Name: שיטה All-on- שבב עבור ניתוח נויטרופילי מהיר Chemotaxis ישירות מתוך ירידה של דם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: למדו שיטה מהירה לבידוד נויטרופילים מדם שלם וביצוע ניסוי Chemotaxis במכשיר מיקרו-נוזלי יחיד. השיטה מאפשרת ניתוח תוך 25 דקות ומפשטת מחקר על נדידת תאי חיסון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת בחלקו על ידי מענקים של מדעי הטבע והנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC) ואת המכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR). אנו מודים למכון הקליני למחקר יישומי וחינוך בבית החולים הכללי &quot;ויקטוריה&quot; בוויניפג ובבית החולים הכללי &quot;סבן אוקס&quot; בוויניפג על ניהול דגימות קליניות של בני אדם. אנו מודים לד&quot;ר חגית פרץ-סורוקה על דיון מועיל באסטרטגיות הפעולה של אסאי. <style type="text/css">
</style> אנו מודים לפרופסור קרולין רן וד&quot;ר קסיאומינג (קודי) צ&#39;ן מאוניברסיטת ווטרלו על תמיכתם הנדיבה בתהליך הצילומים.

<ol><li>Kolaczkowska, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+recruitment+and+function+in+health+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil recruitment and function in health and inflammation.</a> Nat Rev Immunol. 13 (13), 159-175 (2013).</li>
<li>Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+migration+in+inflammation%3A+present+and+future+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets.</a> Nat Immunol. 6 (12), 1182-1190 (2005).</li>
<li>Griffith, J. W., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cells+in+motion%3A+migrating+toward+improved+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies.</a> Eur. J. Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).</li>
<li>Laird, D. J., von Andrian, U. H., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+trafficking+in+tissue+development%2C+growth%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stem cell trafficking in tissue development, growth, and disease.</a> Cell. 132 (4), 612-630 (2008).</li>
<li>Condeelis, J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+cell+movement+in+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of cell movement in tumours.</a> Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).</li>
<li>Kruger, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%3A+between+host+defence%2C+immune+modulation%2C+and+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Neutrophils: between host defence, immune modulation, and tissue injury.</a> PLoS Pathog. 11 (3), e1004651(2015).</li>
<li>Mócsai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+novel+functions+of+neutrophils+in+immunity%2C+inflammation%2C+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond.</a> J Exp Med. 210 (7), 1283-1299 (2013).</li>
<li>Foxman, E. F., Campbell, J. J., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistep+navigation+and+the+combinatorial+control+of+leukocyte+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multistep navigation and the combinatorial control of leukocyte chemotaxis.</a> J Cell Biol. 139 (7), 1349-1360 (1997).</li>
<li>Tazzyman, S., Niaz, H., Murdoch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-mediated+tumour+angiogenesis%3A+subversion+of+immune+responses+to+promote+tumour+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-mediated tumour angiogenesis: subversion of immune responses to promote tumour growth.</a> Semin Cancer Biol. 23 (3), 149-158 (2013).</li>
<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J Exp Med. 115 (3), 453-466 (1962).</li>
<li>Wu, J., Wu, X., Lin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+microfluidics-based+chemotaxis+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Recent developments in microfluidics-based chemotaxis studies.</a> Lab Chip. 13 (13), 2484-2499 (2013).</li>
<li>Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+present+and+future+role+of+microfluidics+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The present and future role of microfluidics in biomedical research.</a> Nature. 507 (7491), 181-189 (2014).</li>
<li>Kim, S., Kim, H. J., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+applications+of+microfluidic+gradient+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Biological applications of microfluidic gradient devices.</a> Integr Biol. 2 (11-12), 584-603 (2010).</li>
<li>Irimia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+system+for+measuring+neutrophil+migratory+responses+to+fast+switches+of+chemical+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic system for measuring neutrophil migratory responses to fast switches of chemical gradients.</a> Lab Chip. 6 (2), 191-198 (2006).</li>
<li>Lin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+migration+in+opposing+chemoattractant+gradients+using+microfluidic+chemotaxis+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Neutrophil migration in opposing chemoattractant gradients using microfluidic chemotaxis devices.</a> Ann Biomed Eng. 33 (4), 475-482 (2005).</li>
<li>Ambravaneswaran, V., Wong, I. Y., Aranyosi, A. J., Toner, M., Irimia, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+decisions+during+neutrophil+chemotaxis+inside+bifurcating+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Directional decisions during neutrophil chemotaxis inside bifurcating channels.</a> Integr Biol. 2 (11-12), 639-647 (2010).</li>
<li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+neutrophil+migration+patterns+during+sepsis+after+major+burns%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Spontaneous neutrophil migration patterns during sepsis after major burns.</a> PloS One. 9 (12), e114509(2014).</li>
<li>Butler, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burn+injury+reduces+neutrophil+directional+migration+speed+in+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices.</a> PloS One. 5 (7), e11921(2010).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+platform+for+evaluating+neutrophil+chemotaxis+induced+by+sputum+from+COPD+patients%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A microfluidic platform for evaluating neutrophil chemotaxis induced by sputum from COPD patients.</a> PloS One. 10 (5), e0126523(2015).</li>
<li>Sackmann, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+kit-on-a-lid%3A+a+versatile+platform+for+neutrophil+chemotaxis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays.</a> Blood. 120 (14), e45-e53 (2012).</li>
<li>Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+migration+assay+from+a+drop+of+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Neutrophil migration assay from a drop of blood.</a> Lab Chip. 8 (12), 2054-2061 (2008).</li>
<li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24962731">Microfluidic platform for measuring neutrophil chemotaxis from unprocessed human whole blood.</a> J Vis Exp. (88), (2014).</li>
<li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+assay+for+precise+measurements+of+mouse%2C+rat%2C+and+human+neutrophil+chemotaxis+in+whole-blood+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukocyte+Biol%22%5BJournal%5D)">Microfluidic assay for precise measurements of mouse, rat, and human neutrophil chemotaxis in whole-blood droplets.</a> J Leukocyte Biol. 100 (1), 241-247 (2016).</li>
<li>Sackmann, E. K. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+asthma+from+a+drop+of+blood+using+neutrophil+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterizing asthma from a drop of blood using neutrophil chemotaxis.</a> P Natl Acad Sci. 111 (16), 5813-5818 (2014).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.worldscientific.com/doi/abs/10.1142/S2339547816500035">An all-on-chip method for testing neutrophil chemotaxis induced by fMLP and COPD patient's sputum.</a> Technology. 04 (02), 104-109 (2016).</li>
</ol>

