An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood

Ke Yang; Jiandong Wu; Ling Zhu; Yong Liu; Michael Zhang; Francis Lin

doi:10.3791/55615

שיטה All-on- שבב עבור ניתוח נויטרופילי מהיר Chemotaxis ישירות מתוך ירידה של דם

JoVE Journal
Immunology and Infection

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Immunology and Infection

An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood

שיטה All-on- שבב עבור ניתוח נויטרופילי מהיר Chemotaxis ישירות מתוך ירידה של דם

Full Text

17,506 Views

07:21 min

June 23, 2017

DOI: 10.3791/55615-v

Ke Yang*^1,2,3, Jiandong Wu*^3,4, Ling Zhu¹, Yong Liu¹, Michael Zhang⁵, Francis Lin^3,4,6,7

¹Institute of Applied Technology, Hefei Institutes of Physical Science,Chinese Academy of Sciences, ²University of Science and Technology of China, ³Department of Physics and Astronomy,University of Manitoba, ⁴Department of Biosystems Engineering,University of Manitoba, ⁵Seven Oaks General Hospital, ⁶Department of Immunology,University of Manitoba, ⁷Department of Biological Sciences,University of Manitoba

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

מאמר זה מספק את השיטה המפורטת של ביצוע assay chemotaxis נויטרופילי מהיר על ידי שילוב של בידוד שבב נויטרופילי מן הדם כולו ואת הבדיקה chemotaxis על שבב microfluidic יחיד.

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים שיטה להפרדת נויטרופילים מטיפת דם מלא ולאחר מכן לבצע בדיקת כימוטקסיס לאחר מכן באמצעות מכשיר מיקרופלואידית יחיד. שיטה זו מספקת את הקוד שלנו לביצוע בדיקת כימוטקסיס נויטרופילים באמצעות נפח קטן של דם מלא. וניתן ליישם בקלות על ידי חוקרים כדי לענות על שאלות ביולוגיות הקשורות לנדידת תאים חיסוניים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שילוב ובדיקת הכימוטקסיס שלנו במכשיר מיקרופלואידית יחיד. זה מאפשר הרכבה וניתוח תוך 25 דקות. כדי להתחיל, הכן את המאסטר מאלדוס המתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה.

לאחר מכן סילן את פני השטח של תבנית SU8 כדי להקל על שחרור PDMS מהתבנית. לאחר מכן, מערבבים 40 גרם בסיס PDMS וארבעה גרם של חומר הנשיאה בכוס פלסטיק. מניחים את תבנית המאסטר SU8 המוכנה בצלחת פטרי ויוצקים בזהירות את תמיסת ה-PDMS המעורבת על התבנית.

מניחים את צלחת הפטרי במייבש ומורחים ואקום כדי לנקות את תמיסת ה-PDMS למשך 20 דקות. לאחר מכן, הכניסו את צלחת הפטרי לתנור ורפא את ה-PDMS בחום של 80 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר האפייה חותכים בזהירות ומקלפים את לוח ה- PDMS מתבנית SU8.

חותכים את לוח ה-PDMS כדי להפריד אותו למכשירים בודדים. חתוך את התקן ה-PDMS כדי ליצור שני קירות סביב יציאת טעינת התאים להחזקת המגנטים. לאחר מכן, נקב את יציאת טעינת התאים באמצעות אגרוף בקוטר שלושה מילימטרים.

לאחר מכן, עבור לאגרוף של שישה מילימטר והסר את מאגרי הכניסה הכימית ביציאת הפסולת. בעזרת פיסת סרט דבק, הסר את האבק על פני לוח ה- PDMS. הנח את הלוח הנקי בשקופית זכוכית נקייה לתוך מכונת הפלזמה.

מרחו את הוואקום למשך שלוש דקות. ואז הפעל את כוח הפלזמה והגדר את הרמה לגבוהה. כוונן בעדינות את שסתום האוויר והפלזמה לטפל ב-PDMS ובמגלשת הזכוכית למשך שלוש דקות.

בסיום, כבה את כוח הפלזמה ושחרר את הוואקום. הוצא בזהירות את לוח ה-PDMS במגלשת הזכוכית באמצעות פינצטה, הנח מיד את לוח ה-PDMS על גבי מגלשת הזכוכית, כאשר מבני התעלה פונים כלפי מטה לחץ בעדינות על לוח ה-PDMS כדי להצמיד אותו לזכוכית ולאחר מכן מלא מיד את התעלה המיקרופלואידית במים נטולי יונים. ה-PDMS נלחצו בדרך כלל על מצע הזכוכית כדי להימנע בבאר בתעלת המחסום.

