גישה אבולרית מדויק עבור דוגמנות פגיעה בכליות חריפה בפיתוח דג הזברה
3 ביוני 2017
עבודה זו מציגה מודל חדש של vivo של פגיעה בכליות קטועי באמצעות דג הזברה הכליה GFP כליה. המודל מאפשר אינדוקציה של אבלציה ממוקד של תאים כלית אפיתל להראות את המנגנונים הסלולר של פגיעה נפרון ותיקון.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להשריץ אבלציה ממוקדת של תאי אפיתל בכליות של דגי זברה (Zebrafish) כדי לדגמן פגיעה ושיקום של הנפרון. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום רגנרציה של איברים, ובמיוחד של הכליות. למשל, מהם התהליכים התאיים העיקריים המעורבים ברגנרציה, מהו היקף הפלסטיות של הרקמות השורדות, ושאלות רבות נוספות.
היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת שליטה מרחבית-זמנית מדויקת בפגיעה, וכן את היכולת להתאים את רמת הפגיעה. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול או אבחון של פגיעה כלייתית חריפה, מכיוון שהיא מאפשרת הערכה מרחבית וזמנית מדויקת של תהליכים תאיים ומולקולריים המעורבים בפגיעה בתאי הכליה ובהתרגנרותם. כדי להתחיל, הפקו עוברים על ידי הכלאה של דגי Zebrafish עם פלואורסצנציית GFP בכליות.
במשך 24 שעות לאחר ההפריה, יש להחזיק את העוברים בתמיסת E3 בטמפרטורה של 28.5 degree celsius. לאחר מכן, יש להחליף את מצע ה-E3 בתמיסת E3 המכילה 0.003%PTU. החזירו את העוברים לאינקובטור למשך שישה ימים או יותר, עד לשלב שבו הכליות יהיו בשלות.
כדי לקבע את דגי הזברה (Zebrafish) לצורך דימוי חי, הכינו תמיסת אגרוז בנקודת התכה נמוכה בריכוז 1% עד 2% עם 0.2 milligrams per milliliter של תמיסת trigaine. ודאו שתמיסת ה-agarose trigaine קרה לפני השימוש בפיפטית פלסטיק או זכוכית להעברת עובר לתוך התמיסה. לאחר מכן, בעזרת פיפטית העברה, שאבו את הזחל יחד עם האגרוז והניחו אותו במרכז צלחת של 35 millimeter.
פזרו במהירות את האגרוז הכולל את דגי הזבrafish כדי לכסות באופן אחיד את תחתית הצלחת. לאחר מכן, השתמשו במוט זכוכית כדי למקם את הזחול לצורך פוטו-אבליציה ודימוי, כך שמקטע הכליה הרלוונטי יהיה מאונך לנתיב הקרן, בעוד המקטע הצדי (contralateral) יהיה רחוק מקרן הלייזר. מיקומו של דג הזבrafish הוא קריטי לשלבים הבאים הכוללים אבליציה בלייזר.
מומלץ להשתמש בטכניקה טובה כדי להבטיח שהזחלים ישמרו על מיקום ניצב באגרוז. כסו את צלחת הפטרי כדי למזער אידוי והמתינו כ-15 דקות עד שהאגרוז יתקשה. לאחר הגדרת מיקרוסקופ הקונפוקל, בהתאם לפרוטוקול הכתוב, בתצורת זקוף (upright), מקמו את צלחת הפטרי המכילה את הזחל על גבי זכוכית מיקרוסקופ והשתמשו בחימר פיסולי כדי לקבע אותה במקומה.
בשלב הבא, מקמו את צלחת הפטרי הנחלקת על במה המיקרוסקופ. לאחר מכן, הוסיפו 3 mL של תמיסת דימוי. תחת עדשת טבילה במים, העלו לאט את הבמה, תוך וידוא שהעדשה נמצאת בזווית קלה כדי למנוע כלואת בועות אוויר בנתיב הקרן.
ברגע שהעדשה נוגעת בתמיסה בזווית, מרכז אותה כך שתהיה בשדה הראייה באזור העובר. כעת, באמצעות מקור האור הפלואורסצנטי, אתר את המקטע הרלוונטי, ולאחר מכן בצע פוקוס על הענף השטחי כדי לסמן אותו לפגיעה. הענפים השטחיים נבחרו כדי למזער את פיזור האור.