אין ניגוד אינטרסים לחשוף.

במאמר זה, פרוטוקול מפורט לבודד ישירות נויטרופילים מן הדם כולו ואחריו הבדיקה chemotaxis, על כל שבב microfluidic, תוארה. שיטה זו מציעה תכונות שימושיות בתפעול קל שלה, בחירה שלילית של נויטרופילים טוהר גבוהה, מדגם מהיר ל-תוצאה הבדיקה chemotaxis, ריאגנטים מופחת וצריכה מדגם, מדויק ניתוח נתוני הגירה תא. כאומדן גס, לפחות 25% של נויטרופילים מן הדגימה כל הדם נכנס ביעילות את מבנה עגינה במכשיר מצאנו שטוהר נויטרופילי גבוה על ידי מכתים Giemsa על שבב. <p class="jove_content" style=";text-alig...

Chemotaxis, תהליך של הגירה תא מכוון לשיכוך מסיס ריכוז כימי, הוא מעורב באופן קריטי בתהליכים ביולוגיים רבים כולל תגובה חיסונית 1 , 2 , 3 , פיתוח רקמות 4 וגרורות סרטן 5 . נויטרופילים הם תת-הדם השופע ביותר בתאי הדם הלבנים וממלאים תפקידים מכריעים בהפיכת פונקציות ההגנה המארחת של הגוף, כמו גם בתיווך של תגובות חיסוניות אדפטטיביות 6 , 7 . נויטרופילים מצוידים במנגנון chemotactic מוסדר מאוד המאפשר לתאי החיסון המווסתים להגיב לתאי chemoattractants שמקורם בפאתוגן ( למשל fMLP) ומנגנוני chemoattractants ( לדוגמה אינטרלוקין 8). הגירה נויטרופילי chemotaxis לתווך בעיות פיזיולוגיות שונותומחלות כגון דלקת וסרטן 1 , 9 . לפיכך, הערכה מדויקת של chemotaxis נויטרופילי מספק readout תפקודית חשובה לחקר הביולוגיה נויטרופילי מחלות הקשורות. לעומת מבחני chemotaxis קונבנציונאלי בשימוש נרחב ( למשל assay transwell 10 ), התקנים microfluidic להראות הבטחה גדולה להערכה כמותית של נדידת תאים chemotaxis בשל הדור מדוייק כימית מדויק הדור מזעור 11 , 12 , 13 . במהלך שני העשורים האחרונים או כך, מכשירים microfluidic שונים פותחו כדי לחקור את chemotaxis של סוגי תאים ביולוגיים שונים, במיוחד נויטרופילים 11 . מאמץ משמעותי הוקדש לאפיון הגירה נויטרופילים ב-ספטיוטומפוראלי<html> מדרגיות mical שהוגדרו התקנים microfluidic 14 , 15 . אסטרטגיות מעניינות פותחו גם כדי ללמוד החלטות כיוונית על ידי נויטרופילים באמצעות מכשירים microfluidic 16. מלבד מחקר ביולוגי, היישומים של התקנים microfluidic הורחבו לבחון דגימות קליניות להערכת המחלה 17 , 18 , 19 . עם זאת, השימוש במכשירים microfluidic רבים מוגבל מעבדות מחקר מיוחד דורש בידוד נויטרופילי ארוך מנפח גדול של דגימות דם. לכן, חלה מגמה הולכת וגדלה של פיתוח מכשירים משולבים microfluidic עבור ניתוח chemotaxis נויטרופילי מהיר ישירות טיפה של דם שלם 20 , 21 , 22 ,Ef &quot;&gt; 23 , 24 . לכיוון זה, שיטת All-on-chip פותחה המשלבת את הטיהור נויטרופילי המגנטי שלילי ואת assay chemotaxis הבאים על מכשיר microfluidic יחיד 25 . שיטה זו על כל שבב יש את התכונות הרומן הבא: 1) בניגוד אסטרטגיות שבב הקודם לבודד נויטרופילים מן הדם על ידי הידבקות תא מבוסס הדבקה או גודל התא מבוסס סינון 20 , 22 , שיטה חדשה זו מאפשרת גבוהה טוהר, על שבב הפרדה מגנטית של נויטרופילים מ כרכים קטנים של דם שלם, כמו גם מדידה chemotaxis על גירוי chemoattractant; 2) מבנה עגינה התא מסייע ליישר את העמדות הראשוניות של נויטרופילים קרוב לתעלה כיוונית כימיים ומאפשר ניתוח chemotaxis פשוטה ללא מעקב תא יחיד; 3) שילוב של בידוד נויטרופילי וכימותAssay ציר על מכשיר microfluidic יחיד מאפשר מהיר מדגם ניתוח ניתוח chemotaxis ב 25 דקות, כאשר אין הפרעה בין צעדים ניסיוניים. מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט עבור הבנייה, ניתוח שיטת ניתוח נתונים של assay זה על שבב chemotaxis assay. המאמר מדגים את השימוש היעיל בשיטה שפותחה עבור ביצוע chemotaxis נויטרופילי על ידי בדיקת chemoattractant רקומביננטי ידוע דגימות chemotactic מורכבים מהחולים, ואחריו דיון על אסטרטגיות פתרון בעיות, מגבלות וכיוונים עתידיים.

