Name: מיצוי וטיהור של פוליפנולים מאבקת ברי מיובשים בהקפאה לטיפול בתאי שריר חלקים וסקולריים במבחנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: למדו פרוטוקול למיצוי וטיהור פוליפנולים מאבקת פירות יער מיובשים בהקפאה באמצעות חליטה אולטרסונית באתנול. השיטה מאפשרת הכנת תמציות עשירות לטיפול בתאי שריר חלקים וסקולריים ולחקר השפעותיהם הקרדיווסקולריות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי איגוד הלב האמריקני (14GRNT20180028) ואת מדינת פלורידה מדינת המועצה על מחקר ויצירתיות (COFRS).

1. הכנה של ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן אתנול 80% (100 מ&quot;ל) על ידי ערבוב 80 מ&quot;ל של אתנול מוחלט (ביולוגיה מולקולרית כיתה) ו 20 מ&quot;ל של תא תרבות כיתה מים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין תמצית פוליפנול (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל), לשקול 10 מ&quot;ג של CE או PE. הוסף 1 מ&quot;ל של רגיל Dulbecco השתנה בינוני הנשר (DMEM) תחת מכסה המנוע בתרבות התא. וורטקס הפתרון. Aliquot ב 200 חלקים μL ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ תמוגה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל של פתרון M 1 HEPES המניה (pH 7.4, 50 מ&quot;מ הסופי), 1 מ&quot;ל של 5 מ &#39;פתרון NaCl המניה (50 מ&quot;מ הסופי), 1 מ&quot;ל של פתרון 0.5 M EDTA המניות (5 מ&quot;מ הסופי), 2 מ&quot;ל של 0.5 M NaF פתרון המניה (10 מ&quot;מ הסופי), 286 μL של 700 מ&quot;מ Na 3 VO 4 פתרון המניה (2 מ&quot;מ הסופי), 5 מ&quot;ל של 200 מ&quot;מ Na 4 P 2 O פתרון 7 המניה (10 מ&quot;מ הסופי), ו 5 מ&quot;ל של 20% Triton-X-100 פתרון המניות מוכן במים (1% הסופי). הוסף מים כדי להגיע נפח של 100 מ&quot;ל. שמור על 4 מעלות צלזיוס. </li><lI&gt; הוסף 10 μL / מ&quot;ל ​​של קוקטייל מעכב פרוטאז. הוסף טרי כאשר התאים מוכנים תמוגה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת למאגר מדגם Laemmli (4x). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 31.25 מ&quot;ל של פתרון 2 מ &#39;טריס המניה (pH 6.8), 100 מ&quot;ל של גליצרול, 50 מ&quot;ל של 20% נתרן Dodecyl Sulfate (SDS) פתרון מוכן במים, 50 מ&quot;ל של β-mercaptoethanol. מוסיפים מים עד 250 מ&quot;ל. שמור על 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין למאגר טריס שנאגרו מלוחים (TBS), לשקול 3 גרם של Tris (25 מ&quot;מ הסופי), 0.18 גרם של KCl (2.5 מ&quot;מ הסופי), ו 8.76 גרם של NaCl (150 מ&quot;מ הסופי). להתאים את ה- pH 7.4 ולהוסיף מים עד 1 L. שמור על RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין TBS-T, להוסיף 997.5 מ&quot;ל של TBS ו 2.5 מ&quot;ל של פתרון 20% Triton-X-100 מוכן במים. שמור על RT. </li></ol> 2. הכנת תמציות Blackberry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תמצית גרגרי אבקת ברי מיובשת בהקפאה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול 10 גרם של אבקת פטל שחור מיובש להקפיא (או 5 גרם של אבקה טרייה). אם פירות קפואים משמש, לחתוך אותו אניN כדי חתיכות קטנות מאוד לפני תחילת החילוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את אבקת פירות עם 100 מ&quot;ל של 80% אתנול מימי ב 1 ליטר עגול ארלנמאייר בקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate את התערובת במשך 20 דקות ב 42 קילוהרץ, 135 W באמצעות אמבטיה קולי על 25 מעלות צלזיוס, ללא מרווח זמן בין לבין. בצע את sonication עם טיהור חנקן מתמשך באור מאופק. לקבלת פירות קפואים, להגדיל את זמן הדגירה עד 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סינון תערובת באמצעות נייר מסנן # 2 באמצעות משפך Buchner צונן עם יניקה ואקום. הערה: בסוף שלב זה, שאריות המדגם מופיעות על נייר הסינון; זה נקרא עוגת סינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את העוגה סינון עם 50 מ&quot;ל של אתנול 100%. שמור את תסנין ולהוסיף את העוגה מסנן ל 1 ליטר בקבוקון תחתית המכיל 100 מ&quot;ל של 80% אתנול מימית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על תהליך החילוץ עבור שאריות (צעדים 2.1.2 - 2.1.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב את שני filtrates לתוך בקבוקון בתחתית עם תוספת 50 מ&quot;לשל 80% אתנול מימית. הערה: נפח הסופי צריך להיות כ 300 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מאייד סיבובית ב 62 ° C ו 50 סל&quot;ד להתאדה הממס. המשך תהליך זה עד אתנול אינו מתאדות יותר. הערה: תהליך זה אורך כ -45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את המדגם לצינור חרוטי 50 מ&quot;ל. התאדות אתנול ידי הזרקת גז חנקן בחלק העליון של הצינור במשך 10 דקות. הערה: צעד זה נדרש כדי להבטיח את ההתאיידות המלאה של אתנול. נפח המדגם בשלב זה הוא כ 20 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא את המדגם ב -80 מעלות צלזיוס לפחות 24 שעות. הערה: שלב זה נחוץ כדי לאפשר תהליך יעיל יותר להקפאת הייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא לייבש את המדגם ב -50 מעלות צלזיוס למשך כ 8 שעות. חנות דגימות ב -20 מעלות צלזיוס. הערה: המייבש להקפיא יוצר ואקום חזק ב -50 מעלות צלזיוס בתוך החדר לייבש את הדגימות אבל משמר את רוב התרכובות, כגון פוליפNols. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תמציות פוליפנול מטוהרות מתמציות נפט גולמיות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את דגימות מיובשות בהקפאה. הערה: נפח תמצית בשלב זה הוא כ 10 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף שני כרכים (~ 20 מ&quot;ל) של כלורופורם כדי תמצית גולמי לנער את הפתרון במשך 5 דקות בצלחת ומערבבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את התערובת למשפך המפריד. תנו את תמצית תמצית גס עבור 1 שעה ב RT כדי לקבל את החלק מטוהרים. הערה: בשלב זה, תערובת דו פאזי תיווצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את השכבה התחתונה (שלב כלורופורם) מן המשפך המפריד ולאסוף את השכבה מימית לתוך כוס נקייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים שני כרכים של אתיל אצטט לשבר מימי ולהשתמש בסרגל מגנטי ומערבבים לערבב את התערובת במשך 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סינון תערובת באמצעות מסנן # 2 נייר באמצעות משפך Buchner מקורר עם יניקה ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את המדגם מסונן ולהעביר אותו בקבוקון בתחתית להיות לנואד עם המאייד סיבובית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המאייד סיבוב כדי 62 ° C ו 50 סל&quot;ד להתאדות אתיל אצטט למשך כ 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא לייבש את המדגם ב -50 מעלות צלזיוס למשך כ 8 שעות. מעבירים את המדגם לצינור 50 מ&quot;ל חרוטי ולאחסן אותו ב -20 מעלות צלזיוס. </li></ol></li></ol> 3. טיפול של VSMCs עם תמציות ברי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות VSMCs. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד VSMCs מן aortas החזה של חולדות Sprague-Dawley על ידי ביצוע עיכול אנזימטי, כפי שתואר לעיל 29 . תרבות VSMCs כמתואר 29 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני שלם לתרבות של VSMCs באמצעות DMEM המכיל 1 גרם / גלוקוז L ו בתוספת 10% בסרום עוברי בסרום (FBS), 100 פניקסילין U / מ&quot;ל, סטרפטומיצין 100 מ&quot;ג / מ&quot;ל, ו 2 מ&quot;מ L- גלוטמין. אחסן את המדיום המלא ב 4 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של VSMCs עם תמציות פוליפנול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לפצל את VSMCs, להשליך את cultuבינוני מחדש לשטוף את התאים פעמיים עם מלוחים פוספט שנאגרו (PBS). הוסף 4 מ&quot;ל של PBS ו 2 מ&quot;ל של טריפסין EDTA 0.25%. דגירה התאים 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס CO 2 באינקובטור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף התאים, לערבב אותם עם 2 מ&quot;ל של המדיום המלא בצינור צנטריפוגות 15 מ&quot;ל, צנטריפוגה ב 1,100 × גרם במשך 5 דקות. מחק supernatant ו resuspend גלולה התא עם 1 מ&quot;ל של PBS. ספירת התאים באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעים 50,000 VSMCs לכל היטב 6-גם תרבות צלחות לגדל אותם בינוני מלא המכיל 10% FBS עד שהם מגיעים 90% confluency (כ 3 ד). לשמור על VSMCs ב 37 ° C בחממה 5% CO 2 humidified. