Name: מדידת חלבון מחייב F- אקטין על ידי שיתוף שקיעה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: למד מדידת אינטראקציות חלבון-F-actin באמצעות שיתוף שקיעה. שיטה זו מאפשרת לכמת את חוזק הקישור בין חלבונים לסיבי אקטין תוך שימוש באולטרה-צנטריפוגה בלבד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות גרנט HL127711 ל AVK.

<ol><li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+and+Actin-Binding+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Actin and Actin-Binding Proteins.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (8), (2016).</li>
<li>Hansen, M. D., Kwiatkowski, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+actin+dynamics+by+allosteric+regulation+of+actin+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of actin dynamics by allosteric regulation of actin binding proteins.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 303, 1-25 (2013).</li>
<li>Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-binding+proteins%3A+the+long+road+to+understanding+the+dynamic+landscape+of+cellular+actin+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Actin-binding proteins: the long road to understanding the dynamic landscape of cellular actin networks.</a> Mol Biol Cell. 27 (16), 2519-2522 (2016).</li>
<li>Mullins, R. D., Hansen, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+studies+of+actin+filament+and+network+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro studies of actin filament and network dynamics.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (1), 6-13 (2013).</li>
<li>Miller, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Danio+rerio+alphaE-catenin+is+a+monomeric+F-actin+binding+protein+with+distinct+properties+from+Mus+musculus+alphaE-catenin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Danio rerio alphaE-catenin is a monomeric F-actin binding protein with distinct properties from Mus musculus alphaE-catenin.</a> J Biol Chem. 288 (31), 22324-22332 (2013).</li>
<li>Wickline, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alphaT-Catenin+Is+a+Constitutive+Actin-binding+alpha-Catenin+That+Directly+Couples+the+Cadherin.Catenin+Complex+to+Actin+Filaments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">alphaT-Catenin Is a Constitutive Actin-binding alpha-Catenin That Directly Couples the Cadherin.Catenin Complex to Actin Filaments.</a> J Biol Chem. 291 (30), 15687-15699 (2016).</li>
<li>Simpson, R. J., Adams, P. D., Golemis, E. <a target="_blank" href="http://www.cshlpress.org/default.tpl?cart=148475793033306084&fromlink=T&linkaction=full&linksortby=oop_title&--eqSKUdatarq=678">Basic methods in protein purification and analysis : a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2009).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Dyballa, N., Metzger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+sensitive+colloidal+coomassie+G-250+staining+for+proteins+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels.</a> J Vis Exp. (30), (2009).</li>
<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+simple+and+informative+binding+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">A guide to simple and informative binding assays.</a> Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).</li>
<li>Hansen, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alphaE-catenin+actin-binding+domain+alters+actin+filament+conformation+and+regulates+binding+of+nucleation+and+disassembly+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">alphaE-catenin actin-binding domain alters actin filament conformation and regulates binding of nucleation and disassembly factors.</a> Mol Biol Cell. 24 (23), 3710-3720 (2013).</li>
<li>Perrin, B. J., Ervasti, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actin+gene+family%3A+function+follows+isoform%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">The actin gene family: function follows isoform.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 67 (10), 630-634 (2010).</li>
<li>Tondeleir, D., Vandamme, D., Vandekerckhove, J., Ampe, C., Lambrechts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+isoform+expression+patterns+during+mammalian+development+and+in+pathology%3A+insights+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Actin isoform expression patterns during mammalian development and in pathology: insights from mouse models.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 798-815 (2009).</li>
<li>Prochniewicz, E., Janson, N., Thomas, D. D., Dela Cruz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin+increases+the+torsional+flexibility+and+dynamics+of+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cofilin increases the torsional flexibility and dynamics of actin filaments.</a> J Mol Biol. 353 (5), 990-1000 (2005).</li>
<li>Kuhn, J. R., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+measurements+of+actin+filament+polymerization+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 88 (2), 1387-1402 (2005).</li>
<li>Hansen, S. D., Zuchero, J. B., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+actin%3A+purification+and+single+molecule+assembly+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic actin: purification and single molecule assembly assays.</a> Methods Mol Biol. 1046, 145-170 (2013).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

