Name: שיטה חדשנית מודל אנצפלופתיה כרונית טראומטית ב תסיסנית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: למדו שיטה חדשנית ליצירת מודל אנצפלופתיה כרונית טראומטית ב-Drosophila melanogaster באמצעות מכשיר פגיעה מבוקרת. טכניקה זו מאפשרת חקר מנגנוני ניוון נוירונים בעקבות טראומה חוזרת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

למחברים אין מה לגלות.

1. הרכבה של מכשיר שביתה ( איור 1 ) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הבוכנה מן מזרק 1 מ&quot;ל tuberculin. חותכים את הקנה על סימן 1 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מחסום תרסיס (3 מ&quot;מ גובה x 4 מ&quot;מ קוטר) מ 200 פיפטה μL קצה ולהשתמש בו כמו impactor. מניחים את impor בתוך החבית מזרק. לחץ בעדינות על הקנה כדי להזיז את הקצה אל קצה הקצה, כשהצד השטוח מכסה את פתח הזרבובית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את קצה קצה חבית צינורות פלסטיק המחובר דו תחמוצת הפחמן (CO 2 ) הרגולטור תזרים של תחנת הרדמה תסיסנית . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את הקנה באופן אנכי והדק אותו על מחזיק בעל מהדק סטנדרטי, כך שהפסיכולוג יישאר בתחתית הקנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי קצה פיפטה 200 μL לעשות את בעל זבוב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור 4 מ&quot;מ מהקצה לעשות פתיחה 0.8 מ&quot;מ קוטר, המאפשר רק את הראש לעוף להיות חשופים. הערה: ת&#39;וRax וכל שאר חלקי הגוף לעוף יישארו בתוך קצה פיפטה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי טיפ פיפטה 1000 μL ו 1 מ&quot;ל מזרק מחט כובע כדי להפוך את המחבר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך 44 מ&quot;מ מן הפתח של קצה. קח 6 מ&quot;מ אורך של כובע 1 מ&quot;ל מזרק מחט לדחוף אותו בחוזקה לתוך החלק הנותר של עצה פיפטה 1000 μL. </li></ol></li></ol> 2. הפעלה של התקן השביתה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים זבוב בן 2 בן נקבה לטוס באמצעות CO 2 על משטח לטוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להעביר אותו בעל זבוב באמצעות מברשת בסדר. הקש על בעל בעדינות כך ראש לטוס הוא ראה מחוץ לקצה קצה. אם חוטם זבוב חשוף מחוץ לקצה, בעדינות תחוב אותו בחזרה לתוך קצה עם מחט קהה 1 מ&quot;ל מזרק. הערה: הקפד לשמור את חוטם זבוב בתוך בעל. אחרת, הזבוב עלול למות מפציעה מוצצת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדק את הזבוב הועד לקנה המזרק עם המחבר כך ראש לטוס פונה כלפי מטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את לחץ הגז ב 100 kPa. התאם את קצב הזרימה בהתאם לתכנון הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך במהירות את הרגולטור תזרים לעבור מתג לסירוגין, כך מכה מכה את הראש לעוף פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרים את הזבוב מחזיק ולהזיז אותו על משטח לטוס. הפוך את בעל לטוס בעדינות ברז בצד כדי לתת לעוף החוצה. להשאיר את הזבוב בתוך בקבוקון ריק להתאושש. </li></ol> 3. מעקב וידאו בסיוע תנועה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו 6 ס&quot;מ קוטר פטרי צלחת עם elastomer סיליקון שקוף כדי להפוך את זירת המעקב. השאירו 3 מ&quot;מ שטח בין הסיליקון ואת מכסה צלחת כדי לאפשר את הזבובים ללכת בחופשיות אבל לא לעוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים ארבעה זבובים מן או את הדמה או מטופלים הקבוצה בכל פעם ומניחים אותם בזירה. השאירו את הזבובים ב 22 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקום מכשיר הצמד תשלום (CCD) מעל הזירות ולהקליט במשך 5 דקות.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח נתיבי תנועה נרשמה באמצעות תוכנת Ctrax (זמין באופן חופשי מ Caltech) 16 . לייצא את הנתונים במעקב בשפה תכנות (למשל, Matlab) בפורמט תואם ולנתח את הנתונים מבוסס על מרחק נסע לכל מסגרת 17 . חישוב מרחק הליכה ממוצע עבור כל זבוב ולשלב אותו עם כל זבובים נרשמה אחרים / קבוצה כדי להשיג ממוצע מצטבר המרחק נסע על ידי האוכלוסייה של קבצים באותה קבוצה. </li></ol>