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המדיום לטיפול באמצעות מדיום DMEM המכיל 1 גרם / גלוקוז L, 100 U / מ&quot;ל ​​פניצילין, סטרפטומיצין 100 מ&quot;ג / מ&quot;ל, 2 מ&quot;מ L- גלוטמין, ו 0.5% FBS. אחסן את המדיום הטיפול ב 4 ° C. הערה: תמציות פוליפנול ו- Ang II מתווספות ישירות לתאים המשתמשים ביDium. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מלאי של 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​תמצית גולמי (CE) או טיהור מטוהרים (PE) של פוליפנולים על ידי המסת 10 מ&quot;ג של תמצית ב 1 מ&quot;ל של מדיום רגיל DMEM. שמור את המניות 200 aliquots μL ב -20 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה VSMCs עם 2 מ&quot;ל של המדיום טיפול המכיל 0.5% FBS ולהוסיף או CE או תמציות PE להשיג ריכוז של 50 - 500 מיקרוגרם / מ&quot;ל. שנה את המדיום כל 24 שעות על ידי הוספת תמציות פוליפנול טרי. לטפל בתאים במשך 3 ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטיפול עם Ang II או הורמונים אחרים וגורמי גדילה, להרעיב את התאים לפחות 24 שעות על ידי דוגרים את התאים עם המדיום טיפול המכיל 0.5% FBS לפני תוספת של Ang II (100 ננומטר). הערה: דגירה עם ובלי CE ו PE ב בינוני 0.5% FBS טיפול לפני תוספת של Ang II מומלץ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות של רעב, הוסף 100 nm Ang II. החלף את המדיום הטיפול עם לסה&quot;נ טרי, PE, או אנג II כל 24 שעות במשך 3 ד. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת דגימות תאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים שטופלו פעמיים PBS קר lyse אותם עם 200 μL של חיץ תמוגה על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף lysates התא באמצעות מגרדים תא ולהעביר את lysates ל 1.5 צינורות microcentrifuge מ&quot;ל. דגירה סך lysates התא 20 דקות על הקרח ו מערבולת כל 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סוניקטה התאים שואבת עם שלוש התפרצויות ב 125 וואט לכל 10 שניות, עם הפסקה של 2 בין לבין. שמור את דגימות על הקרח לאורך sonication. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את ריכוז החלבון באמצעות מגיב assay חלבון ב 595 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות דגימות ב -20 מעלות צלזיוס לניתוח על ידי כתם המערבי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם המערבי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים כמויות שוות של חלבון (כ 50 מיקרוגרם) מ שליטה שאינם מטופלים polyphenol מטופלים או Ang II שטופלו דגימות עם חיץ תמוגה להשיג נפח כולל מקסימלי של 50 μL. הוסף 16 μL של חיץ מדגם 4x Laemmli. מחממים את הדגימות 5 דקות ב 75 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את הדוגמהEs ב 10% SDS-PAGE ג&#39;לים ולהעביר אותם קרום PDVF ב 10 V במשך 75 דקות במעבר חצי יבש מערכת ניתוח כתם המערבי עם נוגדנים ספציפיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסום את הממברנה עם חלב 2% ב TBS 0.05% חיץ Triton-X100 (TBS-T) במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החלב על ידי שטיפת הממברנה לפחות שלוש פעמים עם TBS (5 דקות כל אחד) ו דגירה עם נוגדנים ראשוניים עבור שעה 1 ב RT או O / N ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הממברנה שלוש פעמים, 10 דקות כל אחד, עם TBS-T ו דגירה עם נוגדן משני HRP קשורה במשך 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הממברנה שלוש פעמים, 10 דקות כל אחד, עם TBS-T ולפתח על ידי chemiluminescence משופר (ECL). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Morton, L. W., Abu-Amsha Caccetta, R., Puddey, I. B., Croft, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+and+biological+effects+of+dietary+phenolic+compounds%3A+relevance+to+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Pharmacol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Chemistry and biological effects of dietary phenolic compounds: relevance to cardiovascular disease.</a> Clin Exp Pharmacol Physiol. 27 (3), 152-159 (2000).</li>
<li>Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20664075">Gut microbiota in health and disease.</a> Physiol Rev. 90 (3), 859-904 (2010).</li>
<li>Manach, C., Scalbert, A., Morand, C., Remesy, C., Jimenez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphenols%3A+food+sources+and+bioavailability%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Polyphenols: food sources and bioavailability.</a> Am J Clin Nutr. 79 (5), 727-747 (2004).</li>
<li>Griffiths, G., Trueman, L., Crowther, T., Thomas, B., Smith, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onions--a+global+benefit+to+health%5BTitle%5D)+AND+%22Phytother+Res%22%5BJournal%5D)">Onions--a global benefit to health.</a> Phytother Res. 16 (7), 603-615 (2002).</li>
<li>Mazzoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+aspects+of+berries%3A+from+field+to+health%5BTitle%5D)+AND+%22J+Sci+Food+Agric%22%5BJournal%5D)">The genetic aspects of berries: from field to health.</a> J Sci Food Agric. 96 (2), 365-371 (2016).</li>
<li>Wang, S. Y., Jiao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scavenging+capacity+of+berry+crops+on+superoxide+radicals%2C+hydrogen+peroxide%2C+hydroxyl+radicals%2C+and+singlet+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Scavenging capacity of berry crops on superoxide radicals, hydrogen peroxide, hydroxyl radicals, and singlet oxygen.</a> J Agric Food Chem. 48 (11), 5677-5684 (2000).</li>
<li>Choi, M. H., Shim, S. M., Kim, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+black+raspberry+seed+containing+anthocyanins+against+oxidative+damage+to+DNA%2C+protein%2C+and+lipid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Food+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Protective effect of black raspberry seed containing anthocyanins against oxidative damage to DNA, protein, and lipid.</a> J Food Sci Technol. 53 (2), 1214-1221 (2016).</li>
<li>Forbes-Hernandez, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Healthy+Effects+of+Strawberry+Polyphenols%3A+Which+Strategy+behind+Antioxidant+Capacity%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Food+Sci+Nutr%22%5BJournal%5D)">The Healthy Effects of Strawberry Polyphenols: Which Strategy behind Antioxidant Capacity?</a> Crit Rev Food Sci Nutr. 56, Suppl 1. S46-S59 (2016).</li>
<li>Figueira, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+a+blueberry+extract+in+acute+inflammation+and+collagen-induced+arthritis+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Protective effects of a blueberry extract in acute inflammation and collagen-induced arthritis in the rat.</a> Biomed Pharmacother. 83, 1191-1202 (2016).</li>
<li>Daglia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphenols+as+antimicrobial+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Polyphenols as antimicrobial agents.</a> Curr Opin Biotechnol. 23 (2), 174-181 (2012).</li>
<li>Hügel, H. M., Jackson, N., May, B., Zhang, A. L., Xue, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphenol+protection+and+treatment+of+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Polyphenol protection and treatment of hypertension.</a> Phytomedicine. 23 (2), 220-231 (2016).</li>
<li>Niedzwiecki, A., Roomi, M. W., Kalinovsky, T., Rath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticancer+Efficacy+of+Polyphenols+and+Their+Combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Anticancer Efficacy of Polyphenols and Their Combinations.</a> Nutrients. 8 (9), E552(2016).</li>