הסר את המים נטולי היונים מהמכשיר והוסף 100 מיקרוליטר תמיסת פריברונקטין מהשקע. המתן שלוש דקות כדי לוודא שכל התעלות מלאות בתמיסת פיברונקטין לאחר מכן, דגרו את המכשיר בצלחת פטרי מכוסה למשך שעה בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הסר את תמיסת הפיברונקטין מהמכשיר והוסף 100 מיקרוליטר של מדיום הגירה מהשקע. שוב, המתן שלוש דקות כדי להבטיח שכל הערוצים יתמלאו במדיום הנדידה. דגרו את המכשיר למשך שעה נוספת בטמפרטורת החדר לפני השימוש במכשיר בניסוי הכימוטקסיס.

הכניסו עשרה מיקרוליטרים של דם מלא לתוך שפופרת של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף שני מיקרוליטר מקוקטייל הנוגדנים. ושני מיקרוליטרים של חלקיקים מגנטיים מערכת בידוד נויטרופילים ומערבבים בעדינות את הצינור על מנת לתייג מגנטית את התאים המתויגים בנוגדנים.

דגרו על תערובת התווית למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, חבר שני דיסקים מגנטיים קטנים לשני הצדדים של יציאת טעינת התאים של המכשיר. שאפו את המדיום מכל יציאות המכשיר.

לאחר מכן, פיפטה לאט שני מיקרוליטרים מתערובת הדם המסומנת לתוך המכשיר המיקרופלואידי מיציאת טעינת התאים. הנח את המכשיר המיקרופלואידי על שלב המיקרוסקופ מבוקר הטמפרטורה ב-37 מעלות צלזיוס. המתן מספר דקות עד שמספיק נויטרופילים נלכדים באזור העגינה של התא.

לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת המשיכה הכימית ומדיום נדידה של 100 מיקרוליטר למאגרי הכניסה המיועדים להם באמצעות שני פיפטורים. זה ייצור שיפוע כימו-מושך על ידי ערבוב כימי מבוסס זרימה למינרית רציפה. הכימותרפיה יכולה להיות חלבונים רקומביננטיים כגון FMLP או דגימה קלינית כגון סופרנטנט של ליחה מחולים עם COPD.

לאחר שהזרימה התייצבה, רכוש תמונות פלואורסצנטיות של שיפוע דקסטרון FitZ בערוץ. לאחר מכן, דגרו את המכשיר בשלב המיקרוסקופ מבוקר הטמפרטורה, או בחממת תרבית תאים קונבנציונלית למשך 15 דקות. לאחר הדגירה, דמיין את ערוץ השיפוע באמצעות יעד פי עשרה כדי לתעד את המיקומים הסופיים של התא לניתוח נתונים.

נויטרופילים נבחרים באופן שלילי מטיפה של דם מלא ישירות במכשיר המיקרופלואידי, באמצעות תיוג נוגדנים לחלקיקים מגנטיים וזוג מגנטים. על מנת לאשר את טוהר הנויטרופילים המבודדים על השבב, בוצעה צביעת גימסה. התוצאות מראות את הגרעינים האופייניים בצורת טבעת ואונה של נויטרופילים.

לאחר טעינת התאים, מבנה העגינה מיישר ביעילות את התאים ליד תעלת השיפוע לפני החלת שיפוע כימי. כאשר נחשפים לשיפוע כימי למשך 15 דקות, מתרחשת כימוטקסיס. וניתן למדוד באמצעות הדמיה.

תוצאות אלה מראות כי לאחר 15 דקות, תאים מעטים זחלו דרך תעלת המחסום בדגימה המבוקרת הבינונית. לעומת זאת, נויטרופילים רבים נעו במהירות דרך תעלת המחסום ונדדו לעבר שיפוע FMLP של 100 ננו-מולרי. ברגע שזה יכול לשלוח כימוטקסיס ישירות מאיתנו בתוך 25 דקות.

זה מציע כלי שימושי לחוקרים לחקור את המכניקה של נדידת תאים שלמים. וכלי ליישומים קליניים.

View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos