Anap). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הביציות עם פתרון תיוג שלוש פעמים כדי להסיר צבע עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את שלב 4.1-4.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס קוביית מסנן מתאים TMR (מסנן עירור, המראה dichroic מסנן פליטה) של הצריח קוביית מסנן. החלף את הקובייה TMR מסנן על ידי סיבוב הצריח מסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרא את הקרינה רקע TMR כמתואר Anap בשלב 4.4. הערה: תיוג עם כימיה thiol תוצאות ברקע רקע גבוה עקב תיוג unspecific בקרום. לכן, הקרינה רקע TMR עשוי להרוות את מגבר (&gt; 2,000 pA). במקרה זה, לא להקטין את עוצמת האור, אבל פשוט להפחית את הקרינה רקע על ידי הוספת היסט היסט לפוטודיודה. במערכות הזמינות מסחרית להשתמש &quot;דגימה והחזק&quot; תכונה על מערכת גלאי. הערה ערך הקרינה רקע (באמצעות מסנן צפיפות 10X ניטרלי) במעבדה jOurnal, כמו ערך זה לא יירשמו (הרוויה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיא מתח תלוי זרמים ועוצמות הקרינה TMR בו זמנית כמו בשלב 4.6. </li></ol>

<ol><li>Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+physical+measure+of+conformational+rearrangement+underlying+potassium+channel+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating.</a> Science. 271 (5246), 213-216 (1996).</li>
<li>Kalstrup, T., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+internal+pore+opening+in+K%28V%29+channels+probed+by+a+fluorescent+unnatural+amino+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dynamics of internal pore opening in K(V) channels probed by a fluorescent unnatural amino acid.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (20), 8272-8277 (2013).</li>
<li>Xiao, H., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((At+the+Interface+of+Chemical+and+Biological+Synthesis%3A+An+Expanded+Genetic+Code%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">At the Interface of Chemical and Biological Synthesis: An Expanded Genetic Code.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (9), (2016).</li>
<li>Blunck, R. Chapter 9. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBlunck%2C+R+%22Handbook+of+Ion+Channels%22">Handbook of Ion Channels</a>. , CRC Press. 113-133 (2015).</li>
<li>Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+fluorescent+probe+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells.</a> J Am Chem Soc. 135 (34), 12540-12543 (2013).</li>
<li>DeBerg, H. A., Brzovic, P. S., Flynn, G. E., Zagotta, W. N., Stoll, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Energetics+of+Allosteric+Regulation+of+HCN2+Ion+Channels+by+Cyclic+Nucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure and Energetics of Allosteric Regulation of HCN2 Ion Channels by Cyclic Nucleotides.</a> J Biol Chem. 291 (1), 371-381 (2016).</li>
<li>Shen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoding+unnatural+amino+acids+in+neural+stem+cells+and+optically+reporting+voltage-sensitive+domain+changes+in+differentiated+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons.</a> Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).</li>
<li>Aman, T. K., Gordon, S. E., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+CNGA1+Channel+Gating+by+Interactions+with+the+Membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of CNGA1 Channel Gating by Interactions with the Membrane.</a> J Biol Chem. 291 (19), 9939-9947 (2016).</li>
<li>Haddad, G. A., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mode+shift+of+the+voltage+sensors+in+Shaker+K%2B+channels+is+caused+by+energetic+coupling+to+the+pore+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mode shift of the voltage sensors in Shaker K+ channels is caused by energetic coupling to the pore domain.</a> J Gen Physiol. 137 (5), 455-472 (2011).</li>
<li>Batulan, Z., Haddad, G. A., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intersubunit+interaction+between+S4-S5+linker+and+S6+is+responsible+for+the+slow+off-gating+component+in+Shaker+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">An intersubunit interaction between S4-S5 linker and S6 is responsible for the slow off-gating component in Shaker K+ channels.</a> J Biol Chem. 285 (18), 14005-14019 (2010).</li>
<li>Kusch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+subunits+cooperate+in+cAMP-induced+activation+of+homotetrameric+HCN2+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">How subunits cooperate in cAMP-induced activation of homotetrameric HCN2 channels.</a> Nat Chem Biol. 8 (2), 162-169 (2012).</li>
<li>Lee, H. S., Guo, J., Lemke, E. A., Dimla, R. D., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+incorporation+of+a+small%2C+environmentally+sensitive%2C+fluorescent+probe+into+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Genetic incorporation of a small, environmentally sensitive, fluorescent probe into proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Am Chem Soc. 131 (36), 12921-12923 (2009).</li>
<li>Summerer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+fluorescent+amino+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded fluorescent amino acid.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (26), 9785-9789 (2006).</li>