<li>Kresty, L. A., Mallery, S. R., Stoner, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Black+raspberries+in+cancer+clinical+trials%3A+Past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22J+Berry+Res%22%5BJournal%5D)">Black raspberries in cancer clinical trials: Past, present and future.</a> J Berry Res. 6 (2), 251-261 (2016).</li>
<li>Hertog, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavonoid+intake+and+long-term+risk+of+coronary+heart+disease+and+cancer+in+the+seven+countries+study%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Flavonoid intake and long-term risk of coronary heart disease and cancer in the seven countries study.</a> Arch Intern Med. 155 (4), 381-386 (1995).</li>
<li>Peterson, J. J., Dwyer, J. T., Jacques, P. F., McCullough, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+between+flavonoids+and+cardiovascular+disease+incidence+or+mortality+in+European+and+US+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nutr+Rev%22%5BJournal%5D)">Associations between flavonoids and cardiovascular disease incidence or mortality in European and US populations.</a> Nutr Rev. 70 (9), 491-508 (2012).</li>
<li>Cassidy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+anthocyanin+intake+is+associated+with+a+reduced+risk+of+myocardial+infarction+in+young+and+middle-aged+women%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">High anthocyanin intake is associated with a reduced risk of myocardial infarction in young and middle-aged women.</a> Circulation. 127 (2), 188-196 (2013).</li>
<li>Jacques, P. F., Cassidy, A., Rogers, G., Peterson, J. J., Dwyer, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+flavonoid+intakes+and+CVD+incidence+in+the+Framingham+Offspring+Cohort%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Dietary flavonoid intakes and CVD incidence in the Framingham Offspring Cohort.</a> Br J Nutr. 114 (9), 1496-1503 (2015).</li>
<li>Aghababaee, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+blackberry+%28Morus+nigra+L.%29+consumption+on+serum+concentration+of+lipoproteins%2C+apo+A-I%2C+apo+B%2C+and+high-sensitivity-C-reactive+protein+and+blood+pressure+in+dyslipidemic+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Res+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of blackberry (Morus nigra L.) consumption on serum concentration of lipoproteins, apo A-I, apo B, and high-sensitivity-C-reactive protein and blood pressure in dyslipidemic patients.</a> J Res Med Sci. 20 (7), 684-691 (2015).</li>
<li>Jeong, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Rubus+occidentalis+extract+on+blood+pressure+in+patients+with+prehypertension%3A+Randomized%2C+double-blinded%2C+placebo-controlled+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition%22%5BJournal%5D)">Effects of Rubus occidentalis extract on blood pressure in patients with prehypertension: Randomized, double-blinded, placebo-controlled clinical trial.</a> Nutrition. 32 (4), 461-467 (2016).</li>
<li>Jia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antihypertensive+effect+of+ethyl+acetate+extract+from+red+raspberry+fruit+in+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogn+Mag%22%5BJournal%5D)">The antihypertensive effect of ethyl acetate extract from red raspberry fruit in hypertensive rats.</a> Pharmacogn Mag. 7 (25), 19-24 (2011).</li>
<li>Feresin, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blackberry%2C+raspberry+and+black+raspberry+polyphenol+extracts+attenuate+angiotensin+II-induced+senescence+in+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Funct%22%5BJournal%5D)">Blackberry, raspberry and black raspberry polyphenol extracts attenuate angiotensin II-induced senescence in vascular smooth muscle cells.</a> Food Funct. 7 (10), 4175-4187 (2016).</li>
<li>Pergola, C., Rossi, A., Dugo, P., Cuzzocrea, S., Sautebin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+nitric+oxide+biosynthesis+by+anthocyanin+fraction+of+blackberry+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">Inhibition of nitric oxide biosynthesis by anthocyanin fraction of blackberry extract.</a> Nitric Oxide. 15 (1), 30-39 (2006).</li>
<li>Lu, H., Li, J., Zhang, D., Stoner, G. D., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+involved+in+chemoprevention+of+black+raspberry+extracts%3A+from+transcription+factors+to+their+target+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nutr+Cancer%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms involved in chemoprevention of black raspberry extracts: from transcription factors to their target genes.</a> Nutr Cancer. 54 (1), 69-78 (2006).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous+extract+of+unripe+Rubus+coreanus+fruit+attenuates+atherosclerosis+by+improving+blood+lipid+profile+and+inhibiting+NF-%CE%BAB+activation+via+phase+II+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">Aqueous extract of unripe Rubus coreanus fruit attenuates atherosclerosis by improving blood lipid profile and inhibiting NF-κB activation via phase II gene expression.</a> J Ethnopharmacol. 146 (2), 515-524 (2013).</li>
<li>Wang, J., Mazza, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+anthocyanins+and+other+phenolic+compounds+on+the+production+of+tumor+necrosis+factor+alpha+in+LPS%2FIFN-gamma-activated+RAW+264.7+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Effects of anthocyanins and other phenolic compounds on the production of tumor necrosis factor alpha in LPS/IFN-gamma-activated RAW 264.7 macrophages.</a> J Agric Food Chem. 50 (15), 4183-4189 (2002).</li>
<li>Pascual-Teresa, S., Moreno, D. A., Garcia-Viguera, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavanols+and+anthocyanins+in+cardiovascular+health%3A+a+review+of+current+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Flavanols and anthocyanins in cardiovascular health: a review of current evidence.</a> Int J Mol Sci. 11 (4), 1679-1703 (2010).</li>
<li>Kim, D. O., Lee, C. Y. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/0471142913.fai0102s06/abstract">Extraction and Isolation of Polyphenolics.</a> Curr Protoc Food Analyt Chem. 1, John Wiley & Sons. New York. 2.1-2.12 (2002).</li>
<li>Queires, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphenols+purified+from+the+Brazilian+aroeira+plant+%28Schinus+terebinthifolius%2C+Raddi%29+induce+apoptotic+and+autophagic+cell+death+of+DU145+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Polyphenols purified from the Brazilian aroeira plant (Schinus terebinthifolius, Raddi) induce apoptotic and autophagic cell death of DU145 cells.</a> Anticancer Res. 26 (1A), 379-387 (2006).</li>
<li>Griendling, K. K., Taubman, M. B., Akers, M., Mendlowitz, M., Alexander, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+phosphatidylinositol-specific+phospholipase+C+from+cultured+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of phosphatidylinositol-specific phospholipase C from cultured vascular smooth muscle cells.</a> J Biol Chem. 266 (23), 15498-15504 (1991).</li>
<li>Vuong, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+a+polyphenol-enriched+preparation+on+chemoprevention+of+mammary+carcinoma+through+cancer+stem+cells+and+inflammatory+pathways+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Role of a polyphenol-enriched preparation on chemoprevention of mammary carcinoma through cancer stem cells and inflammatory pathways modulation.</a> J Transl Med. 14, (2016).</li>
</ol>