<table><tbody><tr><td><חזק>ייצור מכשיר</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>יישור מסכה</td><td>ABM</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Spinner</td><td>Solitec</td><td>5000</td><td></td></tr><tr><td>Hotplate</td><td>VWR</td><td>11301-022</td><td></td></tr><tr><td>מנקה פלזמה</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>מייבש ואקום</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-594-15A</td><td></td></tr><tr><td>משקל דיגיטלי</td><td>Ohaus</td><td>CS200</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2000 דק יותר</td><td>Microchem</td><td>SU-8 2000</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2025 Photoresist</td><td>Microchem</td><td>SU-8 2025</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 מפתח</td><td>Microchem</td><td>SU-8 מפתח</td><td></td></tr><tr><td>Si wafer</td><td>Silicon, Inc</td><td>LG2065</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופיל אלכוהול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A416-4</td><td></td></tr><tr><td>(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) trichlorosilane</td><td>Gelest</td><td>78560-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>2065622</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875714</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית שקופיות Fisher</td><td>Scientific</td><td>12-544-4</td><td></td></tr><tr><td>משטח חיתוך</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>בהתאמה אישית</td></tr><tr><td>פאנצ'רים</td><td>N/A</td><td>N/</td><td>A מותאם אישית</td></tr><tr><td>שם</td><td>Source</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>on-chip cell isolation and chemotaxis assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025502</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002802</td><td></td></tr><tr><td>בקר סרום אלבומין (BSA)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>SH3057402</td><td></td></tr><tr><td>פיברונקטין</td><td>VWR</td><td>CACB356008</td><td></td></tr><tr><td>fMLP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3506-10MG</td><td></td></tr><tr><td>דיסקים מגנטיים</td><td>Indigo Instruments</td><td>44202-1</td><td>בקוטר 5 מ"מ, עובי</td></tr> <tr><td> 1 מ"מFITC-Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD10S</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine</td><td> Sigma-Aldrich</td><td>R4127-5G</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa תמיסת כתמים</td><td>Rowley Biochemical Inc.</td><td>G-472-1-8OZ</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Direct Human Neutrophil Isolation ערכת</td><td>STEMCELL Technologies Inc</td><td>19666</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Ti-U מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך</td><td>תא סביבתי מיקרוסקופ Nikon</td><td>Ti-U</td><td></td></tr><tr><td>.</td><td>מצלמת InVivo Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>CCD</td><td>Nikon</td><td>DS-Fi1</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטה all-on- שבב עבור ניתוח נויטרופילי מהיר chemotaxis ישירות מתוך ירידה של דם

An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood

הגירה נויטרופילי chemotaxis הם קריטיים עבור המערכת החיסונית של הגוף שלנו. מכשירים Microfluidic משמשים יותר ויותר לחקר נדידת נויטרופילים chemotaxis בשל היתרונות שלהם להדמיה בזמן אמת, שליטה מדויקת של ריכוז כימי הדרגתיות הדרגתית, מופחתת מגיב וצריכה מדגם. לאחרונה, מאמץ גדל והולך נעשה על ידי חוקרים microfluidic לעבר פיתוח משולב ופעל בקלות microfluidic chemotaxis ניתוח מערכות, ישירות מכל הדם. בכיוון זה, שיטת All-on-chip הראשונה פותחה עבור שילוב הטיהור השלילי המגנטי של נויטרופילים ואת assay chemotaxis מדגימות נפח דם קטן. שיטה חדשה זו מאפשרת מהירה דגימה אל נויטרופיל הבדיקה chemotaxis הבדיקה ב 25 דקות. במאמר זה, אנו מספקים בנייה מפורטת, ניתוח שיטת ניתוח נתונים עבור assay זה כל שבב chemotaxis assay עם דיון על אסטרטגיות לפתרון בעיות, limiציורים וכיוונים עתידיים. תוצאות נציג של assay chemotaxis נויטרופילי בדיקות chemoattractant מוגדר, N -Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), ואת כיח מחולה מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), תוך שימוש בשיטה זו על כל שבב מוצגים. שיטה זו חלה על חקירות רבות הקשורות להעברת תאים ויישומים קליניים.

נויטרופילים נבחרים באופן שלילי מתוך ירידה של דם שלם ישירות במכשיר microfluidic. טוהר של נויטרופילים מבודדים אומת על ידי שבב Giemsa על השבב ואת התוצאות הראו את בצורת טבעת בצורת גרעין בצורת גרעין של נויטרופילים ( איור 2 א ) 25 . זה מצביע על בידוד יעיל על שבב נויטרופילי בטוהר גבוה מנפח קטן של דם שלם. יתר על כן, מבנה עגינה יכול ליישר ביעילות תאים ליד ערוץ הדרגתי לפני החלת שיפוע כימי ( <strong class=...

מאמר זה מספק את השיטה המפורטת של ביצוע assay chemotaxis נויטרופילי מהיר על ידי שילוב של בידוד שבב נויטרופילי מן הדם כולו ואת הבדיקה chemotaxis על שבב microfluidic יחיד.