<ol><li>McKee, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+NINDS%2FNIBIB+consensus+meeting+to+define+neuropathological+criteria+for+the+diagnosis+of+chronic+traumatic+encephalopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy.</a> Acta Neuropathol. 131, 75-86 (2016).</li>
<li>Martland, H. S. <a target="_blank" href="http://jamanetwork.com/journals/jama/article-abstract/260461">Punch drunk.</a> JAMA. 91 (15), 1103-1107 (1928).</li>
<li>Millspaugh, J. A. <a target="_blank" href="https://www.scopus.com/record/display.uri?eid=2-s2.0-0005984841&origin=inward&txGid=863ABC19BCEDFF53A3AD7536B601EEA3.wsnAw8kcdt7IPYLO0V48gA%3a2">Dementia pugilistica.</a> US Naval Med Bull. 35, 297-303 (1937).</li>
<li>Omalu, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+traumatic+encephalopathy+in+a+national+football+league+player%3A+part+II%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Chronic traumatic encephalopathy in a national football league player: part II.</a> Neurosurgery. 59 (5), 1086-1092 (2006).</li>
<li>Goldstein, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+traumatic+encephalopathy+in+blast-exposed+military+veterans+and+a+blast+neurotrauma+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Chronic traumatic encephalopathy in blast-exposed military veterans and a blast neurotrauma mouse model.</a> Sci Transl Med. 4 (134), (2012).</li>
<li>Mez, J., Stern, R. A., McKee, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+traumatic+encephalopathy%3A+where+are+we+and+where+are+we+going%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Neurol+Neurosci+Rep%22%5BJournal%5D)">Chronic traumatic encephalopathy: where are we and where are we going?</a> Curr Neurol Neurosci Rep. 13 (12), 407(2013).</li>
<li>McKee, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spectrum+of+disease+in+chronic+traumatic+encephalopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">The spectrum of disease in chronic traumatic encephalopathy.</a> Brain. 136 (Pt 1), 43-64 (2013).</li>
<li>Petraglia, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spectrum+of+neurobehavioral+sequelae+after+repetitive+mild+traumatic+brain+injury%3A+a+novel+mouse+model+of+chronic+traumatic+encephalopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">The spectrum of neurobehavioral sequelae after repetitive mild traumatic brain injury: a novel mouse model of chronic traumatic encephalopathy.</a> J Neurotrauma. 31 (13), 1211-1224 (2014).</li>
<li>Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+in+the+study+of+human+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Neurol+Disord+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration.</a> CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (4), 504-523 (2010).</li>
<li>Littleton, J. T., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channels+and+synaptic+organization%3A+analysis+of+the+Drosophila+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Ion channels and synaptic organization: analysis of the Drosophila genome.</a> Neuron. 26 (1), 35-43 (2000).</li>
<li>Appel, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+Stubble-stubbloid+gene+encodes+an+apparent+transmembrane+serine+protease+required+for+epithelial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">The Drosophila Stubble-stubbloid gene encodes an apparent transmembrane serine protease required for epithelial morphogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 90 (11), 4937-4941 (1993).</li>
<li>Piyankarage, S. C., Featherstone, D. E., Shippy, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliter+hemolymph+sampling+and+analysis+of+individual+adult+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Nanoliter hemolymph sampling and analysis of individual adult Drosophila melanogaster.</a> Anal Chem. 84 (10), 4460-4466 (2012).</li>
<li>Katzenberger, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+of+closed+head+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model of closed head traumatic brain injury.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110 (44), E4152-E4159 (2013).</li>
<li>Barekat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Drosophila+as+an+integrated+model+to+study+mild+repetitive+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Using Drosophila as an integrated model to study mild repetitive traumatic brain injury.</a> Sci Rep. 6, 25252(2016).</li>
<li>Katzenberger, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+to+Inflict+Closed+Head+Traumatic+Brain+Injury+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila.</a> J Vis Exp. (e52905), (2015).</li>
<li>Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+ethomics+in+large+groups+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput ethomics in large groups of Drosophila.</a> Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).</li>
<li>Straw, A. D., Dickinson, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motmot%2C+an+open-source+toolkit+for+realtime+video+acquisition+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Source+Code+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Motmot, an open-source toolkit for realtime video acquisition and analysis.</a> Source Code Biol Med. 4 (5), 1-10 (2009).</li>
<li>Talavage, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally-detected+cognitive+impairment+in+high+school+football+players+without+clinically-diagnosed+concussion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Functionally-detected cognitive impairment in high school football players without clinically-diagnosed concussion.</a> J Neurotrauma. 31 (4), 327-338 (2014).</li>
<li>Theadom, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+and+impact+of+recurrent+traumatic+brain+injury+in+a+population-based+sample%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Frequency and impact of recurrent traumatic brain injury in a population-based sample.</a> J Neurotrauma. 32 (10), 674-681 (2015).</li>
<li>Drobysheva, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+for+histological+detection+of+dopaminergic+neurons+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">An optimized method for histological detection of dopaminergic neurons in Drosophila melanogaster.</a> J Histochem Cytochem. 56 (12), 1049-1063 (2008).</li>
</ol>