למחברים אין מה לגלות.

פוליפנולים מבודדים מהגרגרים מכילים קומפוזיציות שונות. פרוטוקול החילוץ המבוסס על אתנול המתואר כאן מאפשר זיהוי של רמות שונות של חומצות פנוליות ופלבונואידים המצויים בתמציות פוליפנול גולמיות ומטוהרות של BL ( טבלה 1 ). CE הועשר בחומצה גאלית, חומצה פרולית, חומצה 4-O-caffeoylquinic, וחומצה 5-O-caffeoylquinic. תהליך הטיהור לא שינה משמעותית את רמות החומצה הגאלית וחומצה p-coumaric. עם זאת, היא הגדילה את רמות של חומצה O- caffeoylquinic מ 170.5 - 235.3 ppm ו querceti...

פוליפנולים הם תרכובות המכילות לפחות טבעת פנולית אחת במבנה שלהם נמצאים בשפע בממלכת הצמח 1 . בני אדם כבר לצרוך צמחים אלפי שנים למטרות רפואיות מבלי להיות מודע לקיומם של תרכובות כאלה 2 . פירות וירקות רבים יש כמה תרכובות פוליפנוליות משותפות, אם כי עם כמויות שונות, כולל פלבנואידים, stilbenes, וחומצות פנוליות 3 . למרות polyphenols קשורות לעיתים קרובות עם פירות וירקות צבעוניים, זה לא נכון לחלוטין. לדוגמה, zeaxanthin ו xanthine נמצאים בירקות שאינם צבעוניים מאוד, כגון בצל ושום, אשר ממשפחת scallions והם קשורים עם יתרונות בריאותיים רבים 4 . מלבד היותו קשור למספר יתרונות בריאותיים 5 , polyphenols גם לשרת צמחים על ידי הגנה עליהם מפני חרקיםקרינה אולטרה סגולה. פוליפנולים נמצאים בדרך כלל בתזונה האנושית ונחשבים לחומרים נוגדי חמצון רבי עוצמה, שכן הם יכולים לסקור את מימן החמצן (ROS) 6 , 7 , 8 . יש להם גם אנטי דלקתיות 9 , מיקרוביאלית 10 , נגד יתר לחץ דם 11 , ו אנטי מסרטנים 12 , 13 נכסים. מחקרים אפידמיולוגיים מראים קשר הפוך בין צריכת הפלבנואידים לבין מחלות לב וכלי דם (CVD) , 16 , 17 ותמותה 14 , 15 . פירות יער הם נצרך נרחב בארה&quot;ב יש כמויות גבוהות של פוליפנולים, כולל פלבנואידים. לדוגמה, צריכת מיץ (BL) מיץ (300)<html> מ&quot;ל / ד) במשך שמונה שבועות ירדה באופן משמעותי לחץ דם סיסטולי בחולים דיסליפידים 18 . Jeong et al. 19 דיווחו כי גברים ונשים לפני יתר לחץ דם, שצרכו 2.5 גרם של תמצית פטל שחור (BRB) ביום, היו בעלי לחץ דם נמוך יותר 24 שעות ולילה בהשוואה לאלו שצרכו פלסבו. פטל (RB) הוריד את לחץ הדם תוך הגברת הביטוי של superoxide dissutase (SOD) בעכברי יתר לחץ דם באופן ספונטני 20 . זה הוכח לאחרונה כי BL, RB, ו BRB להפחית את רמות ROS ו ההזדקנות המושרה על ידי אנגיוטנסין II (אנג II) ב וסקולרים חלקות תאי שריר (VSMCs) 21 . בנוסף, חלק האנתוציאנינים מתמצית BL הפחית את הביטוי של סינתזה חנקתית חנקתית (iNOS) ועכב את פעילותו של גורם גרעיני kappa B (NF-κB) ו- Kinase של תאית (ERK) תאית (ERK) ב- Lipopolysaccharide (LPS) J774 תאיםהתחת = &quot;xref&quot;&gt; 22. תמציות BRB הפחיתו את ההפעלה NF-κB ו cyclooxygenase 2 (COX-2) ביטוי במבחנה 23 , שיפור פרופיל השומנים, ומניעת היווצרות טרשת עורקים בעכברים הזנת דיאטה דלת שומן 24 . אנתוציאנינים, אשר נחשבים flavonoids שופע ביותר של פירות יער, לווסת את התגובה דלקתיים LPS- מגורה RAW 264.7 מקרופאגים על ידי הפחתת הגידול פקטור אלפא (TNF-α) הייצור 25 ולהפחית את התפשטות והגירה של VSMCs 26 . מאז יש כבר עניין הולך וגובר בהבנת התפקיד של polyphenols בבריאות האדם ואת המחלה, חשוב כדי לייעל את שיטת החילוץ. ממיסים ממס הוא בשימוש נרחב למטרה זו, שכן הוא חסכוני לשחזור בקלות. במחקר זה, מיצוי ממס שימש עם אתנול, יחד עם ultioasonic בסיוע extractioN, שהותאמה מקים ולי 27 . הטיהור והתפלגות התמציות הגולמיות (CE) תוך שימוש בכלורופורם ובאתיל אצטט בוצעו כדי להשיג את החלק המופק מטחון (PE) שהותאם מקוויירס ואח &#39; . כמו כן, הושוו היעילות של תמציות פוליפנול גולמיות לעומת מטוהרים מ- BL בהפחתת הזירחון הבסיסי של ERK1 / 2, ודוגמאות מייצגות של ההשפעה המעכבת של תמצית פוליפנול BL מטוהרת על הפחתת אותות המושרה על ידי Ang II ב- VSMCs סופקו.

<table><tbody><tr><td>אנגיוטנסין II</td><td>סיגמא-אולדריץ', בע"מ</td><td>A9525-10MG</td><td>טיפול ב-VSMCs</td></tr><tr><td>&-actin</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>A2228</td><td>נוגדן ראשוני (1:5000)</td></tr><tr><td>פרי פטל שחור</td><td>Mercer Foods</td><td></td><td>אבקת פטל שחור מיובש בהקפאה</td></tr><tr><td>קטלאז&nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>219010</td><td>נוגדן ראשוני (1:1000)</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Biotech Grd, Inc.</td><td>97064-678</td><td>הכנת תמציות פוליפנול מטוהרות</td></tr><tr><td>מדיום הנשר המותאם (DMEM)</td> <td>Mediatech, Inc.</td><td>10-014-CV</td><td>תרבית של VSMCs</td></tr><tr><td>אתנול (דרגת ביולוגיה מולקולרית מוחלטת)</td><td>סיגמא-אולדריץ', בע"מ.</td><td>E7023-500ML</td><td>הכנת תמציות פוליפנולים&nbsp;</td></tr><tr><td>אתילאצטט</td><td>סיגמא-אולדריץ', בע"מ</td><td>439169</td><td>הכנת תמציות פוליפנול מטוהרות</td></tr><tr><td>ERK1/2</td><td>Cell Signaling Technology, Inc.</td><td>9102S</td><td>נוגדן ראשוני (1:500)</td></tr><tr><td>EDTA, 500 מ"מ, pH 8.0</td><td>Teknova, Inc.</td><td>E0306</td><td>מאגר ליזה</td></tr><tr><td>מייבש הקפאה</td><td>Labconco</td><td>VirTis Benchtop K</td><td>הכנת תמציות פוליפנולים</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td> <td>Seradigm</td><td>1400-500</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>H3375</td><td>מאגר ליזה&nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>EMD Millipore, Inc.</td><td>7760</td><td>מאגר ליזה</td></tr><tr><td>NaF</td><td>J.T.Baker, Inc.</td><td>3688-01&nbsp;</td><td>מאגר ליזה</td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>450243</td><td>מאגר ליזיס</td></tr><tr><td>Na4P2O7 , decahydrate</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>S-9515</td><td>מאגר ליזה</td></tr><tr><td>פוספו ERK1/2&nbsp;</td><td>טכנולוגיית איתות תאים, בע"מ</td><td>9101S</td><td>נוגדן ראשוני (1:1000)</td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>P8340-5 מ"ל</td><td>מאגר ליזה</td></tr><tr><td>בדיקת חלבון מגיב צבע</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td><td>500-0006</td><td>מדידת ריכוז חלבון</td></tr><tr><td>ממברנת העברת PVDF</td><td>Thermo Scientific, Inc.</td><td>88518</td><td>כתמים מערביים</td></tr><tr><td>מאייד סיבובי</td><td>Buchi Labortechnik</td><td>Rotavapor R3000</td><td>הכנת תמציות פוליפנולים</td></tr><tr><td>מים סטריליים</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-055-CV</td><td>הכנת תמציות פוליפנולים</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>QSonica, LLC</td><td>Q125</td><td>הכנת תמציות תאים</td></tr><tr><td>SOD2</td><td>Enzo Life Sciences, Inc.</td><td>ADI-SOD-110-F</td><td>נוגדן ראשוני (1:1000)</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>X100</td><td>כתמים מערביים</td></tr><tr><td>Whatman #2 נייר סינון</td><td>GE Healthcare, Inc.</td><td>28317-241</td><td>הכנת תמציות פוליפנולים</td></tr></tbody></table>