שיטה All-on- שבב עבור ניתוח נויטרופילי מהיר Chemotaxis ישירות מתוך ירידה של דם

Neutrophil migration and chemotaxis are critical for our body's immune system. Microfluidic devices are increasingly used for investigating neutrophil ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים שיטה להפרדת נויטרופילים מטיפת דם מלא ולאחר מכן לבצע בדיקת כימוטקסיס לאחר מכן באמצעות מכשיר מיקרופלואידית יחיד. שיטה זו מספקת את הקוד שלנו לביצוע בדיקת כימוטקסיס נויטרופילים באמצעות נפח קטן של דם מלא. וניתן ליישם בקלות על ידי חוקרים כדי לענות על שאלות ביולוגיות הקשורות לנדידת תאים חיסוניים.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שילוב ובדיקת הכימוטקסיס שלנו במכשיר מיקרופלואידית יחיד. זה מאפשר הרכבה וניתוח תוך 25 דקות. כדי להתחיל, הכן את המאסטר מאלדוס המתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה.לאחר מכן סילן את פני השטח של תבנית SU8 כדי להקל על שחרור PDMS מהתבנית. לאחר מכן, מערבבים 40 גרם בסיס PDMS וארבעה גרם של חומר הנשיאה בכוס פלסטיק. מניחים את תבנית המאסטר SU8 המוכנה בצלחת פטרי ויוצקים בזהירות את תמיסת ה-PDMS המעורבת על התבנית.מניחים את צלחת הפטרי במייבש ומורחים ואקום כדי לנקות את תמיסת ה-PDMS למשך 20 דקות. לאחר מכן, הכניסו את צלחת הפטרי לתנור ורפא את ה-PDMS בחום של 80 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר האפייה חותכים בזהירות ומקלפים את לוח ה- PDMS מתבנית SU8.חותכים את לוח ה-PDMS כדי להפריד אותו למכשירים בודדים. חתוך את התקן ה-PDMS כדי ליצור שני קירות סביב יציאת טעינת התאים להחזקת המגנטים. לאחר מכן, נקב את יציאת טעינת התאים באמצעות אגרוף בקוטר שלושה מילימטרים.לאחר מכן, עבור לאגרוף של שישה מילימטר והסר את מאגרי הכניסה הכימית ביציאת הפסולת. בעזרת פיסת סרט דבק, הסר את האבק על פני לוח ה- PDMS. הנח את הלוח הנקי בשקופית זכוכית נקייה לתוך מכונת הפלזמה.מרחו את הוואקום למשך שלוש דקות. ואז הפעל את כוח הפלזמה והגדר את הרמה לגבוהה. כוונן בעדינות את שסתום האוויר והפלזמה לטפל ב-PDMS ובמגלשת הזכוכית למשך שלוש דקות.בסיום, כבה את כוח הפלזמה ושחרר את הוואקום. הוצא בזהירות את לוח ה-PDMS במגלשת הזכוכית באמצעות פינצטה, הנח מיד את לוח ה-PDMS על גבי מגלשת הזכוכית, כאשר מבני התעלה פונים כלפי מטה לחץ בעדינות על לוח ה-PDMS כדי להצמיד אותו לזכוכית ולאחר מכן מלא מיד את התעלה המיקרופלואידית במים נטולי יונים. ה-PDMS נלחצו בדרך כלל על מצע הזכוכית כדי להימנע בבאר בתעלת המחסום.