עבודה זו נתמכה על ידי ג &#39;ונס הופקינס בית הספר לרפואה סגל קרן ההפעלה ל LC

מודלים חייתיים המאפיינים בנאמנות תכונות CTE, כולל שינויים נוירופיזיולוגיים, סימני נוירופתולוגים וחסרים נוירו-התנהגותיים, חיוניים לחשיפת מנגנוני מחלה ולפיתוח מטרות אבחון וטיפול. זה מובן כי אין מודל של בעלי חיים של מחלה אנושית מושלמת בחיקוי כל endpoints קליני רלוונטי. עם זאת, אנו מאמינים כי מודל CTE חסון צריך לספק את שלושת הדרישות הבאות: (1) ההשפעה צריכה להיות מיושמת ישירות לראש בעל הגנה הקרקפת והגולגולת שלם; (2) הראש לא צריך להיות משותק במהלך החשיפה השפעה, כך האצה מהירה, האטה ותנוע...

כרונית טראומטית אנצפלופתיה (CTE) הוכרה לאחרונה כהפרעה ניירודגנרטיבית מובהקת, בנפרד מטאופתים אחרים כמו מחלת אלצהיימר 1 . בניגוד למחלת האלצהיימר ולתאופאטים נפוצים אחרים - שגורמי הסיכון החשובים ביותר שלהם הם גיל מתקדם והיסטוריה משפחתית של דמנציה, CTE, כפי שצוין בשמו, מרמז על קשר הדוק עם היסטוריה של טראומה מוחית, הנראה בעיקר בספורטאים, כגון מתאגרפים ו שחקני כדורגל, כמו גם ותיקי צבא 2 , 3 , 4 , 5 . הוא חשב להיות יזום על ידי מכה חוזרת ונשנית המכות שוב ושוב לראש. מטופלים יכולים להציג סימפטומים וסימנים כגון ליקויים קוגניטיביים, שינויים במצב הרוח והתנהגות, תפקוד לקוי של התנועה, החפיפה משמעותית עם מחלת אלצהיימר, פרונטוטמפוראלדמנציה, דמנציה של גוף לוי ומחלת פרקינסון 6 . לעומת זאת, בדיקות לאחר המוות של רקמת המוח חושפות דפוס מובהק של הצטברות טאו hyperphosphorylated סביב כלי דם קטנים במעמקי sulci קליפת המוח, תכונה pathognomonic לא נצפתה בתנאים degenerative אחרים 7 . עם זאת, עד כה, מעט מאוד ידוע על הפתוגנזה המובילה ביטוי המחלה. זה בחלק גדול בשל היעדר מודל בעלי חיים נאמן - רק לאחרונה יש מודלים מכרסמים נוצרו 5 , 8 . אלה אורגניזמים מודל יש את החסרונות של טיפול אינטנסיבי עלות אורך חיים ארוך יחסית, אשר אינם מתאימים היטב עבור מחלות נוירודגנרטיב מחקרים. לעומת עמיתים יונקים, בעלי חיים חסרי חוליות כגון תסיסנית הם חלופה מצוינת, עם תחזוקה חסכונית שלהם,כלים נרחבים לגילוי דטרמיננטים גנטיים וחיי אורך חיים קצרים יחסית. למרבה הפלא, לטוס המוח האנושי לחלוק מבחינה אבולוציונית נתיבים מולקולריים וסלולריים, כמו גם הדמיון האנטומי 10 , 11 , 12 . שני מודלים תסיסנית חקר ללמוד פגיעה מוחית טראומטית דווחו בעבר 13 , 14 . הראשון &quot;High Impact טראומה&quot; (HIT) מכשיר שתוכנן על ידי Katzenberger ועמיתיו הכיל זבובים זבובים חינם בקבוקון פלסטיק שהיה קשור לקצה חופשי של קפיץ מתכת 13 , 15 . כאשר בקבוקון הפלסטיק היה מוטה זקוף ושוחרר, הוא פגע בלוק פוליאוריתן והכניס טראומה לזבובים כאשר הם ניתרו אל קיר הבקבוקון והתאוששו. לעומת זאת, ברקת ועמיתיו עיצבו שיטת משלוחים אחרתIng אומני חרוז רופטור-24 homogenizer פלטפורמה 14 . זבובים היו incapacitated עם CO 2 והניח צינור 2 מ&quot;ל בורג כי היה מאובטח homogenizer ונתון לתנאים טלטול מתוכנת מראש. יתרון אחד של שימוש במערכת homogenizer רקמות היא כי הנסיין יכול לווסת את עוצמת הפציעה, משך הפציעה, ומספר פציעות פגיעה. עם זאת, שני המשטרים סובלים מאותו חיסרון: פגיעה ראשונית בראש נגרמת באופן אקראי במונחים של מיקום השפעה וכוח. בנוסף, שתי השיטות גרמו לתמותה ניכרת, שנגרמה כתוצאה מנזק בטחוני בלתי נמנע לחלקים אחרים של הגוף ולאברים פנימיים. כאן, אנו מתארים שיטה חדשה כדי לגרום mTBI זבובים פירות. המנגנון שלנו מורכב מאפקט בליסטי המונע על ידי גז. לעומת מודלים תסיסנית הקיימים 14 , 15 , השיטה שלנו יש את היתרון הייחודי של מתן מדידההשפעה מכוונת רק על ראש זבוב חופשי, ובכך מאפשר שליטה מדויקת של גורמים שונים, כגון חומרת ההשפעה, מרווח הזמן בין ההשפעות, ואת המספר הכולל של ההשפעות שנגרמו.

<table><tbody><tr><td>מחסום אירוסול</td><td>ארה"ב מדעי</td><td>1120-8810</td><td>משמש כאימפקטור</td></tr><tr><td>200 & #956; L קצה פיפטה</td><td>ארה"ב מדעי</td><td>1111-0706</td><td>משמש כמחזיק ראש זבוב</td></tr><tr><td>1000 & #956; L קצה פיפטה</td><td>ארה"ב מדעי</td><td>1122-1830</td><td>משמש כמחבר</td></tr><tr><td>1 מ"ל מזרק טוברקולין</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>60 מ"מ צלחות פטרי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>FB0875713A</td><td>משמש כזירות מעקב</td></tr><tr><td>ווסת זרימה</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-122WC</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מהדק סטנדרטי / מעמד</td><td>EISCO Scientific</td><td>CH0688</td><td></td></tr><tr><td>מברשת עדינה</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-204</td><td></td></tr><tr><td>Flypad</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-114</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard סיליקון אלסטומר</td><td>Dow Corning</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>CCD מצלמה</td><td>מיקרוסופט&nbsp;</td><td>HD-5000</td><td></td></tr><tr><td>Ctrax גשש זבובים מהלך</td><td>Caltech</td><td>Ctrax 0.2.11</td><td></td></tr><tr><td>ארגז כלים לעיבוד תמונה</td><td>MATLAB</td><td>MATLAB R2015b</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטה חדשנית מודל אנצפלופתיה כרונית טראומטית ב<em&gt; תסיסנית</em