בתוכנת המיקרוסקופ, נווט לתפריט view, לאחר מכן ל-acquisition control, ואז ל-C2plus compact GUI. הגדר את זמן השהיית הפיקסל (pixel dwell time) ל-1.9 microseconds, את גודל הפריים ל-512 על 512 pixels ואת גודל ה-pinhole ל-90 microns. הגדר את עוצמת הלייזר של 405 nanometer לאפס ואת עוצמת הלייזר של 488 לערך נמוך.
בזמן השימוש בלייזר 488 nanometer, לחצו על scan בממשק התוכנה. אתרו את המקטע הרלוונטי שמאונך למסלול הקרן ושממנו מתקבלת ויזואליזציה טובה עם פלואורסצנציית GFP גבוהה. לאחר זיהוי אזור זה, עברו ל-ROI, ובחרו ב-draw elliptic ROI כדי לצייר אזור עניין.
בשלב הבא, נווטו לתפריט view, לאחר מכן ל-acquisition controls, ואז ל-C2plus scan area ובחרו ב-band scan area; המסכה המלבנית תופיע בממשק זה. באמצעות הסמן, הגדירו ידנית סריקה מלבנית שתכסה את המקטע המיועד לאבליציה בלייזר. לחצו קליק ימני בתוך אזור המסכה כדי לאשר את הבחירה.
השתמשו בלייזר 488 nanometer בלבד להפעלת GFP, והתחילו במדידת הזמן תוך ניטור הערוץ הירוק. ודאו שעוצמת לייזר ה-488 נמוכה יחסית. מדדו את העוצמה הממוצעת של ה-GFP באזור העניין על ידי בחירה ב-measure, time measurement.
השתמשו בלשונית הגרף או הנתונים כדי לנטר את רמות העוצמה הממוצעות בתוך ה-ROI. באמצעות הלייזר הסגול, גרמו נזק לתאי הכליה על ידי העלאת העוצמה ל-100% באמצעות הזזת בקר הספק הלייזר עד קצה הימין. בלשונית הגרף, עקבו אחר הגרף הקווי, או השתמשו בלשונית הנתונים כדי לצפות בערכים המספריים של עוצמת ה-GFP, והמתינו עד שהיא תירד לרמה הרצויה.
לדוגמה, 50% מקו הבסיס. ברגע שעוצמת ה-GFP בתוך ה-ROI האליפטי ירדה לרמה הרצויה, יש להפחית מיד את עוצמת הלייזר הסגול לאפס בלוח הבקרה של התוכנה על ידי הזזת מדף עוצמת הלייזר עד קצה שמאל. לבסוף, יש לקבוע קו בסיס חדש של פלואורסצנציית GFP.
כפי שמוצג בדמות זו, לאחר חשיפה לאור לייזר באורך גל של 405 ננומטר, פלורסצנציית ה-GFP ממשיכה להיעלם תא אחר תא. עד לדקה ה-220, כל מקטע הבלע (ablate segment) מאבד 100% מהחיוביות ל-GFP. הדבר נובע ממוות תאיים ולא מהסדרה מורידה (down regulation) של ביטוי ה-GFP, כפי שניתן לראות מהופעת גרעינים חיוביים לפרופידיום יודיד פלורסצנטי אדום בתאים שאיבדו את החיוביות ל-GFP.
תמונות אלו מדגימות כי על ידי שינוי החשיפה הראשונית, ניתן לכייל את הפגיעה ואת התגובה של האפיתל הפגוע. בפיבליצ'ינג פוטו-כימי (photo bleaching) ראשוני של GFP בשיעור של 10% עד 20%, כמעט ולא נצפתה ירידה בחיוביות ל-GFP חמש שעות לאחר הפגיעה. חשיפה של 50% ו-60% מובילה להיעלמות מוחלטת של ה-GFP לאחר חמש שעות, בעוד שפיבליצ'ינג של 30% ו-40% מוביל לתוצאות ביניים, כאשר שיעור מוות מוערך של 50% נצפה בערך ב-35% פיבליצ'ינג פוטו-כימי.
דבר זה נתמך על ידי צביעה ב-propidium iodide, שבה הבהרה פוטוכימית (photo bleaching) של 20% גורמת לכמעט היעדר צביעה ב-propidium iodide ב-100 דקות לאחר האבליציה. לעומת זאת, הבהרה פוטוכימית של 50% מובילה לחיוביות רציפה של propidium iodide באפיתל שעבר אבליציה, לאחר 60 דקות. בעוד שהבהרה פוטוכימית של 30% ו-40% מובילה לשילוב ביניים של propidium iodide.
ברגע שהטכניקה נשלטת, ניתן לבצעה בתוך 30 דקות אם היא מבוצעת כראוי. יש לזכור שעבודה עם לייזרים וריאגנטים כימיים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות בעת ביצוע פרוצדורה זו, כגון הימנעות מהסתכלות ישירה על קרן הלייזר ושימוש בכפפות בעת טיפול בחומרים כימיים. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות נוספות כגון מיקרוסקופיה של צילומי רצף (time lapse microscopy), צביעת אימונופלואורסצנציה ואחרות, כדי לענות על שאלות נוספות המכוונות לניתוח פגיעה וכריתה של הכליות ברמה התאית והמולקולרית.
לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום התחדשות הכליות. זאת כדי לבחון את תפקידה של נדידה תאית קולקטיבית ותיקון של הכליה לאחר פגיעה בדגי zebrafish. לאחר צפייה בסרטון זה, תגמרו עם הבנה טובה של אופן השימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לגרום לפגיעה במקטעי כליה ספציפיים בזריקים ועוברים של zebrafish טרנסגניים מסוג GPF.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה מדויקת להשראת אבלציה ממוקדת של תאי אפיתל בכליה בזריקי דגי zebrafish באמצעות פוטו-אבלציה בלייזר. גישה זו מאפשרת מידול מבוקר של פגיעה ושיקום בנפרון, ומספקת מערכת in vivo חסונה לחקר מנגנוים של פגיעה חריפה בכליות (AKI) ברמה התאית. הטכניקה מציעה יתרונות משמעותיים על פני מודלים פרמקולוגיים מסורתיים בכך שהיא מאפשרת בקרה מרחבית-זמנית ורמות פגיעה ניתנות לכיוונון.
מרכיבי מפתח במחקר
תחום מדע
- רפואה רגנרטיבית
- נפרולוגיה
- ביולוגיה תאית
- מחקר באורגניזמי מודל
רקע
- AKI הוא מצב שכיח עם שיעורי תמותה גבוהים, והבנת מנגנוני מוות ותיקון של תאי הנפרון חיונית לשיפור התוצאות הקליניות.
- הפרונפרוס של דג הזברה חולק דמיון אנטומי לנפרון של יונקים, מה שהופך אותו למודל בעל ערך למחקר של הכליות.
- מודלים מסורתיים של פגיעה המושרה על ידי gentamicin חסרים שליטה מדויקת במיקום ובתוזמון הפגיעה.
- קיים צורך בשיטות המאפשרות מחקר מפורט של תהליכים תאיים ומולקולריים במהלך פגיעה והתחדשות של הכליות.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לאבלאציה ממוקדת ונשלטת של מקטעי נפרון ספציפיים בזריקי דגי zebrafish.
- מתן אפשרות לחקירה מדויקת של מנגנוני פגיעה ושיקום של הכליות in vivo.
- אספקת פלטפורמה לחקר פלסטיות תאית ותהליכי רגנרציה בעקבות פגיעה בנפרון.
שיטות שהשתמשו בהן
- הפקת עוברים של דגי זברה המבטאים GFP באמצעות הכלאות גנטיות.
- הכנה וקיבוע של זחלים באגרוז בעל נקודת התכה נמוכה לצורך הדמיה חיה.
- מיקום הזחלים כך שקטע הכליה הרלוונטי יהיה חשוף לצורך אבלציה בלייזר.
- שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית ובלייזר סגול באורך גל של 405 nm כדי להשריץ פוטואבלציה מבוקרת של קטעי נפרון חיוביים ל-GFP.
- ניטור היקף הפגיעה באמצעות עוצמת פלואורסצנציית GFP וצביעה ב-propidium iodide להערכת מוות תאי.
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת בקרה מרחבית וזמנית מדויקת על פגיעה בנפרונים בזריקים של דגי זברה.
- חוקרים יכולים "לכוונן" את רמת הפגיעה על ידי התאמת החשיפה ללייזר, מה שמוביל לתגובות מדורגות של מוות תאי.
- אובדן פלואורסצנציית GFP נמצא במתאם עם מוות תאי, כפי שאושר על ידי צביעה ב-propidium iodide.