אקטין שיתוף assay משקע היא טכניקה פשוטה שיכולה לקבוע במהירות אם חלבון נקשר F- אקטין. עם כמה שינויים, הטכניקה יכולה לשמש גם כדי למדוד את הזיקה של האינטראקציה. בנוסף נקודות שהועלו בפרוטוקול לעיל, הנושאים הבאים יש לקחת בחשבון בעת ​​תכנון, ניסוי, ופרשנות assay. חלבון של עניין חלבון מוכן טרי או קפוא ניתן להשתמש assay. אם חלבון קפוא משמש, מומלץ מאוד להשוות את התוצאות עם חלבון טרי (מעולם לא קפוא) כדי להבטיח כי הקפאה אינה משפיעה על F- אקטין מחייב. מקור G- אקטין רבים ניסויים peliting להשתמש G- אקטין מבודדים מן השריר בגלל השפע היחסי שלה. ישנם שלושה אסתטינים אקטין עיקריים ביונקים - אלפא, ביתא וגאמא - דומים להפליא (&gt; 90% רצף מזהיםTy). עם זאת, ישנם הבדלים תפקודיים בין האיזוטופים 12 , 13 . אם אפשר, אקטין G- אקטין המשמש assay מחייב צריך להתאים את איסוטיפ in vivo . לדוגמה, אם בדיקת חלבון לידי ביטוי שריר השלד, אקטין אלפא הוא הבחירה הטובה ביותר; אם בוחנים חלבון לידי ביטוי fibroblasts, בטא אקטין מומלץ. השימוש Phalloidin מאז phalloidin נקשר F- אקטין, זה יכול להפריע או אפילו לחסום את הכריכה של כמה חלבונים F- אקטין מחייב ( למשל, בלוקים phalloidin cofilin מחייב לחוטים actin) 14 . לכן, phalloidin יש להשתמש בזהירות עם התוצאות לעומת דגימות שאינן phalloidin שטופלו כאשר אפשרי. רקע גבוה אין זה נדיר עבור חלבונים משקעים בהעדר F- אקטין ( איור 1 א , לא F- אקטין גלולה מדגםS). עם זאת, רמות גבוהות של שקיעה ברקע יכול להסוות שיתוף פעולה אקטין אמיתי ולהקשות, אם לא בלתי אפשרי, כדי לקבוע אם חלבון נקשר F- אקטין או למדוד את הזיקה של האינטראקציה. הוספת polidicanol למאגר התגובה (שלב 4.1) יכול להפחית באופן משמעותי את הרקע הוא פתרון קל. אם זה לא להפחית את הרקע, התאמת למאגר התגובה, ריכוז מלח, ו / או טמפרטורת הדגירה עשוי לעזור. עקומה מחייב כדי ליצור עקומה מחייב, יש צורך לשנות את הריכוז של החלבון או של עניין או F- אקטין על פני סדרה של תגובות. בפועל, זה קל יותר עדיף לשמור F- אקטין בריכוז קבוע כדי לשנות את הריכוז של חלבון של עניין. שמירה F- אקטין בריכוז קבוע ( למשל, 2 מיקרומטר) ב assay pelleting גבולות שאינם ספציפיים השמנה בריכוזים גבוהים יותר של F- אקטין ומונעדה-פולימריזציה בריכוז נמוך יותר (&lt;0.5 מיקרומטר) של F-actin. דה-פולימריזציה ניתן למנוע באמצעות phalloidin, אם כי זה מציג גורם סיבוך פוטנציאלי לתוך המערכת (ראה שלב 3.3 ומעלה). שמירה על F- אקטין בריכוז קבוע גם מאפשרת להשוות (לנרמל) את F- אקטין גלולה על פני דגימות לזהות ניסויים נכשלו ( כלומר, כאשר גלולה F- אקטין משתנה מאוד, מניעת ניתוח על פני ריכוזים). לבסוף, שמירה F- אקטין בריכוז קבוע מאפשר אחד כדי לקבוע אם מחייב נימה אקטין הוא שיתופי ( איור 1 ג ). כריכה רוויה כמו בכל הניסויים מחייב, זה קריטי כי מחייב F- אקטין רווי וכי ריכוז חלבון פלוס F- אקטין plateaus ( איור 1 ג ). ללא רמה, לא ניתן לחשב קבוע שיווי משקל דיסוציאציה קבוע. לכן, זהחשוב לתכנן בקפידה את סדרת הדילול שייבדקו ותמיד לכלול ריכוזים גבוהים יותר של חלבון ( כלומר, לפחות פי 5 עד פי 10 גבוה מהצפוי). ניתוח מחייב על מנת קבועי דיסוציאציה נמדד להיות חד משמעית, assay צריך להתבצע באמצעות ריכוז F- אקטין המאפשר ריכוז של אתרי קשירה ב- F- אקטין לחלבון של עניין להיות הרבה יותר נמוך מאשר זיקה. כדי לבדוק אם קריטריון זה נענה, להעריך את ריכוז של אתרי קשירה מ מקסימום B. לדוגמה, אם [F- אקטין] היה 2 מיקרומטר ו- B מקסימום = 0.5, ואז [מחייב אתרים] ≈ 1 מיקרומטר. K K צריך להיות לפחות 5 עד פי 10 גדול יותר מאשר [אתרי מחייב]. אם K K הנמדד הוא בסדר גודל זהה לזה של [קשירת אתרים], אזי ייתכן שהעקומה המחוברת הנצפית מייצגת טיטרציה של siTes ולא איסתרם מחייב אמיתי. אם זה נצפה, לחזור על assay באמצעות 10 פי נמוך ריכוז אקטין F כדי למדוד זיקה מדויקת. עבור אינטראקציות זיקה גבוהה, ייצוב phalloidin (שלב 3.3) עשוי להיות נחוץ כדי להשיג ריכוז F- אקטין נמוך מספיק כדי למדוד במדויק זיקה. לבסוף, יש מגבלות היסוד עם assay שיתוף שקיעה כי החוקרים צריכים להיות מודעים בעת ביצוע והערכת assay. והכי חשוב, assay שיתוף שקיעה לא לייצר קבוע שיווי משקל קבוע. המוצרים של מחייב ( כלומר, חלבון פלוס F- אקטין) מופרדים מן המגיבים במהלך צנטריפוגה, ואז המוצרים יכולים ואז לנתק ליצור שיווי משקל חדש. כתוצאה מכך, assay co-sedmentation יכול לחשב או להיכשל לגלות אינטראקציות זיקה נמוכה. מאחר וחלבונים רבים של אקטין מחייב זיקה נמוכה ( כלומר, מיקרומטר) ל- F-actin, תוצאה שלילית ( <eמ &#39;&gt; כלומר, לא מחייב לזיהוי) ב assay לא בהכרח אומר כי חלבון אינו לאגד F- אקטין. כחלופה, TIRF מיקרוסקופיה מבוססי, בודד נימה מחייב מבחני רגישים יותר מדויק יותר לקביעת קבוע דיסוציאציה (עבור ביקורות על טכניקה זו, ראה הפניות 15,16 ). למרות המגבלות הללו, assay גלולה הוא בתוך האמצעים של רוב החוקרים הוא כלי יעיל כדי לקבוע אם חלבון נקשר F- אקטין וכדי למדוד את הזיקה של האינטראקציה.