A Novel Method to Model Chronic Traumatic Encephalopathy in Drosophila

כרונית טראומטית אנצפלופתיה (CTE) היא מחלה נוירודגנרטיבית הוקמה קשורה קשר הדוק עם החשיפה חזרה מתונה טראומטית פגיעה מוחית (mTBI). המנגנונים האחראים לשינויים הפתולוגיים המורכבים שלה נותרים חמקמקים במידה רבה, למרות הקונצנזוס האחרון שהגדיר את הקריטריונים הנוירופתולוגיים. כאן, אנו מתארים שיטה חדשנית לפתח מודל של CTE ב תסיסנית melanogaster ( תסיסנית ) בניסיון לזהות את הגנים מפתח המסלולים המביאים הצטברות טאו hyperphosphorylated אופייני ומוות עצבי במוח. כוח מתכוונן כוח משפיע על פגיעה קלה קלה מועברים ישירות לראש לטוס, הכפוף הראש האצה מהירה האטה. השיטה שלנו מבטלת את הבעיות הפוטנציאליות הטמונות עם מודלים אחרים תסיסנית mTBI ( למשל, מוות של בעלי חיים עלול להיגרם על ידי נזקחלקים אחרים של הגוף או לאיברים פנימיים). פחות טיפול בבעלי חיים ועלות נמוכה, תוחלת חיים קצרה וכלים גנטיים נרחבים הופכים את זבוב הפירות לאידיאלי לניתוח פתוגנזה של CTE ומאפשרים לבצע מסכים גנטיים ופרמקולוגיים בקנה מידה גדול וגנומי. אנו צופים שהאפיון המתמשך של המודל יפיק תובנות מכניסטיות חשובות על מניעת מחלות וגישות טיפוליות.

כדי להקים מודל CTE באמצעות תסיסנית מבוגר, קבענו את האפקטיביות של המכשיר שלנו על גרימת פגיעה אחת בראש סגור. כדי לחסל את הווריאציות הנוגעות לגנוטיפ, למין או לגיל, השתמשנו בניסויי קנטון- S WT בני יומיים בניסוי. אנחנו יכולים בקלות לשלוט על כוחו של effor על ידי ויסות קצב הזרימה של CO 2 בלחץ גז מתמיד של 100 kPa. זבובים שנחשפו לשביתה אחת בקצב הזרימה הגבוה ביותר (15 L / min) הציגו פגמים חיצוניים מינימליים ( איור 2</...

כאן, אנו מתארים גישה חדשה לסבול ראש בראש טראומטי פגיעה מוחית תסיסנית melanogaster . השיטה שלנו יש את היתרון של אספקת ישירות חוזרות עם חוזק מתכווננת לראש לבד. חקירה נוספת של מערכת חסרי החוליות תסייע להאיר את הפתוגנזה של אנצפלופתיה טראומטית כרונית.

Chronic Traumatic Encephalopathy (CTE) is an established neurodegenerative disease that is closely associated with exposure to repetitive mild Traumatic ...