- הטכניקה מאפשרת השראה מהירה ועקבית של פגיעה, ובכך מקלה על ניתוחים המשכיים כגון מיקרוסקופיית time-lapse ואימונופלואורסצנציה.
מסקנות
- שיטת אבלציית הלייזר הזו מספקת כלי רב עוצמה לחקר פגיעה בכליות ותיקונה ברמה התאית in vivo.
- היא מתגברת על מגבלות של מודלים קודמים על ידי הצעת בקרה מדויקת על מיקום הפגיעה וחומרתה.
- לגישה זו יישומים רחבים לחקר מנגנוני רגנרציה, והיא עשויה להנחות אסטרטגיות טיפוליות עבור AKI.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
אבלציה תאית מדויקת בדגי zebrafish מאפשרת מידול מבוקר של פגיעה חריפה בכליות (AKI), ובכך נותנת מענה לצורך קריטי בהסרת סיכונים מנגנונית בתהליכי תיקוף של מטרות כלייתיות. גישה זו מספקת שליטה מרחבית-זמנית על פגיעה בנפרונים, ובכך תומכת בביטחון חיזוי בשלבי הגילוי המוקדמים ובמחקר תרגומי. השחזרות של השיטה ותוצריה הכמותיים ממצבים אותה כפלטפורמה חסונה לקידום תהליכי הפיתוח ולשילוב מו"פ רב-תחומי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של מנגנוני פגיעה ותיקון בנפרון ברזולוציה של סגמנט בודד.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי מתן אפשרות לוויסות מדויק של חומרת הפגיעה ומיקומה.
- מסייע בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות תצפית ישירה על תגובות רגנרטיביות.
- משפר את רמת הביטחון החזויה עבור היפותזות טיפוליות כליתיות ותיעדוף תיקי פיתוח.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- מכין מודלים מתוקשפים של דגי זברה המגיבים לפגיעה, עבור סריקת תרכובות בהמשך התהליך.
- מספק השראה סטנדרטית וניתנת לשחזור של פגיעה עם תוצאים מדידים.
- מאפשר פיתוח של בדיקות הניתנות להרחבה (scalable) על ידי התאמת רמות הפגיעה וניטור תוצאים תאיים.
- תומך בהערכה מהימנה של התערבויות מועמדות במערכת חולית חיה.
מחקר תרגומי ופקליני
- מתואם עם מודלים של AKI הרלוונטיים למחלה לצורך חקירת ביומרקרים תרגומיים.
- מספק רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של מנגנוני שיקום כלייתיים.
- מאפשר קבלת החלטות על קידום מבוסס התאמת סיכונים על בסיס יכולת התחדשות in vivo.
- מציע הפחתת סיכונים מנגנונית עבור מטרות כלייתיות לפני מחקרים ביונקים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטה זו מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים למחקר הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות למידול פגיעות מונחה-היפותזה, קריאות כמותיות ותהליכי עבודה אנליטיים המשכיים בדגי zebrafish.
- ביולוגיה של תגליות: תומך בבדיקת השערות לגבי מוות ותיקון של תאי נפרון באמצעות השראה מדויקת של פגיעה.
- סריקה: מספק מודלים של פגיעה הניתנים לשחזור ולכימות לצורך הערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספק מדידות כמותיות של פלואורסצנציה ומוות תאי להשוואה בין תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין מודלים של פגיעה בדגי zebrafish לרלוונטיות של AKI ביונקים ולמחקרי סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה סטנדרטית וניתנת לשימוש חוזר למחקר של פגיעה והתחדשות כלייתית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות כלייתיות.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) של תהליכי עבודה למידול פגיעות.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) ואת היעילות ההונית על ידי מתן אפשרות להפחתת סיכונים בשלבים מוקדמים באופן חסון.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום של תוכניות טיפוליות כלייתיות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות במיקרוסקופיה קונפוקלית וטיפול בדגי סוסים (zebrafish).
- נדרשת גישה לציוד עבור אבלציה בלייזר ולתשתית לדימוי פלואורסצנציה.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי השראת הפגיעה ומדידת התוצאות.
- ייתכן שיהיה צורך בהתאמה עבור מקטעים שונים של הנפרון או שלבי התפתחות שונים.
- מגבלות מעשיות כוללות בטיחות בלייזר והצורך באוריינטציה מדויקת של העובר.
