בהערכת פגיעה עיקריים אפקטים במבחנה

המטרה הכוללת של שיטה זו היא ליצור גלי הלם מייצגים שיכולים להתרחש במהלך אירועי פיצוץ ולהעריך את ההשפעה של הלם מכני זה על הכדאיות של תאים ראשוניים בתרבית. שיטה זו יכולה לעזור לנו לענות על שאלות מפתח הנוגעות לתגובה של סוגי תאים בודדים לאירועים בעלי אנרגיה גבוהה כגון חשיפה לגל הלם. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא מאפשרת לנו להעריך תגובות תאים מובחנות לגל הלם בודד בניגוד לתגובות ברמת הרקמה או האיבר.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על זיהוי המנגנונים התאיים שהשתנו כתוצאה מפגיעות פיצוץ ראשוניות, הנגרמות מחשיפה לגל הלם. למרות ששיטה זו מודגמת עם סוג תא ספציפי של עניין, ניתן לתרבית כל תא ולמקם אותו בתוך מערך הבדיקה כדי להעריך תגובות ספציפיות לתא לגל הלם. כדי להתחיל, תרבית את קו התאים המעניין בתרבית סטנדרטית עד שהם מגיעים למפגש של 80%.

לאחר מכן, שאפו את המדיום. שטפו את התאים פעמיים עם PBS, והוסיפו שני מיליליטר טריפסין-EDTA. דגרו אותם בתנאי תרבות סטנדרטיים למשך חמש דקות.

בדוק בקצרה כדי לוודא שהתאים התנתקו בהצלחה מהבקבוק. ואז להוסיף לבקבוק ארבעה מיליליטר של מדיום תרבית המכיל FBS על מנת לנטרל את הטריפסין ולהעביר את התאים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. צנטריפוגה של התאים ב-200 פעמים גרם למשך ארבע דקות כדי לגלול את התאים.

לאחר מכן, שאפו לאט את הסופרנטנט תוך הקפדה לא לעקור את הכדור. ולהשעות את הגלולה בחמישה מיליליטר בינוני. מניחים שלוש מנות מסומנות של 35 מיליליטר בתוך צלחת של 90 מיליליטר.

לאחר מכן, הוסיפו שני מיליליטר בינוני לכל מנה וזרעו אותם כל אחד עם 70 אלף תאים. דגרו את התאים למשך הלילה כדי לאפשר חיבור תאים הולם לפני חשיפתם לגל ההלם. לפני תחילת הרכבת צינור ההלם, לבש את ציוד המגן האישי המתאים, כולל מגפי עבודה מפלדה ומעיל מעבדה.

התחל בהכנסת שני מוטות יישור דרך חורי הברגים שנמצאים במישור האופקי של אוגן היציאה. לאחר מכן, הנח יריעת אטם גומי ניטריל מעל קצה מוטות היישור כך שהיא תשב בין אוגן היציאה למתקן תרבית האיברים ex vivo. חבר את מתקן ה-EVOC לאוגן היציאה של צינור ההלם על ידי החלקת המתקן מעל מוטות היישור.

ודא שהוא מכוון נכון כך שהחלק המחזיק את צלחת הפטרי ממוקם בבסיסו. לאחר מכן, הכנס ארבעה ברגים ודסקיות M24 לחורים הנותרים והדק היטב את האומים והברגים ברצף בצורה סימטרית באלכסון, תוך בדיקה ויזואלית שאסדת ה-EVOC וצינור ההלם התיישרו בהצלחה. לאחר מכן, חבר מתמר לחץ למתקן EVOC וחבר אותו למקור הנוכחי באמצעות כבל חיישן.

בנוסף, השתמש בכבל BNC כדי לחבר את המקור הנוכחי לאוסצילוסקופ. ודא שכל שסתומי השחרור ובקרות הזרימה בצינור ההלם סגורים. לאחר מכן, פתח את חברת התעופה הדחוסה החיצונית המובנית וסובב ידנית את ווסת הלחץ בכיוון השעון כדי לטעון את הסולנואיד ל-2.5 בר.

פתח את גליל האוויר הדחוס, ולאחר מכן סובב לאט את ווסת הלחץ בכיוון השעון כדי להגביר את הלחץ לכ-15 בר. לאחר מכן, הכינו דיאפרגמות על ידי חיתוך יריעת פלסטיק בעובי 0.125 מיליליטר לריבועים של 10 ס"מ על 10 סנטימטר. צור ידיות מסרט וקבע אותן לחלק העליון והתחתון של הדיאפרגמה.

השתמש בהם כדי למקם בזהירות את הסרעפת ליד האוגן הקטן הקדמי ליד תא העכוז. ודא שהדיאפרגמה ישרה וממוקמת כהלכה לפני סגירת העכוז. ולאחר מכן אבטח אותו במקומו באמצעות ארבעה ברגים ואומים M24.

בתוך מכסה המנוע הסטרילי, הכינו ממברנות חדירות גז דביק כך שכל אחת מהן תהיה גדולה מספיק כדי לכסות את החלק העליון של צלחת פטרי אחת של 35 מיליליטר. לאחר מכן, העבירו צלחת פטרי של 90 מיליליטר המכילה שלוש דגימות ניסיוניות למכסה המנוע. שואבים את המדיום מאחד הכלים, ומכסים אותו בשני קטעי קרום, ומוודאים שיש איטום הדוק בין הממברנה לקצה המנה.