<li>Kalstrup, T., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reinitiation+at+non-canonical+start+codons+leads+to+leak+expression+when+incorporating+unnatural+amino+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Reinitiation at non-canonical start codons leads to leak expression when incorporating unnatural amino acids.</a> Sci Rep. 5, 11866(2015).</li>
<li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+one-step+site-directed+deletion%2C+insertion%2C+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC Biotechnol. 8, 91(2008).</li>
<li>Beckert, B., Masquida, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+RNA+by+in+vitro+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthesis of RNA by in vitro transcription.</a> Methods Mol Biol. 703, 29-41 (2011).</li>
<li>Goldin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+Xenopus+laevis+and+oocyte+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Maintenance of Xenopus laevis and oocyte injection.</a> Methods Enzymol. 207, 266-279 (1992).</li>
<li>Rudokas, M. W., Varga, Z., Schubert, A. R., Asaro, A. B., Silva, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xenopus+oocyte+cut-open+vaseline+gap+voltage-clamp+technique+with+fluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The Xenopus oocyte cut-open vaseline gap voltage-clamp technique with fluorometry.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li>
<li>Zhao, J., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolated+voltage+sensing+domain+of+the+Shaker+potassium+channel+forms+a+voltage-gated+cation+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">The isolated voltage sensing domain of the Shaker potassium channel forms a voltage-gated cation channel.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Posson, D. J., Ge, P., Miller, C., Bezanilla, F., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+vertical+movement+of+a+K%2B+channel+voltage+sensor+measured+with+luminescence+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Small vertical movement of a K+ channel voltage sensor measured with luminescence energy transfer.</a> Nature. 436 (7052), 848-851 (2005).</li>
<li>Chanda, B., Asamoah, O. K., Blunck, R., Roux, B., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gating+charge+displacement+in+voltage-gated+ion+channels+involves+limited+transmembrane+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Gating charge displacement in voltage-gated ion channels involves limited transmembrane movement.</a> Nature. 436 (7052), 852-856 (2005).</li>
<li>Taraska, J. W., Puljung, M. C., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-distance+probes+for+protein+backbone+structure+based+on+energy+transfer+between+bimane+and+transition+metal+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Short-distance probes for protein backbone structure based on energy transfer between bimane and transition metal ions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16227-16232 (2009).</li>
<li>Baker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+fluorescent+sensors+of+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded fluorescent sensors of membrane potential.</a> Brain Cell Biol. 36 (1-4), 53-67 (2008).</li>
<li>Miranda, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State-dependent+FRET+reports+calcium-+and+voltage-dependent+gating-ring+motions+in+BK+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">State-dependent FRET reports calcium- and voltage-dependent gating-ring motions in BK channels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).</li>
<li>Sisido, M., Ninomiya, K., Ohtsuki, T., Hohsaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four-base+codon%2Fanticodon+strategy+and+non-enzymatic+aminoacylation+for+protein+engineering+with+non-natural+amino+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Four-base codon/anticodon strategy and non-enzymatic aminoacylation for protein engineering with non-natural amino acids.</a> Methods. 36 (3), 270-278 (2005).</li>
<li>Hohsaka, T., Ashizuka, Y., Murakami, H., Sisido, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five-base+codons+for+incorporation+of+nonnatural+amino+acids+into+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Five-base codons for incorporation of nonnatural amino acids into proteins.</a> Nucleic Acids Res. 29 (17), 3646-3651 (2001).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ב aminoacylation in vivo של tRNAs אשר מתמשכים ברציפות יחד עם tRNA-synthetase, מאפשר להשיג רמות ביטוי גבוהות מדידות הקרינה. עבור שילוב FUAA יעיל, זה קריטי כי pAnap מוזרק כראוי לתוך הגרעין. בשל חוסר הוודאות של המיקום המדויק של הגרעין, 10-40% מהזרקת ה- DNA צפויים להיכשל, וכתוצאה מכך לא הביעו ביציות (או דליפות-הביעו) ביציות. לכן, חשוב לבדוק את הביטוי בהעדר Anap ו pAnap לזהות פנוטיפים הנוכחי ואת הגדלים במקרה של ערוצי דליפה. בדרך זו, ניתן להבחין ביציות עם זריקות דנ&quo...