המטרה הכוללת של הליך חדשני זה היא להסב פגיעות ראש טראומטיות סגורות בזבוב הפירות, Drosophila, כדי לבסס מודל חדש שלו אנצפלופתיה טראומטית כרונית. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום האנצפלופתיה הטראומטית הכרונית, כגון האופן שבו טראומה חוזרת גורמת לניוון נוירונים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת מכות חוזרות בעוצמות ניתנות לכיוונון ישירות לראש הזבוב, מבלי לגרום נזק לחלקים אחרים בגוף בעל החיים.הדגמה של שיטה זו בעולם האמיתי היא קריטית, שכן שלבי הרכבת המכשיר והכנסת הזבובים קשים ללמידה, מכיוון שראשו של ה-Drosophila קטן מאוד וחשוב להפעיל את ההדף על הראש בלבד. כדי להכין את המיליטריה המשמשת לזעזוע או להבטחת זבוב הפירות, ראשית, הכינו את חלק הפוגע (impactor) של המכשיר. הוציאו את הבוכנה ממזרק טוברקולין מפוליקרבונט של 1 mL ולאחר מכן חתכו את גוף המזרק בסימון של 1 mL.כדי להכין אימפקטור (impactor), השתמשו במחסום הארוזול הנמצא בקצה של פיפטה של 200 microliter. אימפקטור זה צריך להיות באורך של שלושה מילימטרים ובקוטר של ארבעה מילימטרים. לאחר מכן, הכניסו את האימפקטור לתוך גוף המזרק כאשר הצד השטוח פונה לעבר הדיזה.כדי לספק כוח, חברו את גוף המזרק לווסת זרימה של פחמן דו-חמצני. על הווסת להכיל מתג הפעלה/כיבוי (On Off) ושליטה טובה בקצב זרימת הגז. לאחר מכן, קבעו את הגוף בצורה אנכית למעמד ברזל, כך שהפוגע (impactor) יפול לתחתית הגוף.בשלב הבא, הכינו את מחזיק הזבובים. התחילו עם טיפ של פיפטה בנפח 200 microliter. חתכו את קצה הטיפ חמישה מילימטרים מהקצה הקטן כדי ליצור פתח בקוטר של 8 מילימטרים.ראש של זבוב יעבור דרך חור זה, אך החזה לא יעבור. לבסוף, הכינו את מחזיק הזבוב ומכשיר ההבליטה. ראשית, חתכו טיפ של פיפט של 1 mL במרחק של 44 mm מהפתח הקטן.שנית, גזרו מקטע באורך שש מילימטרים ממגן המחט של מזרק של 1 ml. לאחר מכן, דחפו את השניים יחד. הרדימו זבוב בוגר אחד, נקבה בת יומיים, באמצעות carbon dioxide.מתוך פד הפחמן הדו-חמצני, העבירו בעדינות את הזבוב אל תוך המחזיק באמצעות מברשת עדינה. לאחר מכן, הקישו בעדינות על המחזיק עד שהראש בולט מהקצה. אם התבלול (proboscis) חשוף, השתמשו במחט של מזרק של 1 ml בעלת קצה קהה כדי לדחוף אותו בעדינות בחזרה אל תוך הקצה.חשוב מאוד לשמור על גוף הזבוב, ובמיוחד על חלקי הפה, בתוך המחזיק. אחרת, הזבוב עלול למות עקב נזק לאיברים הפנימיים או מחוסר יכולת לצרוך מזון. לאחר מכן, הגדירו את לחץ הגז ל-100 kilopascals וכווננו את הזרימה לפי הצורך.לאחר טעינת הזבוב, הדק את המחזיק לגוף המזרק באמצעות המחבר, כך שראש הזבוב פונה כלפי מטה. לאחר מכן, באמצעות מתג הבחירה, שלח פרץ של גז שיניע את הפוגע להכות בזבוב פעם אחת ורק פעם אחת. כעת, נתק את מחזיק הזבוב והחזר את הזבוב אל פד הפחמן הדו-חמצני.העבירו את הזבוב בעזרת מברשת למבחנה ריקה עד להחלמתו. שמרו זבוב אחד בכל מבחנה. ההחלמה אורכת מספר דקות בלבד.חזרו על התהליך כדי לבחון ארבעה זבובים לכל קבוצה ניסיונית. עיבוד של שתי קבוצות, קבוצת ניסוי וקבוצת ביקורת (sham), אמור לקחת רק 20 עד 30 דקות. התייחסו לבעלי החיים בקבוצת הביקורת בדיוק כאל בעלי החיים בקבוצת הניסוי, למעט העובדה שלא תכללו מחסום אירוסול בתוך צינור הפגיעה (impactor tube).