הסר את המים נטולי היונים מהמכשיר והוסף 100 מיקרוליטר תמיסת פריברונקטין מהשקע. המתן שלוש דקות כדי לוודא שכל התעלות מלאות בתמיסת פיברונקטין לאחר מכן, דגרו את המכשיר בצלחת פטרי מכוסה למשך שעה בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, הסר את תמיסת הפיברונקטין מהמכשיר והוסף 100 מיקרוליטר של מדיום הגירה מהשקע. שוב, המתן שלוש דקות כדי להבטיח שכל הערוצים יתמלאו במדיום הנדידה. דגרו את המכשיר למשך שעה נוספת בטמפרטורת החדר לפני השימוש במכשיר בניסוי הכימוטקסיס.הכניסו עשרה מיקרוליטרים של דם מלא לתוך שפופרת של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף שני מיקרוליטר מקוקטייל הנוגדנים. ושני מיקרוליטרים של חלקיקים מגנטיים מערכת בידוד נויטרופילים ומערבבים בעדינות את הצינור על מנת לתייג מגנטית את התאים המתויגים בנוגדנים.דגרו על תערובת התווית למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, חבר שני דיסקים מגנטיים קטנים לשני הצדדים של יציאת טעינת התאים של המכשיר. שאפו את המדיום מכל יציאות המכשיר.לאחר מכן, פיפטה לאט שני מיקרוליטרים מתערובת הדם המסומנת לתוך המכשיר המיקרופלואידי מיציאת טעינת התאים. הנח את המכשיר המיקרופלואידי על שלב המיקרוסקופ מבוקר הטמפרטורה ב-37 מעלות צלזיוס. המתן מספר דקות עד שמספיק נויטרופילים נלכדים באזור העגינה של התא.לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת המשיכה הכימית ומדיום נדידה של 100 מיקרוליטר למאגרי הכניסה המיועדים להם באמצעות שני פיפטורים. זה ייצור שיפוע כימו-מושך על ידי ערבוב כימי מבוסס זרימה למינרית רציפה. הכימותרפיה יכולה להיות חלבונים רקומביננטיים כגון FMLP או דגימה קלינית כגון סופרנטנט של ליחה מחולים עם COPD.לאחר שהזרימה התייצבה, רכוש תמונות פלואורסצנטיות של שיפוע דקסטרון FitZ בערוץ. לאחר מכן, דגרו את המכשיר בשלב המיקרוסקופ מבוקר הטמפרטורה, או בחממת תרבית תאים קונבנציונלית למשך 15 דקות. לאחר הדגירה, דמיין את ערוץ השיפוע באמצעות יעד פי עשרה כדי לתעד את המיקומים הסופיים של התא לניתוח נתונים.נויטרופילים נבחרים באופן שלילי מטיפה של דם מלא ישירות במכשיר המיקרופלואידי, באמצעות תיוג נוגדנים לחלקיקים מגנטיים וזוג מגנטים. על מנת לאשר את טוהר הנויטרופילים המבודדים על השבב, בוצעה צביעת גימסה. התוצאות מראות את הגרעינים האופייניים בצורת טבעת ואונה של נויטרופילים.לאחר טעינת התאים, מבנה העגינה מיישר ביעילות את התאים ליד תעלת השיפוע לפני החלת שיפוע כימי. כאשר נחשפים לשיפוע כימי למשך 15 דקות, מתרחשת כימוטקסיס. וניתן למדוד באמצעות הדמיה.תוצאות אלה מראות כי לאחר 15 דקות, תאים מעטים זחלו דרך תעלת המחסום בדגימה המבוקרת הבינונית. לעומת זאת, נויטרופילים רבים נעו במהירות דרך תעלת המחסום ונדדו לעבר שיפוע FMLP של 100 ננו-מולרי. ברגע שזה יכול לשלוח כימוטקסיס ישירות מאיתנו בתוך 25 דקות.זה מציע כלי שימושי לחוקרים לחקור את המכניקה של נדידת תאים שלמים. וכלי ליישומים קליניים.