אקטין הוא חלבון cytoskeletal חיוני אשר ממלא תפקיד קריטי בתהליכים סלולריים מרובים, כולל תנועתיות, התכווצות, הדבקה, מורפולוגיה 1 . אקטין קיים בשתי צורות: אקטין כדורית מונומריקית (G- אקטין) ו actin נימול polymerized (F- אקטין). בתוך התאים, F- אקטין הארגון נשלט על ידי אוסף גדול של חלבונים המווסתים את נוקלאציה, צמיחה, cross-linking, ופירוק של חוטים אקטין 2 , 3 , 4 . עם זאת, כמה מרובות אקטין מחייב תפקוד בתיאום כדי להסדיר ארגון רשת אקטין עדיין לא ברור במידה רבה. מדידת האינטראקציות בין חלבונים לחלבון היא גישה חשובה להבנה כיצד חלבונים מפעילים את השפעתם על ההתנהגות הסלולרית ברמה הביוכימית. מבחני רבים יכולים לשמש כדי לזהות אינטראקציות בין חלבונים מטוהרים.גישות נפוצות עבור חלבונים מסיסים כוללים משיכות, קיטוב פלואורסצנציה, calorimetry טיטרציה איזותרמית, תהודה פלסמון פני השטח. חשוב לציין, כל מבחני אלה דורשים חלבונים להיות מסיסים, ולכן הם קשים להסתגל לשימוש עם חלבון פילמנטי, פילמנטי כגון F- אקטין. כאן, אנו מתארים טכניקה - אקטין שיתוף שקיעה, או גלולה, assay - כדי לקבוע אם חלבון או חלבון תחום נקשר F- אקטין וכדי למדוד את הזיקה של האינטראקציה. אקטין pelleting assay היא טכניקה פשוטה יחסית שאינה דורשת ציוד מיוחד, מלבד ultracentrifuge. כל ריאגנטים יכול להיעשות, בהנחה של ידע ביוכימיה בסיסית, או לרכוש. לאחר מחייב F- אקטין הוקמה, assay ניתן להשתמש כדי למדוד את הזיקה לכאורה ( כלומר, שיווי המשקל דיסוציאציה קבוע) 5 . כמו כן, ברגע זיקה היא הוקמה, assay pelletingהוא כלי שימושי כדי למדוד כיצד שינויים החלבון של עניין ( כלומר , שינויים לאחר translational, מוטציות, או ליגנד מחייב) להשפיע על האינטראקציה שלה עם F-actin 6 . טכניקה יש מגבלות (ראה דיון ) כי החוקר צריך להיות מודע לפני שתנסה assay.