כדי לעקוב אחר תנועת זבובים בתוך צלחת פטרי, תחילה, מלאו צלחת בקוטר שש סנטימטרים באלסטומר סיליקון שקוף כדי ליצור את זירת המעקב. השאירו מרווח של שלושה מילימטרים בין הסיליקון למכסה, כך שהזבובים יוכלו ללכת בחופשיות במרווח, אך לא לעוף. מתחת לזירת המעקב, מקמו רקע לבן.בשלב הבא, הרדימו ארבע זבובים מאותה קבוצת טיפול והניחו אותם בזירה. אפשרו לזבובים להתרגל לזירה במשך שעה, כאשר הזירה צריכה להיות מוארת באופן מלא ובטמפרטורה של כ-22 degrees Celsius. לא יותר מטמפרטורת החדר.לאחר שעה, השתמשו במצלמת CCD הממוקמת מעל הזירה כדי להקליט את פעילות הזבובים למשך חמש דקות. לאחר ההקלטה בת חמש הדקות, הרדימו את הזבובים שבזירה והחזירו אותם לבקבוק בית חדש. לאחר מכן, השליכו את הזירה.בהמשך, נתחו את ההקלטות באמצעות תוכנת Ctrax הזמינה בחינם. תוכנה זו מייצרת נתוני מעקב, אותם ניתן לייצא בפורמט תואם לשפת תכנות, כגון פורמט MATLAB. מהנתונים, חשבו את המרחק שעבר בכל פריים, את מרחק ההליכה הממוצע עבור כל זבוב ואת המרחק הממוצע שעברו הזבובים.על מנת להשיג מובהקות סטטיסטית, יש לצפות לבחון כ-100 זבובים לכל קבוצת טיפול. כדי לבסס מודל של אנצפאלופתיה טראומטית כרונית, נותחה היעילות של פגיעת ראש סגורה בודדת, שנגרמה על ידי מכשיר ההבליטה במהירויות שונות, תוך שימוש בנקבות Canton-S בנות יומיים. לחץ הגז נשמר ב-100 kilopascals.זבובים שנחשפו למכה בודדת בקצב הזרימה הגבוה ביותר שנבדק, הראו פגמים חיצוניים מינימליים. למרות שלא נמצאו ראיות ברורות לנזק חיצוני, פגיעות בקצב זרימה של 15 liters per minute היו קטלניות באופן חריף, והביאו לשיעור הישרדות של פחות מ-10% תוך 24 שעות. שיעור ההישרדות עלה עם קצבי זרימה נמוכים יותר.הושגה שיעור הישרדות של מאה אחוזים בזרם של חמישה ליטר לדקה או פחות, ולכן נבחרו חמישה ליטר לדקה כסטנדרט עבור המודל. מיד לאחר הפגיעה, הזבובים החזירו לעצמם בהדרגה את יכולת התנועה בתוך ארבע דקות. ההתאוששות בקבוצת הביקורת (shams) הייתה מהירה יותר בכשב דקה.לאחר הפגיעה, נעשה שימוש במעקב תנועה בסיוע וידאו כדי למדוד את התפקוד הלוקומוטורי. במהלך שני הימים שלאחר הפגיעה, התנועה חזרה לאט למצב נורמלי. ראיה זו להתאוששות הדרגתית תואמת את ההתאוששות מ-CTE בבני אדם.כדי להעריך השפעות ארוכות טווח, הוחל פרוטוקול של פגיעות ראש טראומטית חוזרת הכולל חמש מכות לאורך חמישה ימים. עשרים ימים לאחר הטיפול, הושוותה הלוקומוציה של החברים השורדים בכל קבוצה, והקבוצה המטופלת הלכה באופן ברור פחות. גם תוחלת החיים של הקבוצה המטופלת פחתה באופן משמעותי, עם חציון של 26 ימים בהשוואה ל-37 ימים בקבוצות הביקורת.לאחר פיתוחה, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום של פגיעות ראש טראומטיות חוזרות ומקלות לחקור מנגנונים פתוגניים במודל החיות הקלאסי Drosophila melanogaster. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להגן על הproboscis, החזה והבטן מפגיעה ישירה על ידי מחסום האירוסול.