מעל 200 חומצות אמינו לא טבעיות של תכונות כימיות ופיסיקליות שונות שולבו גנטית בחלבונים בתאי E. coli , שמרים ותאי יונקים 3 . חומצת האמינו הלא טבעית משולבת בתגובה לקודון עצירה מסוים באמצעות זוג tRNA אורתוגונלי מהונדס / synthetase. הגישה הגנטית לשינוי חלבונים סיפקה תובנות חשובות על מבנה החלבון ותפקודו. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש מתח פלמורומטריה (VCF) בשילוב עם UAA פלואורסצנטי. ב VCF, תצפית בו זמנית של נתונים פונקציונליים סידורים מבניים מקומי סביב בדיקה ניאון (~ 5 Å) מאפשר לנו להשיג מידע דינמי עם רזולוציה millisecond 1 . בדיקות פלואורסצנט לשנות מצב מרווה שלהם על התנועה המקומית של החלבון. תנועה של 1-2 רק מספיק כדי להוביל לשינויים משמעותיים הקרינהאינטנסיביות 4 . לאחר זיהוי של אתר של עניין בחלבון היעד, האתר הוא מוטציה על ידי מוטציה נקודה. באופן קלאסי, שאריות היה מוטציה על ציסטאין ואילו עכשיו, קודון להפסיק ענבר (TAG) הוא הציג עבור fUAA שילוב גנטי. החלבון הוא אז במבחנה transcribed. בעוד מערכות ביטוי אחרות ( למשל, תאים יונקים) ניתן להשתמש 5 , 6 , 7 , ביציות Xenopus עדיפים על מבנה מבנה מחקרים בגלל גודל גדול שלהם, המוביל מניפולציה קלה יותר עוצמת הקרינה גבוהה יותר (fluorophores) ולכן, רעש. יתר על כן, ביציות Xenopus יש רקע נמוך מן החלבונים אנדוגני 2 , 8 , ואת פיגמנטציה כהה על המגן מוטות חיית נגד רקע הקרינה מהוא cytosol. ביציות Xenopus הם הוסרו כירורגית קידוד דנ&quot;א tRNA אורתוגונליים / זוג tRNA-synthetase ספציפי עבור FUAA מוזרק לגרעין של הביציות. לאחר זמן הדגירה 6-24 שעות, RNA חלבון הוא שיתוף מוזרק עם FUAA לתוך cytosol של ביציות, ואחריו 2-3 ימים הדגירה תקופה. על מנת למנוע כל נזק fUAA (photobleaching), נהלים כולל אנאפ צריך להתבצע תחת אור אדום כדי למנוע עירור fluorophore. ביציות נלמדים על חיתוך פתוח ביצית מתח ההתקנה, אשר מותקן על מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף, זרם חשמלי ושינויים הקרינה נרשמות בו זמנית 9 , 10 . לחלופין, שני אלקטרודה מתח מהדק 1 או תיקון תצורת מהדק 11 ניתן להשתמש. הקרינה נרגשת לאורכי גל מתאימים עם רעש RMS נמוך<html> פליטה שנרשמה באמצעות photodiode מקושר למגבר עם הגברה גבוהה. ישנם מספר יתרונות של שימוש פלואורסצנטי חומצות אמינו לא טבעיות (fUAAs) ב-מלחציים פלמפומטריה. האחד הוא גישה לצד cytosolic של חלבונים הממברנה; תהליכים רגולטוריים רבים נמצאים כאן ( למשל, Ca 2 + - או אתרי מחייב נוקליאוטידים, איטום מהיר וסגור המדינה של ערוצי יון מגודרת מתח, פתיחת