<table><tbody><tr><td>Sorvall MTX 150 מיקרו-אולטרה-צנטריפוגה</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>46960</td><td></td></tr><tr><td>S100-AT3 רוטור</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45585</td><td></td></tr><tr><td>צינורות אולטרה-צנטריפוגה - 0.2 מ"ל</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45233</td><td></td></tr><tr><td>אקטין, שריר שלד ארנב</td><td>שלד ציטוטי</td><td>AKL99</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>סיגמא</td><td>A8531</td><td></td></tr><tr><td>פולידיקנול (Thesit)&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>88315</td><td></td></tr><tr><td>פלואידין</td><td>תרמו-פישר סיינטיפיק</td><td>P3457</td><td></td></tr><tr><td>דיתיותרייטול (DTT)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0862</td><td></td></tr><tr><td>אדנוזין טריפוספט (ATP)</td><td>סיגמא</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>אימידזול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>O3196</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד (MgCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>אתילן גליקול-ביס(&בטא;-אתר אמינואתיל)-N,N,N',N'-חומצה טטראצטית (EGTA)</td><td>Sigma</td><td>3779</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey CLx Imaging System</td><td>LI-COR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant כחול R-250 צבע</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>ערכת צביעה כחולה קולואידית</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC6025</td><td></td></tr></tbody></table>

מדידת חלבון מחייב f- אקטין על ידי שיתוף שקיעה

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

אקטין אקטין (F- אקטין) ארגון בתוך תאים מוסדר על ידי מספר רב של חלבונים אקטין מחייב השולטים אקטין נוקלאציה, צמיחה, חוצה קישור ו / או פירוק. פרוטוקול זה מתאר טכניקה - אקטין שיתוף שקיעה, או גלולה, assay - כדי לקבוע אם חלבונים או חלבון תחום נקשר F- אקטין וכדי למדוד את הזיקה של האינטראקציה ( כלומר, שיווי המשקל דיסוציאציה קבוע). בטכניקה זו, חלבון של עניין מודגרת הראשונה עם F- אקטין בפתרון. ואז, צנטריפוגה דיפרנציאלי משמש משקעים את החוטים אקטין, ואת החומר גלולה מנותח על ידי SDS-PAGE. אם חלבון של עניין נקשר F- אקטין, זה יהיה שיתוף משקעים עם חוטים אקטין. את המוצרים של התגובה מחייב ( כלומר, F- אקטין וחלבון של עניין) ניתן לכמת כדי לקבוע את הזיקה של האינטראקציה. אקטין pelleting assay היא טכניקה פשוטה לקביעתאם חלבון של עניין נקשר F-actin ולהעריך כיצד שינויים חלבון זה, כגון קשירת ליגנד, להשפיע על האינטראקציה שלה עם F- אקטין.