an-all-on-chip-method-for-rapid-neutrophil-chemotaxis-analysis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

פרוטוקול זה מתאר את הפיתוח של המכשיר microfluidic לחקירת chemotaxis חיידקים הדרגתיים ריכוז יציב של chemoeffectors.

מכשיר microfluidic לכימות Chemotaxis חיידקים Gradients ריכוז אורווה

סרטון זה מדגים בדיקת כימוטקסיס נויטרופילים בשיטת All-on-Chip. השיטה מאפשרת בידוד ישיר של נויטרופילים מהדם כולו על ידי ברירה שלילית אימונומגנטית ואחריה בדיקת כימוטקסיס על שבב מיקרופלואידי.

שיטה מיקרופלואידית מבוססת שבב לניתוח מהיר של כימוטקסיס נויטרופילים באמצעות דם מלא

במאמר זה אנו מציגים שבב microfluidic לניתוח תא בודד. זה מאפשר כימות של חלבונים תאיים, אנזימים, cofactors, ושליחים שני באמצעות מבחני או immunoassays ניאון.

שבב microfluidic לניתוח הכימי תכליתי של תאים בודדים

דבקות נויטרופילים לאנדותל מופעל באתרים של זיהום היא מרכיב בלתי נפרד של התגובה הדלקתית של המארח. שתואר בדוח זה הוא assay מחייב נויטרופילים...