מיצוי וטיהור של פוליפנולים מאבקת ברי מיובשים בהקפאה לטיפול בתאי שריר חלקים וסקולריים<em&gt; במבחנה</em

Extraction and Purification of Polyphenols from Freeze-dried Berry Powder for the Treatment of Vascular Smooth Muscle Cells In Vitro

מחקרים אפידמיולוגיים מצביעים על עלייה בצריכת פלבנואידים עם ירידה בתמותה כתוצאה ממחלות לב וכלי דם (CVD) בארה&quot;ב (ארה&quot;ב) ובאירופה. פירות יער נצרכים באופן נרחב בארה&quot;ב ויש להם תוכן פוליפנולי גבוה. פוליפנולים הראו אינטראקציה עם מטרות מולקולריות רבות כדי להפעיל פונקציות ביולוגיות חיוביות רבות, כולל נוגדי חמצון, אנטי דלקתיות, ואפקטים cardioprotective. פוליפנולים המבודדים מאוכמניות (BL), פטל (RB) ופטל שחור (BRB) מפחיתים את הלחץ החמצוני ואת הזיהום הסלולרי בתגובה לאנגיוטנסין II (Ang II). עבודה זו מספקת תיאור מפורט של הפרוטוקול המשמש להכנת תמציות פוליפנול מ גרגרים יבשים להקפיא. תמציות פוליפנול מ אבקת ברי יבשים להקפיא בוצעו באמצעות אתנול מימית 80% ושיטת מיצוי קולי. התמצית הגולמית היתה מטוהרת ומנותקת באמצעות כלורופורם ואתיל אצטט,בהתאמה. ההשפעות של תמציות גס ו מטוהרים נבדקו על כלי הדם חלקות תאים (VSMCs) בתרבות.

הוכח בעבר שתמציות פוליפנול המבודדות מ- BL, RB ו- BRB הפחיתו את ההזדקנות של VSMCs בתגובה ל- Ang II 21 . זה הוכח כי אלה מטוהרים פוליפנול שואבת לווסת את אנג II איתות על ידי הפחתת זרחון של Akt, P38 מיטוגן המופעל חלבון קינאז (MAPK), ו ERK1 / 2. BL מונע הזיהום על ידי הפחתת הביטוי של NADPH oxidase (NOx) 1, אנזים המייצר אניס סופרוקסיד והוא upregulated חזק על ידי אנג II. לעומת זאת, RB ו- BRB מונעים הזיהום על ידי מנגנון שאינו תלוי בנו...

עבודה זו מפרטת שיטה שלב אחר שלב להכנת תמציות פוליפנול עשיר מאבקת יער מיובש בהקפאה. בנוסף, הוא מספק תיאור יסודי של איך להשתמש אלה poliphenol עשיר תמציות בתרבית תאים בנוכחות של הפפטיד הורמון אנגיוטנסין II (Ang II) באמצעות כלי דם וסקולרים חלקות (VSMCs).