בדקנו αE-catenin homodimer מחייב F- אקטין assay שיתוף שקיעה. מאז ניסויים בעבר הראו כי זיקה של הומודימר αE-catenin עבור F- אקטין הוא סביב 1 מיקרומטר ו מקסימום B ליד 1 11 , ביצענו את assay עם ריכוז נמוך של אקטין F (0.2 מיקרומטר ולא 2 מיקרומטר, ראה הדיון). מאז 0.2 מיקרומטר הוא מתחת לריכוז קריטי, phalloidin נוספה לייצב את F- אקטין פולימר מ שריר השלד שריר G- אקטין (שלב 3.3). ריכוזים הולכים וגדלים של הומודימר αE-catenin (0.125-12.0 מיקרומטר) הודגמו בנוכחות או היעדר של 0.2 מיקרומטר F- אקטין. הדגימות היו centrifuged, וכתוצאה מכך pellets נותחו ( איור 1 א ). כצפוי, הומודימר αE-catenin שיתוף sedimented עם רקע F- אקטין מעל ( איור 1 א &#39; , להשוות את F- אקטין גלולות דגימות לא- F- ACדגימות פח). BSA היה לרוץ כמו שליטה שלילית ( איור 1 ב ). חלבון Bound היה לכמת זממו על חלבון חינם כדי לחשב את הזיקה של האינטראקציה ( איור 1C ). הנתונים המתויגים מתאימים ביותר למשוואת היל. K מחושב D היה 2.9 מיקרומטר, מקסימום B היה 0.2, ואת מקדם היל (ח) היה 4.8. לפיכך, הומודימר αE-catenin נקשר F- אקטין במשותף עם זיקה מיקרומטר נמוכה, עולה בקנה אחד עם עבודה קודמת (K ד של 2.9 מיקרומטר לעומת ~ 1.0 מיקרומטר) 11 . <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig1.jpg" /> איור 1: מהירות גבוהה F- אקטין co- שקיעה assay. ( א ) הגדלת ריכוזי (0.125-12.0 מיקרומטר) של הומודימר αE-catenin הודגרו עם (פאנלים שמאל) או ללא (מימין לוחות) 0.2 מיקרומטר F- אקטין התייצב עם phalloidiנ. הם הודגרו במשך 30 דקות ב RT ו centrifuged. סך הכל (7.5% מהחומר המוצא) וחומר pelleted (50% של חומר pelleted) הופרדו על ידי SDS-PAGE ומוכתמים עם צבע קומאסי. ( ב ) 4 מיקרומטר BSA היה להפעיל כמו שליטה שלילית. סך הכל גלולה דגימות, עם (+) או בלי (-) F- אקטין, הופרדו על ידי SDS-PAGE ומוכתמים עם צבע קומאסי. ( C ) Bound αE-catenin (μM / מיקרומטר actin) מ- A היה זממו נגד חינם αE-catenin (מיקרומטר), ואת הנתונים מתאימים למשוואת היל (קו אדום). K K, B מקסימום ומקדם היל (h) מפורטים. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig2.jpg" /> איור 2: אקטין pelleting כימות </sתרשים זרימה. סכמטי זה מתאר את שלבי המפתח בסעיף 5, עם דוגמאות של דגימות סך ו גלולה ( A , CE ) ואת עקומת תקן ( ב ) המשמש לכימות. 5.13 צעדים: 1 ) למדוד את כמות החלבון של עניין במדגם הכולל (A). 2 ) ליצור עקומה סטנדרטית על ידי זומם את עוצמת הלהקה לעומת מסת חלבון (B). 3 ) למדוד את כמות החלבון עניין כי שיתוף sedimented עם F- אקטין ( ג ). 4 ) למדוד את כמות החלבון של עניין כי pelleted בהעדר F-actin ( D ). 5 ) לחסר D מ C כדי לקבוע את כמות החלבון קשור F- אקטין. 6 ) למדוד את כמות F- אקטין בכל גלולה (E), לחשב את הכמות הממוצעת של F- אקטין לכל מדגם, ולחלק כל מדגם על ידי הממוצע (המספרים שלהלן מראים את היחס). 7 )עבור כל דגימה, לחלק את כמות החלבון מחויב (מחושב בשלב 5) על ידי היחס גלולה F- אקטין (מחושב בשלב 6) כדי להתאים את ההבדלים גלולה. 8 ) השתמש עקומת סטנדרטי ( ב ) כדי לחשב את כמות (מסה) של חלבון מחויב מנורמל בכל מדגם (שלב 7). 9 ) לקבוע את הריכוז של חלבון חופשי וחלבון מחויב ליצור עקומה מחייב. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבחון את היכולת של חלבון לשיתוף משקעים עם אקטין filamentous (F- אקטין), ואם מחייב הוא ציין, כדי למדוד את הזיקה של האינטראקציה.