הנקבוביות, צימוד מודול). כל התהליכים הללו נגישים כעת עבור תיוג פלואורסצנטי. יתרון נוסף הוא גודל קטן של בדיקה המוביל פחות הפרעה של החלבון. עד כה, שני אורתוגונליים tRNA / tRNA זוגות synthetase עבור fUAAs כבר מהונדסים 12 , 13 , שם 3- (6-acetylnapthalen-2-ylamino) -2-aminopropanoic חומצה (Anap) הוא FUAA רק אשר שימש ביציות Xenopus 2 ,&quot;Xref&quot;&gt; 8. Anap הוא fluorophore רגיש לסביבה עם משקל מולקולרי של 272.3 גרם / מול והוא רק מעט גדול יותר Tryptophan 12 ( דמויות 1A, 1B ). בשל גודלו הקטן, השפעות סטיות פחות צפויים להיות מיוצגים על ידי fluorophore לעומת fluorophores קונבנציונאלי המצורפת באמצעות מקשר (בדרך כלל יותר מ 500 g / mol). יתר על כן, במקרה של Anap, fluorophore ממוקם קרוב יותר עמוד השדרה חלבון מאשר אלה הקשורים ציסטאין, וכתוצאה מכך, Anap הוא חיטוט סידורים מקומיים יותר. לבסוף, הסרת ציסטאין אנדוגני ב VCF קונבנציונאלי על מנת להבטיח תיוג אתר ספציפי כבר לא דרישה UAA-VCF ולכן (i) משאיר את החלבונים ב (כמעט) המדינה שלהם יליד (ii) מאפשר VCF להיות מיושם כדי ללמוד מגוון רחב יותר של חלבונים בהם פונקציה עשויה להשתנות על ידי החלפת ציסטאין. <img alt="איור 1" srC = &quot;/ files / ftp_upload / 55598 / 55598fig1.jpg&quot; /&gt; איור 1 : Anap ו פלואורסצנטי ספקטרה. ( א ) המבנה הכימי של אנאפ. ( ב ) ספקטרום ספיגה מנורמל ספקטרום פליטה עבור 1 ננומטר אנאפ, המדגים את הרגישות של הקרינה אנאפ כדי הידרופובייה ממס. ספקטרום פליטה התקבלו על ידי מרגש ב 350 ננומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55598/55598fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> החיסרון של שימוש UAAs פלואורסצנטי הוא אוכלוסייה הטרוגנית של חלבונים עלולה לנבוע מקריאת קודון להפסיק, reinitiation translational, C- מסוף חתכים מקוצצים או crosstalk עם aminoacylation אנדוגני אם כמות tRNAs aminoacylated הוא נדיר. ביטוי דליפה כזה צריך תמיד להיות בדק עבור בהעדר fUAA ו tRNA / tRNA זוג synthetase. התייחסנו לסוגיית הטרנסLational reinitiation וכיצד לעקוף אותו עבור N- מסוף אתרי הכניסה בעבר 14 . עם זאת, כאשר fUAA, tRNA ו tRNA synthetase נמצאים בכמויות רווי, נותרה רק הסתברות נמוכה של ביטוי דליפה. ההבדל הפרוצדוראלי העיקרי בין FUAA-VCF לבין VCF קונבנציונאלי הוא הזרקת וטיפול ביציות; הזרקת דנ&quot;א קידוד tRNA ו tRNA synthetase (pAnap) ואחריו המבוא של Anap, אשר גם שיתוף מוזרק עם mRNA חלבון או לחלופין הוסיף פתרון הדגירה כמו אסתר acetoxymethyl (AM).