a-novel-method-to-model-chronic-traumatic-encephalopathy-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מבחני התנהגות למדידת פונקציות של תנועה, למידה, ויכולות...

Assaying של תנועה, למידה, וזיכרון גירעונות תסיסנית מודלים של ניוון מוחיים

סרטון זה מתאר כיצד לעקוב אחר זבובים ההולכים בחופשיות כדי להעריך את יכולת התנועה הכללית שלהם. הפרוטוקול המוצג מדגים את הגדרת הבדיקה וניתוח הנתונים באמצעות תוכנת מעקב וידאו.

מעקב אחר זבובים מהלכים בחופשיות: שיטה להערכת תנועה בדרוזופילה

סרטון זה מדגים הליך לגרימת פציעה טראומטית בראש סגור בזבובי דרוזופילה מורדמים באמצעות מכשיר תקיפה עם מפגע מונע גז. הפגיעה פוגעת בתפקוד העצבי ופוגעת ביכולת ההליכה.

טכניקה לגרימת פגיעה מוחית טראומטית בראש סגור בזבובי דרוזופילה

הסרטון מדגים את השימוש במכשיר טראומה בעל השפעה גבוהה (HIT) כדי לגרום לפגיעה מוחית טראומטית בראש סגור (TBI) ב-Drosophila. TBI גורמת לטראומה מוחית מכנית שמשפיעה על תפקוד תאי העצב, מה שמוביל לאורך זמן לניוון עצבי ולתמותה.

שיטה לגרימת פגיעה מוחית טראומטית בראש סגור בדרוזופילה

סרטון זה מדגים את השראת פגיעה מוחית טראומטית חודרת במוח הדרוזופילה. זבובים שזה עתה הופיעו נבחרים, מורדמים וממוקמים תחת מיקרוסקופ סטריאו המצויד בפלואורסצנטיות. גוף הפטרייה המבטא GFP מזוהה, וסיכת Minutien מוחדרת כדי לגרום לפציעה. הזבובים מורשים להתאושש למחקרים נוספים.

גרימת פגיעה מוחית טראומטית חודרת בזבובי דרוזופילה בוגרים

אנו מתארים כאן את ההליכים למיצוי והטיהור של mRNA ומטבוליטים...

טיהור של תמלילים ומטבוליטים מ<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ראשים

כאן אנו מתארים שני מבחני שנקבעו ללמוד ניוון מוחיים תלוי גיל של דופאמין (DA)...

הערכת פנוטיפים ניווניות ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; נוירונים דופאמין על ידי מבחני לאז וimmunostaining מוח כל

אנו מציגים בדיקת גיאוטקסיס שלילית אופטימלית, זולה ואמינה ב-Drosophila melanogaster כמודל להפרעות ניווניות. בהיותה רגישה יותר לפגמים תנועתיים קלים, בדיקה זו תעזור לסנן אינטראקציות גנטיות פוטנציאליות ומטרות תרופתיות.

ניתוח כמותי של פגמים טיפוס בדגם תסיסנית של הפרעות ניווניות

כאן אנו מתארים שיטה לגרום פגיעת ראש סגור מוח הטראומתי (TBI) בדרוזופילה. שיטה זו מספקת שער לחקור את המנגנונים התאיים ומולקולריים העומדים בבסיס פתולוגיות TBI באמצעות המגוון הרחב של כלים וטכניקות ניסיוניים זמינים לזבובים.

שיטה לגרום סגור ראש הפגיעה מוחית טראומטית ב<em&gt; דרוזופילה</em

תסיסנית נעשה שימוש נרחב כמערכת מודל ללמוד ניווניות של מערכת העצבים. פרוטוקול זה מתאר שיטה שבאמצעותה ניוון, כפי שנקבע על ידי היווצרות vacuole במוח, ניתן לכמת. הוא גם מפחית תופעות עקב ההליך הניסיון על ידי עיבוד ובקרת חתך וזבובים הניסיונות כמו דגימה אחת.

Mass היסטולוגיה לכמת מוחיים ב<em&gt; תסיסנית</em

פרוטוקול זה מתאר את הקרע של immunostaining של המבוגרים דרוזופילה melanogaster רקמות המוח. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מדגיש את השימוש נוירונים הגוף, קולט אור פטריות דרוזופילה בתור דוגמה עצביים קבוצות משנה יכול לשמש באופן מדויק לחשוף את עקרונות כלליים שבבסיס היבטים רבים של ההתפתחות העצבית.

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

למדו שיטה חדשנית ליצירת מודל אנצפלופתיה כרונית טראומטית ב-Drosophila melanogaster באמצעות מכשיר פגיעה מבוקרת. טכניקה זו מאפשרת חקר מנגנוני ניוון נוירונים בעקבות טראומה חוזרת.

שיטה חדשנית מודל אנצפלופתיה כרונית טראומטית ב

גלה סרטונים נוספים