מדידת חלבון מחייב F- אקטין על ידי שיתוף שקיעה

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

המטרה הכללית של טכניקה זו היא לבחון את יכולתו של חלבון לשקוע יחד עם אקטין פילמנטרי (filamentous actin), ובמידה ונצפה קישור, למדוד את זיקת האינטראקציה. שיטה זו היא טכניקה פשוטה לקביעה אם חלבון נקשר ל-F-actin. היתרונות של טכניקה זו הם שאינה דורשת ציוד מיוחד מעבר לאולטרסנטריפוגה, וניתן להכין או לרכוש את כל הרכיבים.ראשית, הכין חלבון בדרגת טוהר גבוהה כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. קבע את ריכוז החלבון על ידי מדידת הבליעה באורך גל של 280 ננומטרים. רגע לפני השימוש, בצע סבב צנטריפוגה מהיר (hard spin) לחלבון כדי להסיר אגרגטים של חלבון בלתי ממיס.אם המסיסות מהווה בעיה, יש למדוד שוב את ריכוז החלבון לאחר סרכוז. לאחר מכן, הוצאו מנת אלקיקוט של globular actin או g-actin מהמקפיא בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס והפשירו אותו במהירות. הוסיפו בופר פולימריזציה 10X ל-G-actin ודללו למשך ריכוז סופי של 1X באמצעות מים.דגרו את התערובת במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לאקטין להתפולימר. לאחר הפולימריזציה, אחסנו את האקטין הפילמנטרי המפולִימר, או F-actin, בתמיסה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, שם הוא יישאר יציב למשך מספר שבועות. לפני השימוש ב-F-actin לאחר אחסון, הפכו בעדינות או נערו קלות את המבחנה מספר פעמים כדי להבטיח שכל האקטין מומס ומפוזר באופן אחיד בתמיסה.בסס את קישור החלבון הנבדק ל-F-actin כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר שבוסס קישור ה-F-actin, בצע דילול סדרתי של החלבון כדי ליצור סדרת ריכוזים הכוללת שבעה עד שמונה דגימות, בריכוז הכפיל מהריכוז הסופי שייבדק. לדוגמה, אם טווח הבדיקה הוא 0.1 עד שמונה micromolar, הכן דילוציות של 16, שמונה, ארבעה, שניים, אחד, 0.5 ו-0.2 micromolar של החלבון בתוך 1X reaction buffer במבחנות מיקרוצנטריפוגה.דללו את החלבון המבוקש לריכוז הסופי בבופר תגובה 1X בתוך מבחנות אולטרה-צנטריפוגה. הוסיפו F-actin לדגימות המתאימות. לאחר מכן, דגרו את כל הדגימות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר 30 דקות, הוציאו חמישית מכל דגימה וערבבו עם בופר לדגימות. אלו הן דגימות ה-total. העמיסו את מבחנות הדגימה של האולטרה-צנטריפוגה אל תוך הרוטור וסובבו למשך 20 דקות ב-100,000 $\times$g ובטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.לאחר סנטריפוגציה, הסירו שלושה רבעים מהנוזל העליון (supernatant) מכל מבחנה וערבבו עם 4X sample buffer במבחנת מיקרופוג נפרדת. אלו הם דגימות הנוזל העליון. הסירו את שארית הנוזל העליון באמצעות קצה טעינה לג'ל (gel loading tip), תוך הקפדה לא להפריע למשקע (pellet).לאחר מכן, הוסיפו תחבירי דגימה (sample buffer) בריכוז 1X לכל המבחנות והדאירו למשך חמש דקות לפחות בטמפרטורת החדר. לאחר ההדגרה, בצעו טריטורציה (trituration) של הדגימה שמונה עד עשרה פעמים באמצעות טיפ של פפית p200, תוך שטיפה מתמדת של אזור המשקע במבחנה. במהלך הטריטורציה, גרדו בעדינות את טיפ הפפית מעל המשקע כדי לסייע בריסספנסיון (re-suspension).העבירו את החלבון שהושעה מחדש לנבובת מיקרופוג'. אלו הן דגימות המשקע. לבסוף, נתחו את דגימות הסך הכל ואת דגימות המשקע באמצעות SDS page.דמיינו את הג'לים שצבעו ב-coomassie באמצעות מערכת דימות המודדת את עוצמת פסי החלבון בטווח רחב וליניארי. ריכוזים עולים של alpha e catenin homodimer הודגרו בנוכחות או בהיעדר 0.2 µM של F-actin. הדגימות סובבו בצנטריפוגה והמשקעים שהתקבלו נותחו.כצפוי, ההומודימר של alpha e catenin שקע יחד עם F-actin מעל לרמה הבסיסית. BSA שימש כביקורת שלילית. החלבון הקשור נמדד כמותית וסורטם ביחס לחלבון החופשי כדי לחשב את זיקת האינטראקציה.ניתן לבצע טכניקה זו בארבע שעות או פחות אם F-actin כבר פולימריז. בעת ביצוע פרוצדורה זו, קריטי להסיר את העליון במהירות לאחר הצנטריפוגציה ולסבסב את המשקע לחלוטין. כבכל ניסויי קישור, קריטי שהקישור ל-F-actin יהיה רווי ושהניקיון בתוספת F-actin יגיע למישור (plateau); ללא הגעה למישור, לא ניתן לחשב קבוע שיווי משקל של התאגשות מדויק.קיימות מגבלות יסודיות לבדיקת השקיעה המשותפת (co-sedimentation assay) שחוקרים צריכים להיות מודעים להן; החשובה ביותר היא שהיא אינה מניבה קבוע שיווי משקל אמיתי, וכתוצאה מכך עלולה לחשב באופן שגוי או להיכשל בזיהוי של אינטראקציות בעלות זיקה נמוכה. למרות מגבלות אלו, בדיקת השקיעה המשותפת היא כלי נגיש ואפקטיבי כדי לקבוע אם חלבון נקשר ל-F-actin ולהמדוד את הזיקה של האינטראקציה.