<table><tbody><tr><td>Solutions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Barth's solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>90 מ"מ</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td>3 מ"מ</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-9397</td><td>0.82 mM</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-7902</td><td>0.41 mM</td></tr><tr><td>Ca(NO3)2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1396</td><td>0.33 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>5 מ"מ</td></tr><tr><td>NaOH הידראט</td><td>BDH</td><td>BDH7225-4</td><td>pH 7.6</td></tr><tr><td>פניצילין</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td>100 יח'/מ"ל</td></tr><tr><td>סטרפטומיצין</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td>100 ומיקרו; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>קנמיצין</td><td>Invitrogen</td><td>15160054</td><td>10 מ"ג/100 מ"ל</td></tr><tr><td>סרום סוסים (HS)</td><td>Invitrogen</td><td>16050122</td><td>5%</td></tr><tr><td><חזק>SOS תמיסת ביציות סטנדרטית</חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>746398</td><td>102 מ"מ</td></tr><tr><td>KCl</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>746436</td><td>3 מ"מ</td></tr><tr><td>MgCl<תת>2</תת></td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M9272</td><td>1 מ"מ</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H4034</td><td>5 מ"מ</td></tr> <tr><td><חזק>תמיסת הקלטה חיצונית</חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-מתיל-D-גלוקמין (NMDG)</td><td>אלפא אסאר</td><td>L14282</td><td>115 מ"מ</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>סיגמא-אולדריץ</td><td>' H4034</td><td>10 מ"מ</td></tr><tr><td>סידן הידרוקסיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>239232</td><td>2 מ"מ</td></tr><tr><td>MES הידראט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>258105</td><td>pH 7.2</td></tr><tr><td><חזק>תמיסת הקלטה פנימית</חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-מתיל-D-גלוקמין (NMDG)</td><td>אלפא Aesar</td><td>L14282</td><td>115 מ"מ</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>10 מ"מ</td></tr><tr><td>חומצה אתילנדיאמין טטראצטית (EDTA)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>E478-500</td><td>2 מ"מ</td></tr><tr><td>MES הידראט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>258105</td><td>pH 7.2</td></tr><tr><td><תמיסת תיוג חזקה>חזקה</חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250-1</td><td>115 מ"מ</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H4034</td><td>10 מ"מ</td></tr><tr><td>סידן הידרוקסיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>239232</td><td>2 מ"מ</td></tr><tr><td>MES הידראט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>258105</td><td>pH 7.2</td></tr><tr><td><חזק>TMR תמיסת מלאי </חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>טטרמתילרודמין-5-מלימיד (TMR)</td> <td>בדיקות מולקולריות מאת Life Technologies</td><td>T6027</td><td>5 מ"מ ב-DMSO</td></tr><tr><td><תמיסת מלאי חזקה>אנאפ</חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אנאפ</td><td>אבזנה (TCRS)</td><td>סינתזה מותאמת אישית TCRS-170</td><td>1 מ"מ במים נטולי נוקלאז ו-1% NaOH 1 N</td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק><</td><td>חזק>הערות</חזק></td></tr><tr><td><חזק>חומר/ציוד</חזק> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pAnap</td><td>Addgene</td><td>48696</td><td></td></tr><tr><td>מהדק ביציות בעל ביצועים גבוהים</td><td>תאגיד דגן</td><td>CA-1B</td><td></td></tr><tr><td>Gpatch תוכנת רכישה</td><td>המחלקה להרדמה, אוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח</td><td>המחלקה להרדמה, אוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תא הקלטה</td> מערכת זיהוי דיודות צילום <td>במכונה</td><td></td><td></td>מותאמת אישית</tr><tr><td></td><td>תאגיד דגן</td><td>PhotoMax-200/PIN</td><td></td></tr><tr><td>נהג תריס חשמלי</td><td>UNIBLITZ</td><td>VCM-D1</td><td></td></tr></tbody></table>