העבר את הדגימה למתקן EVOC ואבטח אותה לבסיס המתקן כך שהחלק העליון של המנה מיושר עם הבסיס הפנימי של צינור ההלם. בשלב זה, הניחו מגיני אוזניים, משקפי מגן, מגפי בטיחות ומעיל מעבדה. לחץ על מערכת צינורות ההלם על ידי סיבוב כפתור בקרת הזרימה על הרגולטור בכיוון השעון.

בתחתית לוח הבקרה, בחר את כניסת העכוז הכפולה לגל הלם קצר, או את כניסת צינור הנהג למשך גל מוגבר. לאחר מכן, הפעל את מקור הכוח DC ואת האוסילוסקופ כדי לדרוש את נתוני צורת הגל. לאחר מכן, הדליקו את אורות הבטיחות באמצעות המתג על הקיר מול לוח הבקרה על מנת להודיע לחוקרים אחרים לא להיכנס לחדר כאשר צינור ההלם נטען.

בתיבת בקרת הסולנואיד, לחץ על המתג כדי לסגור את הסולנואיד. לאחר מכן, בלוח הבקרה, פתח לאט את בקרת הזרימה על ידי סיבוב הכפתור נגד כיוון השעון כדי להגביר בהדרגה את הלחץ בתוך תא הדחיסה. כאשר מגיעים ללחץ פרץ הסרעפת, הסרעפת תיקרע וישמע מפץ.

לאחר שנשמע רעש זה, סגור במהירות את כפתור בקרת הזרימה. לאחר מכן, פתח את הסולנואיד על ידי כיבוי המתג בתיבת בקרת הסולנואיד, וכבה את נורית הבטיחות. העבר את דגימת התא למכסה המנוע הסטרילי.

שם, הסר את הממברנה החדירה לגז הדביק, ומלא את המנה בשני מיליליטר של מדיום גידול טרי. הוסף 200 מיקרוליטר של מגיב מחוון חיזור לכל מנה ניסיונית מיד לאחר מילויים בשני מיליליטר של מדיום גידול טרי. לאחר מכן, העבירו את המנה לחממה רגילה למשך ארבע שעות.

לאחר הדגירה, העבירו שתי מנות של 100 מיקרוליטר מכל מנה לצלחת מתאימה של 96 בארות. קרא את הלוח בקורא לוחות פלואורסצנטי ולאחר מכן ייצא ושמור את הנתונים. לצורך הדמיה פלואורסצנטית של תאים חיים ומתים, יש לצפות תחילה את התאים על החלקת כיסוי זכוכית בתוך לוחות התרבית של 35 מיליליטר.

לאחר טיפול בגלי הלם, יש לשאוב את המדיום ולשטוף את התאים פעמיים במיליליטר אחד של PBS. לאחר מכן, העבירו 100 מיקרוליטר של המגיב המת החי מערכת ההדמיה לכל דגימה. ודגרו על התאים והמגיב בטמפרטורת החדר, הגנו עליו מפני אור למשך 15 דקות.

לאחר הדגירה, הסר את המגיב ושטוף את התאים פעם אחת באמצעות מיליליטר אחד של PBS. בעזרת מלקחיים עדינים יש להסיר בזהירות את החלקה מהצלחת בנפח 35 מיליליטר ולהניח אותה עם הפנים כלפי מטה על שקופית מיקרוסקופיה מזכוכית. רכוש תמונות עבור כל דגימה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד בעדשת אובייקטיבית פי 5 בעלת צמצם מספרי של 0.25.

לאחר מכן, השתמש בתוכנת ניתוח תמונות כדי לספור באופן ידני או אוטומטי את מספר התאים הירוקים החיים והתאים המתים האדומים מכל תמונה. באמצעות השיטה המתוארת כאן, תאים שגדלו בשכבה אחת נחשפו לגלי הלם שנוצרו באמצעות צינור הלם. חיישנים בצינור ההלם מציגים את פרופילי הלחץ שנצפו במקומות שונים לאורך הצינור.

באמצעות בדיקת חיזור, נמצא כי יישום של גל הלם של 127 קילופסקל הצליח להפחית משמעותית את הכדאיות של תאי פפילה עוריים בהשוואה לביקורת לאחר 24 שעות בתרבית. יישום של 72 קילופסקל או פחות של גל הלם לא הפחית את הכדאיות. כדי לתמוך בתצפיות אלה, בדיקת מת חי הדגימה גם ירידה בכדאיות התאים אצל אלה שנחשפו לגל ההלם של 127 קילופסקל בהשוואה לביקורת.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו במהירות משתנה בקצב של 60 דגימות לשעה. ניתן להשתמש בצינור ההלם ליצירת גלי הלם כדי לחקור מגוון של פציעות פיצוץ ראשוניות. אלה יכולים לנוע בין ריאות פיצוץ ועד להתעצמות הטרוטופית, שהיא היווצרות לא מתאימה של עצם בתוך הרקמות הרכות של הגוף.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור את הסיכונים הכרוכים בעבודה עם גזים דחוסים וגלי הלם באנרגיה גבוהה, ולעקוב תמיד אחר הנחיות הבטיחות הנכונות. שינויים קלים בצינור הלם יכולים לאפשר לנו לשנות את גל ההלם. לאחר מכן אנו יכולים להעריך את התגובה התאית לפרופילי לחץ ועוצמות שונות, המייצגים תרחישי פיצוץ שונים.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע ריצוף מהדור הבא כדי לענות על שאלות מחקר נוספות, כגון, כיצד חשיפה לגל הלם משנה את הכיתוב הטבעי שלנו בתוך התאים?