ניתוח של החומצה הרטינואית המושרה בידול עצבית של תאי גזע עובריים עכבר בשניים ובשלושה-ממדי גופים Embryoid

המטרה הכוללת של הליך זה היא לנתח את הביטוי והייצור של גנים וסמני חלבון, בהתאמה, של התמיינות עצבית של תאי גזע עובריים של עכברים. שיטה זו יכולה לסייע בקביעת המנגנון האחראי לעיכוב ההתמיינות העצבית על ידי הגיל הגולמי של DPAs, ולהוביל לפרוטוקולים טובים יותר להתמיינות תאי גזע לנוירונים למטרות טיפוליות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת מעקב אחר תהליך ההתמיינות העצבית ברמת האמרין והחלבון, כולל על ידי מיקרוסקופיה אופטית.

מי שידגים את ההליך יהיה ד"ר ג'ונינג יאנג, עמית מחקר במעבדה שלי. התחל ביצירת גוף עוברי על ידי קצירת תאי גזע עובריים עם 0.25% טריפסין-EDTA למשך שתיים עד חמש דקות ב-37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני. הוסף את המדיום החדש של Iscove, או IMDM, עם 15% FBS לתאים המתנתקים, והעביר את תרחיף התאים לצינור של 15 מיליליטר.

צנטריפוגה בטמפרטורה של 160 x גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר, והכינו חמישה x 10 עד החמישי תאים לתרחיף מיליליטר ב-IMDM עם חומצה רטינואית מיקרו-מולרית 0.5. לאחר מכן, השתמש בפיפטה בעלת שמונה ערוצים ובקצות של 200 מיקרוליטר כדי לצלחת טיפות של 120 מיקרוליטר לכל צלחת פטרי של 100 מילימטר.

הפוך את הכלי ומלא את המכסה ההפוך ב-PBS כדי למנוע התייבשות של טיפות תלויות. תרבית ב-37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני, למשך שלושה עד ארבעה ימים. השתמש בקצות פיפטה של 200 מיקרוליטר כדי לקצור גופים עובריים תלויים שגדלו במשך שלושה ימים.

גע בגוף עוברי עם קצה פיפטה, והעביר אותו להחלקת כיסוי מצופה פיברנקטין בצלחת של 24 בארות. החלף את המדיום בתרבויות כל יומיים-שלושה. בעת שינוי המדיום, אסוף את המדיום המשמש לניתוח הפרשת חלבון לפי הצורך.

כדי לזהות חלבונים מופרשים במדיום, העבירו 500 מיקרוליטר של מדיום גוף עוברי למסננים צנטריפוגליים חתוכים של 10 קילודלטון, וסובבו ב-20,000 x G בארבע מעלות צלזיוס. בדוק את המדיום שנותר בתוך המסננים הצנטריפוגליים כל 15 עד 20 דקות כדי למנוע העשרה מוגזמת. עצור צנטריפוגה כאשר נפח המדיום שנותר ירד ל -25 מיקרוליטר.

הפוך את המסנן וסובב ב-160 x G בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן אסוף את המדיום המרוכז הנותר על ידי ביצוע הוראות היצרן. לתרבית תלת מימדית, קצרו גופים עובריים שגדלו במשך ארבעה ימים כטיפות תלויות עם קצות פיפטה של 200 מיקרוליטר, כמו קודם. העבירו 30 גופים עובריים לצינור צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, ולאחר מכן הכינו תמיסת ג'ל קולגן על ידי דילול נפחים מתאימים של תמיסת קולגן ו-5X DMEM, הוספת תמיסת הנטרול וערבוב מיד היטב.

מניחים את ג'ל הקולגן על קרח. לאחר מכן, פיפטה נפח מתאים של תמיסת קולגן צוננת לתוך הצינור המכיל את הגופים העובריים, ולאחר מכן פיפטה בעדינות את תרחיף הגוף העוברי לבארות של צלחת בת שש בארות מבלי ליצור בועות. העבירו מיד את הצלחת ל-37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני, למשך 60 דקות כדי להתחיל פילמור קולגן.