מתח הידוק פלואומטריה ב<em&gt; קסנופוס</em&gt; ביציות באמצעות חומצות אמינו פלואורסצנטי לא טבעי

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

מתח- Clamp Fluorometry (VCF) כבר טכניקה של בחירה כדי לחקור את המבנה ואת הפונקציה של חלבונים ממברנה electrogenic שבו בזמן אמת מדידות של פלואורסצנטי וזרמים בו זמנית לדווח על הסדרים מקומיים ופונקציה גלובלית, בהתאמה 1 . בעוד טכניקות מבניות ברזולוציה גבוהה, כגון מיקרוסקופ קרינה אלקטרונים או קריסטלוגרפיה רנטגן לספק תמונות סטטיות של חלבונים המעניינים, VCF מספק נתונים מבניים דינמיים המאפשר לנו לקשר את הסדרים מבניים (פלואורסצנציה) לנתונים פונקציונליים דינמיים (electrophysiology). עד לאחרונה, כימיה reiactive thiol המשמשים תיוג פלואורסצנטי מכוון האתר של חלבונים הגביל את היקף הגישה כי כל ציסטות נגיש, כולל אלה אנדוגניים, יסווגו. זה היה ולכן נדרש לבנות חלבונים ללא ציסטאין אנדוגני. תיוג היה מוגבל גם לאתרים נגישים מן החוץצַד. זה השתנה עם השימוש של חומצות אמינו פלואורסצנט לא טבעי (FUAA) כדי לכלול במיוחד בדיקה פלואורסצנטי קטן בתגובה לעצור דיכוי קודון באמצעות tRNA אורתוגונלית זוג synthetase tRNA 2 . שיפור VCF רק דורש הליך הזרקת שני שלבים של הזרקת דנ&quot;א (זוג tRNA / synthetase) ואחריו RNA / FUAA שיתוף הזרקת. עכשיו, תיוג הן אתרי תאיים ו קבור אפשרי, ואת השימוש VCF התרחב באופן משמעותי. הטכניקה VCF ובכך הופך אטרקטיבי לחקר מגוון רחב של חלבונים - וחשוב יותר - מאפשר לחקור מנגנונים ציטוזוליים רבים.

איור 4 מציג דוגמה של הקלטות VCF המתקבל ביצית להביע ערוצי שייקר עם איון מהיר הוסר (IR), L382stop-W434F בנוכחות pAnap ו Anap. המוטציה W434F חוסמת את זרמי האשלגן היוניים, המאפשרים למדוד את זרם הטעינה הזעיר (gating currents). הקלטות בו זמנית של זרמים gating (עקבות העליון) ו Anap פלואורסצנטי שינויים בעוצמה (עקבות נמוכים) על קוטביות להדגים את שילוב מוצלח של Anap למצב L382. כאן, Anap ממוקם על החלק התחתון של כל אחד מארבעת S4 טרנסממברני טרנ...

מאמר זה מתאר שיפור של קונבנציונאלי מתח פלמורומטריה (VCF) שבו פלואורסצנט טבעי חומצות אמינו (fUAA) משמשים במקום צבעים maleimide, כדי לבדוק סידורים מבניים בערוצי יון. ההליך כולל הזרקת Xenopus ביצית דנ&quot;א, RNA / מטבע fUAA, ומדידות בו זמנית ו פלואורסצנטי.

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להטמיע חומצת אמינו לא טבעית פלורסצנטית בחלבון ממברנה המובע בציטות של Xenopus, ולקבוע בו-זמנית את תפקוד החלבון ואת הסידור המבני שלו, באמצעות פלואורימטריה בבלימת מתח (voltage-clamp fluorometry). טכניקה זו תסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הקשרים בין מבנה לתפקוד של חלבוני ממברנה. באמצעות פלואורימטריה בבלימת מתח, אנו יכולים להקיים מתאם ישיר בין סידורים מבניים לבין תפקוד החלבון.הוספת סימון של חומצות אמינו לא טבעיות פלואורסצנטיות מסייעת להתגבר על מגבלות קודמות של הסימון. מגבלות אלו היו הנגישות של אתרי הסימון וכן סימון רקע הנובע מאתרי קישור אנדוגניים. ההשלכות של טכניקה זו הן להבנה ביופיזית טובה יותר של חלבוני ממברנה, שכן כעת ניתן לבחון דומיינים אשר לא היו נגישים בעבר באמצעות פלואורומטריית מתח-קבוע (voltage-clamp fluorometry) מסורתית.לאחר הסרה כירורגית של ביצי ה-Xenopus, שטפו את הביציות שלוש פעמים עם תמיסת SOS. בחרו ביציות גדולות ובריאות באופן פרטני, והדגרימו אותן בטמפרטורה של 18 degrees Celsius למשך ארבע שעות לפחות בתמיסת Barth המועשרת באנטיביוטיקה וב-5% horse serum לפני ההזרקה. להזרקה גרעינית של DNA, הכינו קצה הזרקה ארוך ודק כדי להגיע לגרעין מבלי לפגוע בביציות.לאחר מכן, מלאו את קצה ההזרקה בשמן, והרכיבו את קצה ההזרקה על מכשיר הננו-מזרק (nanoinjector). לאחר

voltage-clamp-fluorometry-xenopus-oocytes-using-fluorescent-unnatural

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

יונית הנוכחי של BK ערוצי נרשם באמצעות מהדק טכניקות תיקון. ערוצי BK באים לידי...

הצמד תיקון וטכניקות זלוף עבור לימוד תעלות יונים מתבטא Xenopus ביציות

נתאר שיטה אשר מודד את קינטיקה של תחבורה יון של חלבונים בממברנה לצד ניתוח אתר ספציפי של שינויים קונפורמציה באמצעות הקרינה על תאים בודדים. טכניקה זו ניתנת להתאמה תעלות יונים, מובילי משאבות יונים יכול להיות מנוצל כדי לקבוע מגבלות המרחק בין יחידות משנה חלבון.

בחינת Dynamics קונפורמציה של חלבונים בממברנה באתרו עם תיוג, האתר מכוון פלואורסצנטי

אנו מתארים שיטה לכימות הפעילות של ATPases מסוג P-countertransport K+ על ידי ביטוי הטרולוגי של האנזימים בביציות Xenopus ומדידת קליטת Rb+ או Li+ לתאים בודדים על ידי ספקטרופוטומטריית ספיגה אטומית. השיטה מהווה אלטרנטיבה רגישה ובטוחה לניסויי שטף רדיואיזוטופים המאפשרים מחקרים קינטיים מורכבים.

מדידת תחבורת קטיון ידי Na, K-ו-H, K-ATPase ב<em&gt; Xenopus</em&gt; ביציות על ידי spectrophotometry קליטה האטומית: חלופית למבחני radioisotope

כדי להשלים את השיטות נפוצות ללמוד TRPV4 של שתי שיטות מתוארות: mechanosensitivity ניתן ללמוד על ידי 2 luminometry +-aequorin Ca בשמרים מהונדסים על אתגר היפו אוסמוטי. כמו כן, ניתן לבדוק בTRPV4-RNA מוזרק ביציות Xenopus ידי מהדק כל תא שתי אלקטרודות מתח או צמד תיקון בתאים או במצב נכרת.