כמותי<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay כדי למדוד הידבקות נויטרופילים לתאים מופעלים עיקריים אדם אנדותל כלי הדם בתנאים סטטיים

פרוטוקול זה מפרט assay נועד למדוד chemotaxis נויטרופילים אדם מטיפה אחת של דם מלא עם שחזור חזק. גישה זו עוקפת את הצורך בהפרדת נויטרופילים ודורשת זמן הכנת assay רק כמה דקות. שבב microfluidic מאפשר למדוד החוזרים ונשנים של chemotaxis נויטרופילים לאורך זמן בתינוקות או יונקים קטנים, שבו נפח דגימה מוגבל.

פלטפורמת microfluidic למדידת נויטרופילים Chemotaxis מדם מלא לא מעובד

מבחני chemotaxis חזותיים חיוניים להבנה טובה יותר של איך איקריוטיים תאים לשלוט נדידת תאים כיוונית בתיווך chemoattractant. כאן אנו מתארים שיטות מפורטות: 1) בזמן אמת, ניטור ברזולוציה גבוהה של מבחני chemotaxis מרובים, ו -2) בו זמנית לדמיין את שיפוע chemoattractant ואת דינמיקת spatiotemporal של איתות אירועים בתאי HL60 דמוי נויטרופילים.

G הדמית חלבון בשילוב קולטן בתיווך Chemotaxis ואירועי האיתות שלה בתאי HL60 נויטרופילים דמויים

פרוטוקולים עבור הערכה כמותית של לימפוציטים כימוטקסיס והעברה הן כלי חשוב עבור מחקר באימונולוגיה. . הנה, פרוטוקול במבחנה מתואר כי היתרים בזמן אמת, מרובב הערכה של נדידת תאים, כמו גם משלימים ויוו טכניקה המאפשרת מעקב של תאים מקורית על הטחול.

לכימות מונוציט האנושי כימוטקסיס במבחנה , לימפוציט מאתר סחר In Vivo

פרוטוקול זה יוצר מיקרו-מערכים ביוביופית המספקים שורצים בעלי מליטה באמצעות הספפיל. הוא מספק גישה קלה למגשרים כי נויטרופילים שחרור במהלך הגירה ומאפשר ניתוח הדמיה כמותית.

ביו-מאמר מיקרומערכים למיקרוטקטיקה וניתוח מולקולרי של נויטרופילים אנושיים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול בדיקה כימוטקסיס משופר. מטרת פרוטוקול זה היא להפחית את הצעדים והעלויות של שיטות כימוטקסיס חיידקיות מסורתיות ולשמש משאב בעל ערך להבנת אינטראקציות בין צמחים למיקרובים.

בדיקת כימוטקסיס משופרת לזיהוי מהיר של כימותרפים ריזובקטריאליים באקסודות שורש

פרוטוקול זה מתאר שיטת סינון מבוססת ציטומטריה של זרימה בתפוקה גבוהה לזיהוי תרופות במולקולות קטנות המעכבות הפעלת אינטגרין β2 על נויטרופילים אנושיים.

טכניקת תפוקה גבוהה מבוססת ציטומטריה של זרימה לבדיקת תרופות מעכבות אינטגרין

פרוטוקול זה כולל סדרה של בדיקות פונקציונליות נויטרופילים שישמשו כשיטת סינון לכיסוי פונקציות ממסלולי איתות שונים. הפרוטוקול כולל הערכה ראשונית ופשוטה של כדאיות התא, טוהר, ייצור מיני חמצן תגובתי, נדידה בזמן אמת, פגוציטוזה, והצעה ראשונית של מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים.

סדרה של טכניקות סינון לסקירה מהירה של פונקציית נויטרופיל

למדו שיטה מהירה לבידוד נויטרופילים מדם שלם וביצוע ניסוי Chemotaxis במכשיר מיקרו-נוזלי יחיד. השיטה מאפשרת ניתוח תוך 25 דקות ומפשטת מחקר על נדידת תאי חיסון.

שיטה All-on- שבב עבור ניתוח נויטרופילי מהיר Chemotaxis ישירות מתוך ירידה של דם

גלה סרטונים נוספים