Epidemiological studies indicate that increased flavonoid intake correlates with decreased mortality due to cardiovascular diseases (CVD) in the United ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לספק שיטה פשוטה וניתנת לשחזור למיצוי וטיהור של פוליפנולים מצמחים, שניתן יהיה להשתמש בהם לטיפול בתאים בעתיד. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בנוגע לתפקידן של מזונות פונקציונליים בבריאות האדם ובמחלות. מיצוי פוליפנולים זה, המבוסס על אתנול ומסייע באולטרסאונד, הוא שיטה פשוטה וניתנת לשחזור המאפשרת תפוקה גבוהה יותר של פוליפנולים.השימוש בכלורופורם מאפשר הסרה של סוכרים, חומצות שומן, חלבונים ומולקולות אחרות, בעוד שאצטט אתיל מאפשר שיוך polyphenol לפרקשנים. ניתן להשתמש בתמציות polyphenol רכזות אלו במערכות in vitro ו-in vivo כדי לחקור את השפעותיהם של polyphenol ואת מנגנוני הפעולה שלהם על רקמות שונות, כולל מערכת הלב וכלי הדם, כפי שמתואר כאן. כדי להתחיל בהליך זה, הכינו את הריאגנטים כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב.בשלב הבא, שקלו 10 גרם של אבקת אוכמניה מיובשת בהקפאה. הוסיפו את אבקת הפירות לבקבוק עם תחתית עגולה בנפח של ליטר אחד המכיל 100 מיליליטר של אתנול מימי בריכוז 80%. הניחו את הבקבוק באמבט אולטרסוניסטית בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.תחת שטיפה רציפה של חנקן ובאור עמום, בצעו סוניקציה לתערובת למשך 20 דקות בתדר של 42 kilohertz ובהספק של 135 watts. לאחר מכן, השתמשו במשפך ביכנר מקורר עם שאיבת ואקום כדי לסנן את התערובת דרך נייר סינון מספר 2. שטפו את עוגת הסינון ב-50 milliliters של 100%ethanol.שמרו את התסנין והוסיפו את משקע הסינון לבקית עגולה בת נפח של ליטר אחד המכילה 100 milliliters של אתנול מימי בריכוז 80%. לאחר מכן, חזרו על תהליך המיצוי באמצעות סוניקציה, סינון ושטיפה של התערובת. ש combining את שני התסנינים בבקית עגולה המכילה 50 milliliters של אתנול מימי בריכוז 80%.השתמש במאדה סיבובי (rotary evaporator) בטמפרטורה של 62 °C ובמהירות של 50 rpm כדי לאדות את הממס. המשך בתהליך עד להפסקת אידוי האתנול. לאחר מכן, העבר את הדגימה לפרונטה (conical tube) בנפח של 50 ml.הזרימו גז חנקן בחלקו העליון של המבחנה למשך 10 דקות כדי לאדות את שאריות האתנול. הקפיאו את הדגימה בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפחות. לאחר מכן, בצעו ליישוף (freeze dry) של הדגימה בטמפרטורה של 50- מעלות צלזיוס למשך כשמונה שעות.יש לאחסן את הדגימות בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס עד למועד השימוש. לתחילת הפעולה, שקלו את הדגימות המופקות והמייבשות בהקפאה. הוסיפו כ-20 milliliters של כלורופורם לכלי כימי של 100 milliliters המכיל את הדגימה.בעזרת פלטת ערבוב, ערבבו את התמיסה למשך חמש דקות. לאחר מכן, שפכו את התערובת למשפך הפרדה. הניחו לתמצית הגולמית לשקוע למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, השליכו את השכבה התחתונה ואספו את השכבה המימית לכוס כימית נקייה. הוסיפו לכוס כימית שני נפחים של ethyl acetate. בעזרת מגנט ערבוב, ערבבו את התערובת במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.בשלב הבא, השתמשו במשפך בוכנר מקורר עם שאיבת ואקום כדי לסנן את התערובת דרך נייר סינון מספר 2. העבירו את הדגימה המסוננת לבקבוק תחתית עגולה. בעזרת מאיד סיבובי בטמפרטורה של 62 °C ובמהירות של 50 rpm, אידו את האתיל אצטט במשך 30 דקות.לאחר מכן, ייבשו את הדגימה בהקפאה בטמפרטורה של 50- מעלות צלזיוס למשך שמונה שעות. העבירו את הדגימה למבנה קוני של 50 מיליליטר ואחסנו בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס עד למועד השימוש. לאחר גידול תאי שריר חלק וכלי דם, השליכו את מצע הגידול ושטפו את התאים פעמיים עם phosphate buffered saline.לאחר מכן, הוסיפו ארבעה מיליליטרים של PBS ושני מיליליטרים של 0.25%Trypsin-EDTA. הדגרו באינקובטור פחמן דו-חמצני בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך חמש דקות. לאחר מכן, העבירו את התאים לפרוטוקול של מבחנה לצנטריפוגה בנפח 15 מיליליטר המכילה שני מיליליטרים של מצע גידול מלא.סובב במערך צנטריפוגה במהירות של 1,100 ×g למשך חמש דקות. השלך את הנוזל העליון (supernatant) ותלה מחדש את משקע התאים במיליליטר אחד של PBS. ספור את התאים באמצעות המוסימטר (hemocytometer).לאחר מכן, זרעו 50,000 תאים לכל באר בצלחות תרבית בעלות שש בארות. גדלו את התאים עד להגעה ל-90% confluency במצע מלא המכיל 10% fetal bovine serum. הכינו את מצע הטיפול כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב ושמרו אותו בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן, הוסיפו 10 מיליגרם של תמצית גולמית או מזוקקת למיליליטר אחד של DMEM רגיל כדי להכין תמיסת מלאי בריכוז של 10 מיליגרם למילליטר. אחסנו את תמיסת המלאי במנות של 200 מיקרוליטר בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסיפו לתאים שני מיליליטר של מדיום טיפול, המכיל 0.5% fetal bovine serum וריכוז רצוי של תמיסת המלאי.דגרו למשך שלושה ימים בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור לח עם 5% CO2. לאחר מכן, במקרה של טיפול בהורמונים או גורמי גדילה, השקיעו את התאים ברעב למשך לפחות 24 שעות על ידי דגירה במצע טיפול המכיל 0.5% fetal bovine serum. לאחר הרעב, הוסיפו את ההורמון הרצוי, והחליפו את מצע הטיפול בכל 24 שעות למשך שלושה ימים, כמפורט בפרוטוקול הכתוב.בשלב הבא, שטפו את התאים שעברו טיפול פעמיים ב-PBS קר. lysed את התאים באמצעות 200 microliters של lysis buffer על קרח. בעזרת גוררי תאים (cell scrapers), אספו את הליזט התאי והעבירו אותו לשפרו של מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 milliliter.הדגרימו את הליזט שנאסף למשך 20 דקות על קרח, תוך써 ערבוב במכשיר vortex כל חמש דקות. לאחר מכן, בצעו סוניקציה לתמריתי התאים באמצעות שלושה פרצים בהספק של 125 watts למשך 10 שניות כל אחד, עם הפסקה של שתי שניות בין פרץ לפרץ. מדדו את ריכוז החלבון באמצעות ריאגנט לבדיקת חלבון באורך גל של 595 nanometers.ערבבו 50 micrograms של חלבון עם lysis buffer כדי להגיע לנפח כולל מקסימלי של 50 microliters. הוסיפו 16 microliters של 4x Laemmli sample buffer. לאחר מכן, חממו את הדגימות למשך חמש דקות ב-75 degrees Celsius.הפרידו דגימות בג'לים של 10%SDS-PAGE והעבירו אותן לממברנות PVDF לצורך אנליזת Western blot עם נוגדנים ספציפיים. במחקר זה, נעשה שימוש במיצוי מבוסס אתנול כדי לזהות את הרמות השונות של חומצות פנוליות ופלבנואידים הנמצאים בתמציות פוליפנול של פטל גולמיים ומזוקקים. בעוד שתהליך הזיקוק לא שינה באופן משמעותי את הרמות של gallic acid או p-coumaric acid, הוא העלה את הרמות של 3-O-caffeoylquinic acid מ-170.5 ל-235.3 ppm ואת הרמות של Quercetin מ-24.5 ל-95 ppm.לעומת זאת, חומצה פרולית (Ferulic acid) ורוטין (Rutin) אובדו במהלך טיהור התמצית הגולמית. לאחר השליפה, VSMCs הודגרו בריכוז של 50 עד 500 micrograms per milliliter של תמצית אוכמניות גולמית או מטהרת, בתוך מצע הכיל 0.5% fetal bovine serum למשך שלושה ימים. נראה כי שתי התמציות יעילות בהפחתת הפספורילציה הבסיסית של ERK.עם זאת, נראה כי התמצית המזוקקת גורמת לבריסולה (down regulation) חזקה בריכוז של 100 µg/mL, בעוד שנדרש ריכוז של 400 עד 500 µg/mL של תמצית גולמית. הדבר מרמז כי היעילות הגבוהה יותר של התמצית המזוקקת בעיכוב פוספורילציה של ERK נובעת מהריכוזים הגבוהים יותר של תרכובות פוליפנול שבה. לאחר מכן, תאי VSMCs מטופלים במשך 24 שעות עם 200 µg/mL של תמצית אוכמניות מזוקקת לפני הוספה של 100 nM של angiotensin II. כפי שדווח בעבר, תמצית הפוליפנול מאוכמניות מפחיתה פוספורילציה של ERK המושרה על ידי angiotensin II, אך אינה מראה השפעה על ביטוי של catalase או SOD2.לאחר השליטה בטכניקה, ניתן להכין מיצוי פוליפנולים בתוך מספר שעות. טכניקה זו יכולה לסייע לחוקרים בתחום המזונות הפונקציונליים לבחון את תפקידם של פוליפנולים in vitro ובמודלים של בעלי חיים. לאחר צפייה בסרטון זה, תוכלו למצות ולטהר פוליפנולים מפירות וירקות ולהשתמש בתמציות הפוליפנולים לטיפול בתאים בתרבית.השתמשנו בשיטה זו כדי להדגים את תפקידם של פוליפנולים מסימסימון (blackberry) במניעת הזדקנות של תאי שריר חלק כלי דם באורטה. לדבר זה יש חשיבות רבה, בהתחשב בכך שהזדקנות של מערכת כלי הדם היא גורם סיכון מרכזי להתפתחותן של מחלות קרדיווסקולריות.