measuring-protein-binding-to-f-actin-by-co-sedimentation

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

חלבונים הנקשרים אקטין פילמנטיות (F-אקטין) באמצעות מודולים שונים אקטין מחייב. בסרטון הזה אנחנו מדגימים את ההליך של אקטין שיתוף שקיעה, אשר מהווה ב assay חוץ גופית בשימוש שגרתי לנתח חלבונים או תחומים ספציפיים הנקשרים F-אקטין.

אקטין Co-Assay שקיעה, כי ניתוח של חלבון מחייב את ה-F-אקטין

אנו מיישמים ללא תווית חלבון אינטראקציה באמצעות ניתוח X100 Biacore לניתוח המבנה והתפקוד של הכריכה של מוטציות ב 'מספר cystatin כדי papain דרך אפיון קינטי. כיול ללא ניתוח ריכוז (CFCA) מודד את הריכוז של חלבון עם פעילות מחייב שמר ללא צורך עקומת סטנדרט. אנו מראים כי אישור של ריכוזי באמצעות CFCA מגבירה את האמינות של הניתוח הקינטית כי קבועים הקינטית יכול להיקבע בצורה אמינה, גם אם את פעילותו של חלבון רקומביננטי מצטמצם.

חשיבותה של ריכוז חלבון נכון עבור קינטיקס וקביעת זיקה בניתוח מבנה פונקציה

בסרטון זה, אנו מתארים את טכניקת האנאיזוטרופיה הפלואורסצנטית כדי לחקור את יחסי הגומלין בין חלבון תסמונת שוואכמן-יהלום (SBDS) המתויג פלואורופור לבין גורם התארכות דמוי 1 GTPase (EFL1). על דגירה של חלבוני SBDS עם ריכוזים הולכים וגדלים של EFL1, נצפתה עלייה מתמדת באנאיזוטרופיה, מה שמצביע על אינטראקציה מוצלחת בין שני החלבונים.