Luminometric ושמרים Xenopus ביצית בחינות אלקטרו של Mechanosensitivity המולקולרי של TRPV4

גישת פער זלין החתך פתוח משמשת להשגת הקלטות רעש נמוכות של זרמים יוניים וgating מתעלות יונים מתח תלוי מבוטאים בביציות Xenopus עם רזולוציה גבוהה של קינטיקה ערוץ מהר. עם שינוי קל, fluorometry מהדק מתח יכול להיות מצמידים את פרוטוקול ביצית החתך פתוח.

<em&gt; Xenopus</em&gt; טכניקת ביצית Cut-פתוח וזלין גאפ מתח מהדק עם Fluorometry

מתוארת שיטה להדמיית שינויים בפוטנציאל הממברנה באמצעות מחווני מתח מקודדים גנטית.

ממברנה הדמיה פוטנציאלית עם שני סוגי חיישני מתח פלורסנט מקודדים גנטיים

כל תא הקלטות של תסיסנית melanogaster photoreceptors לאפשר מדידה של ספונטני בליטות כהה, בליטות קוונטיות, תגובות מאקרוסקופיות לאור, ואת המתח הנוכחי היחסים בתנאים שונים. בשילוב עם ד melanogaster כלים מניפולציה גנטית, שיטה זו מאפשרת את המחקר של inositol- השומן ליפיד המסלול נתיב היעד שלה, ערוץ TRP.

שיטה אלקטרו-קולית לקולקציית מתח מלא<em&gt; תסיסנית</em&gt; פוטורספטורים

אנו מציגים פרוטוקול דו-חלקי המשלב הדמיה של סידן פלורסנט עם היברידיזציה באתרו, ומאפשר לניסויים לתאם דפוסים של פעילות הסידן עם פרופילי ביטוי גנים ברמה של תא אחד.

סידן פלואורסצנטי הדמיה ובעקבות היברידיזציה באתרו לאפיון עצבי בלתי מבשר בקספוס זריזה

כאן אנו מתארים רכישה אופטית ואפיון של פוטנציאל פעולה מתאי גזע פלוריפוטנטים המושרים שמקורם בקרדיומיוציטים באמצעות מערכת פוטומטריה מודולרית במהירות גבוהה.

מדידה פוטנציאלית לפעולה אופטית חד-תאית בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע מושרים על ידי תאי גזע אנושיים

שתי שיטות קשורות מתוארות כדי לדמיין אירועים תת-תאיים הנדרשים לשידור סינפטי. פרוטוקולים אלה מאפשרים ניטור בזמן אמת של הדינמיקה של זרם סידן presynaptic והיתוך קרום שלפוחית סינפטי באמצעות הדמיה של תאים חיים של נוירונים בתרבית הפריה חוץ גופית .

מדידה פלואורסצנטית בזמן אמת של פונקציות סינפטיות במודלים של טרשת אמיוטרופית לרוחב

פלואורומטריה פונקציונלית מכוונת אתר היא שיטה לחקר תנועות תחום החלבונים בזמן אמת. שינוי טכניקה זו ליישומה בתאים מקומיים מאפשר כעת זיהוי ומעקב אחר תנועות חיישן מתח יחיד מתעלות Ca2+ מגודרות מתח בסיבי שריר שלד מבודדים.

פלואורומטריה פונקציונלית מכוונת אתר בתאים מקומיים לחקר עוררות שרירי השלד

למד מתח הידוק פלואומטריה משופרת בביצי Xenopus באמצעות חומצות אמינו פלואורסצנטיות לא טבעיות. שיטה זו מאפשרת מדידה סימולטנית של זרם ופלואורסצנציה לחקר שינויים מבניים בערוצי יונים.

מתח הידוק פלואומטריה ב

גלה סרטונים נוספים