extraction-purification-polyphenols-from-freeze-dried-berry-powder

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

. הנה, מתוארים bioassays שנועד לעקוב אחר ההתפתחות של חיידקים פטריות, Colletotrichum fioriniae, בנוכחות תמציות פרחים עם אוכמניות או חמוציות על coverslips זכוכית דקה. מים, כלורופורם- ו שדה מי גשמים - מבוסס פרחוני מיצוי טכניקות מפורטים כמו גם תובנה איך המידע הזה יכול להיות מיושם.

Colletotrichum fioriniae פיתוח מים ותמציות פרחים מבוסס כלורופורם אוכמניות, חמוציות

על מנת לבודד ולטהר את קרום הלב למחקרים בסיסיים ולחקור את הפוטנציאל הטיפולי של הביולוגיה שלהם.

בידוד וטיהור של קרום הלב של מורלין

אנחנו מציגים פרוטוקול להפקת. קרום המוח של מורציטים פרוטוקול זה הינו כלי רב ערך עבור מחקרים בלתי מתורבת המספקים טוהר גבוה ותשואה גבוהה, ובכך מקטין את מספר החיות הנסיוניות המשמשות.

שיטת פלט גבוהה כדי לבודד קרום הלב של מוחין מהעכבר

מטרת פרוטוקול זה היא לזהות מטבוליטים פנוליים בפלזמה באמצעות שיטת ספקטרומטריה כרומטוגרפיה-מסה ממוקדת למחצה.

כרומטוגרפיה אולטרה-גבוהה ממוקדת למחצה בשילוב ניתוח ספקטרומטריה המונית של מטבוליטים פנוליים בפלזמה של קשישים

ניתן לחקור תגובות וסקולריות של זרימת הדם הריאתית העורקית באמצעות עורק תוך פולמונרי (IPA) ותאי שריר חלק וסקולריים (VSMCs). המחקר הנוכחי מתאר בפירוט את הבידוד של IPA ואת הפרוטוקולים המשמשים לחקר vasorelaxation בתגובה לגירויים פיזיולוגיים.

בידוד של עורקים תוך-ריאתיים ותאי שריר חלק כדי לחקור תגובות כלי דם

הפרוטוקול הנוכחי מתאר אסטרטגיה משולבת לחקר המטרות והמנגנונים העיקריים של Fructus Phyllanthi נגד היפרליפידמיה המבוססת על חיזוי פרמקולוגיה של הרשת ואימות מטבולומי.

חיזוי פרמקולוגיה ברשת ותיקוף מטבולומיקה של מנגנון פרוקטוס פילנתי נגד היפרליפידמיה

כאן, אנו מציגים שיטת הערכת יציבות המבוססת על טכנולוגיות פיזור אור מרובות כדי להעריך את היציבות של תמציות הרפואה הסינית המסורתית.

שימוש בפיזור אור מרובים כדי לבחון את היציבות של תמציות Phyllanthus emblica L. המתקבלות בשיטות מיצוי שונות

פרוטוקול זה מפרט את השימוש בשיטת מיצוי מבוססת פוליאול בסיוע מיקרוגל למיצוי תרכובות פנוליות ונוגדי חמצון טבעיים, המייצגת גישה מעשית ובת קיימא מבחינה סביבתית לפיתוח תמציות מוכנות לשימוש.

מיצוי בסיוע מיקרוגל של תרכובות פנוליות ונוגדי חמצון ליישומים קוסמטיים באמצעות טכנולוגיה מבוססת פוליאול

פרוטוקול זה מתאר גבוה באמצעות שיטת colorimetric לשים המסתמכת על היווצרות מורכבת בין יוד ושרשרות של מולקולות גלוקוז בעמילן. יוד יוצרת קומפלקסים עם שני amylose ושרשרות ארוכות בתוך amylopectin. לאחר התוספת של יוד לדגימת עמילן, הספיגה מקסימלית של amylose וamylopectin מתרחשת ב620 ו550 ננומטר, בהתאמה. יחס amylose / amylopectin ניתן להעריך מהיחס של ערכי ספיגת ננומטר 620 ו550 ומשווה אותם לעקומת סטנדרט שבו ריכוזים ספציפיים ידוע הם זממו נגד ערכי קליטה. תפוקה גבוהה, שיטה זולה היא אמינה לשחזור, ומאפשרת...

קביעה המהירה amylose התפוקה גבוה בדוגמאות פקעת תפוח האדמה להקפיא יבשים

אוריגמי DNA היא שיטה רבת עוצמה לייצור אובייקטים ננומטריים מדויקים על ידי תכנות ההרכבה העצמית של מולקולות DNA. כאן אנו מתארים פרוטוקול לקיפול של רובוט מגיב ביולוגית מאוריגמי DNA, טיהורו וצביעתו השלילית להעברת הדמיה מיקרוסקופית אלקטרונית (TEM).

מתקפל ואפיון של רובוט ביו-תגובה מה- DNA אוריגמי

למדו פרוטוקול למיצוי וטיהור פוליפנולים מאבקת פירות יער מיובשים בהקפאה באמצעות חליטה אולטרסונית באתנול. השיטה מאפשרת הכנת תמציות עשירות לטיפול בתאי שריר חלקים וסקולריים ולחקר השפעותיהם הקרדיווסקולריות.

מיצוי וטיהור של פוליפנולים מאבקת ברי מיובשים בהקפאה לטיפול בתאי שריר חלקים וסקולריים

גלה סרטונים נוספים