זיהוי מבוסס אנאיזוטרופיה פלואורסצנטית של אינטראקציות חלבון-חלבון

פילמור של FtsZ חיוני לחלוקת תאי חיידקים. בדוח זה, אנו מפרטים פרוטוקולים פשוטים לניטור פעילות פילמור FtsZ ודנים בהשפעת הרכב המאגר. ניתן להשתמש בפרוטוקולים כדי לחקור את האינטראקציה של FtsZ עם חלבונים רגולטוריים או תרופות אנטיבקטריאליות המשפיעות על פילמור FtsZ.

FtsZ פלמור מבחני: פרוטוקולים ושיקולים פשוטים

פרוטוקול זה משווה את הזיקות היחסיות של שותפים מחייבים ל-GTPases ממשפחת Rho, כולל Rac1. in vivo, חלבונים קושרים Rac1 מתחרים על ממשק מחייב יחיד, שהקונפורמציה שלו מוכתבת על ידי נוקלאוטיד קשור. הנוקלאוטיד חשוב וקשה לשליטה בניסוי, בשל קצב ההידרוליזה הגבוה.

השוואת הזיקה של חלבונים מחייב GTPase באמצעות מבחני תחרות

אינטראקציות חלבון הן בלב של התפקוד של תא. טכניקות קלוריות ספקטרוסקופיות משמשות בדרך כלל כדי לאפיין אותם. כאן אנו מתארים אנאיזוטרופיה הקרינה ככלי לחקור את האינטראקציה בין החלבון מוטציה של תסמונת שווקמן-יהלום (SBDS) לבין הגורם דמוי התארכות 1 GTPase (EFL1).

Anisotropy קרינה ככלי לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון

אנו מציגים שיטה המשלבת טיהור חלבון ממברנה והחוקה לתוך peptidiscs בצעד כרומטוגרפי יחיד. מקפלים ביולוגיים משמשים להחזקה ישירה של פני השטח ולמדידה של מדידת חלבונים ואינטראקציות באמצעות האינטרפרומטריה.

PeptiQuick, שילוב של צעד אחד של חלבונים ממברנות לתוך ביוטילדיסקי Peptiquick עבור כריכת חלבון מפושטת

פרוטוקול זה מתאר את היווצרותם של דו-שכבתיות שומנים נתמכות ואת התוספת של חוטים ציטוסקטליים וחלבונים מוטוריים כדי לחקור את הדינמיקה של רשתות ציטוסקטליות משוחזרות, הקשורות לממברנה, באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

שחזור של קליפות אקטין מינימליות הקשורות לממברנה על דו-שכבתיות שומנים נתמכות

פרוטוקול זה מתאר כיצד לייצר כוכבי שביט אקטין על פני השטח של חרוזים תוך שימוש ברכיבי חלבון זמינים מסחרית. מערכות כאלה מחקות את המבנים הבולטים הנמצאים בתאים, וניתן להשתמש בהן כדי לבחון מנגנונים פיזיולוגיים של ייצור כוח בצורה פשוטה.

שחזור של תנועתיות מבוססת אקטין עם חלבונים זמינים מסחרית

שיטה זו מתארת בדיקת שיקוע חוץ גופית מבוססת לקטין כדי לכמת את זיקת הקישור של פוספטאז גלוקן ועמילופקטין. בדיקת שקיעה משותפת זו אמינה למדידת קשירת מצע גלוקן פוספטאז וניתן ליישם אותה על מצעים גלוקניים מסיסים שונים.

Concanavalin A מבוסס Sedimentation Assay למדידת קשירת המצע של פוספטאז גלוקני

חלבונים רבים בעלי הפרעה פנימית הוכחו כמשתתפים בהיווצרות של עיבוי ביומולקולרי דינמי מאוד, התנהגות חשובה לתהליכים תאיים רבים. במאמר זה אנו מציגים שיטה מבוססת הדמיה של מולקולה בודדת לכימות הדינמיקה שבאמצעותה חלבונים מתקשרים זה עם זה בעיבויים ביומולקולריים בתאים חיים.

מדידה של מולקולה בודדת של דינמיקת אינטראקציה של חלבונים בתוך עיבויים ביומולקולריים

למד מדידת אינטראקציות חלבון-F-actin באמצעות שיתוף שקיעה. שיטה זו מאפשרת לכמת את חוזק הקישור בין חלבונים לסיבי אקטין תוך שימוש באולטרה-צנטריפוגה בלבד.

מדידת חלבון מחייב F- אקטין על ידי שיתוף שקיעה

גלה סרטונים נוספים