לאחר 60 הדקות, כיסו את הצלחת המכילה את הגופים העובריים עם IMDM. לדיסוציאציה של גוף עוברי, אסוף שוב את הגופים העובריים התלויים של ארבעה ימים עם קצות פיפטה של 200 מיקרוליטר. הפעם, העבירו אותם לצלחת פטרי בקטריולוגית לא דביקה המכילה IMDM עם 15% FBS ותרבית ב-37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני, למשך ארבעה ימים נוספים.

בדוק את הגופים העובריים פעמיים ביום כדי לוודא שהם אינם נצמדים לתחתית. לנער בעדינות את המנה כדי למנוע הצמדת גוף עוברי. לאחר ארבעה ימים, העבירו את הגופים העובריים לצינור צנטריפוגה וצנטריפוגה ב-185 x G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר הצנטריפוגה, הסר את הסופרנטנט. נפח הפלטה לא יעלה על 100 מיקרוליטר. לאחר מכן, פיפטה מיליליטר אחד של 0.25% קולגנאז מסוג I, בתוספת 20% FBS ב-PBS לתוך הצינור של גופים עובריים.

דוגרים את התערובת למשך שעה בחום של 37 מעלות צלזיוס ו -5% פחמן דו חמצני. פיפטה בעדינות את המתלה באמצעות קצה פיפטה של מיליליטר כל 20 דקות. לאחר הדגירה יש לשטוף בעדינות את התאים שלוש פעמים עם PBS.

אם קיימים אגרגטים של תאים, השתמש במסננת תאים עם רשת של 100 מיקרון כדי להסיר אותם. צלחת את התאים על החלקות כיסוי מצופות ג'לטין ב-IMDM, ואז דגירה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. שטפו את הגופים העובריים הדו-ממדיים או התלת-ממדיים המנותקים עם PBS.

לאחר מכן תקן עם ארבעה אחוז פרפורמלדהיד ו-PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת התאים הקבועים שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר פסולת תאים צפה, הוסף 1% טריטון X-100 ב-PBS כדי לחלחל לתאים למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הכביסה כמו קודם, יש להסיר את הכביסה האחרונה ולחסום עם 5% BSA ב-PBS למשך 30 דקות.

לקראת סוף הדגירה, יש להכין דילול נוגדנים ראשוני ב-1% BSA ב-PBS בתוספת 0.03% טריטון X-100. בחלוף 30 הדקות, החלף את תמיסת החסימה בתמיסת הנוגדנים העיקרית. דגירה במשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר, או למשך הלילה, בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר הכביסה, יש למרוח נוגדן משני ב-PBS ולדגור למשך שעה בטמפרטורת החדר. לבסוף, כיסוי התושבת מחליק על שקופיות זכוכית עם מדיום נגד דהייה למיקרוסקופיה אופטית. תמונה זו מציגה הופעת נבטים מגוף עוברי שנוצר מ-ESCs, חיובי לשני עותקים של הגן Syx, המקודד לגורם חילופי גואנין המפעיל את GTPase RhoA.

התמונה צולמה לאחר שישה ימים בתרבית תלת מימדית. גוף עוברי זה שנוצר מ-Syx KnockOut ESCs מדגים נביטה מוגברת לאחר אותו זמן בתרבית. כאן, תמונות פאזה של קצוות גוף עובריים דו-ממדיים מראות שתאים התרחבו מהר יותר מ-Syx KnockOuts מאשר מסוג Syx Wild-Type.

תמונות אימונופלואורסצנטיות אלה ממחישות כי סמן ההתמיינות העצבי, נסטין, המוצג באדום, היה נפוץ יותר בתאים המתרחבים מגופי עובר 2D6 KnockOut של שישה ימים מאשר מעמיתיהם מסוג הבר Syx. כאן, תמונות אימונופלואורסצנטיות מראות כי סמני ההתמיינות העצביים נסטין ובטא III טובולין היו נפוצים יותר בתאים שהופרדו מגופי עובר 3D6 KnockOut של 13 יום מאשר מעמיתיהם מסוג הבר Syx. זהו הליך שלוקח זמן בגלל משך הצמיחה וההתמיינות של הגוף העוברי.

זה לא רק דורש לפחות שמונה ימים, אלא במקרים מסוימים אנו עוקבים אחר התמיינות עד 24 יום. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להגביל את הכדאיות של קוטר הגוף העוברי כדי להבטיח שיעורי התמיינות דומים לאורך הגופים העובריים.