דיוק גבוהה סריג ברמת מולקולה בודדת עבור קביעת מבנה ביומולקולה
13 במאי 2017
פרוטוקול דיוק גבוהה ניסויים FRET ברמת מולקולה אחת מוצגת כאן. בנוסף, מתודולוגיה זו יכולה לשמש כדי לזהות שלושה מצבי קונפורמציה בתחום ליגנד מחייב של קולטן N-methyl-D-aspartate (NMDA). קביעת מרחקים מדויקים היא הצעד הראשון לקראת בניית מודלים מבניים המבוססים על ניסויים סריג.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לבצע מדידות מרחק בין צבעים ברמת דיוק גבוהה באמצעות זיהוי פלואורסצנטי רב-פרמטרי של F
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לניסויי FRET ברמת דיוק גבוהה ברמת המולקולה הבודדת. המתודולוגיה משמשת לזיהוי שלושה מצבים קונפורמציוניים בדומיין קשירת הליגנד של רספטור NMDA, דבר החיוני לבניית מודלים מבניים המבוססים על FRET.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביופיזיקה
- ביולוגיה מבנית
רקע
- FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) היא טכניקה עוצמתית לחקר אינטראקציות מולקולריות.
- קולטן NMDA ממלא תפקיד מרכזי בפלסטיות סינפטית ובתפקוד הזיכרון.
- הבנת הקונפורמציות של הקולטן יכולה לספק תובנות לגבי תפקודו והוויסות שלו.
- מדידות בדיוק גבוה הן חיוניות עבור מידול מבני מדויק.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול לביצוע ניסויי FRET ברמת דיוק גבוהה.
- זיהוי מצבים קונפורמציוניים של הדומיין הקושר-ליגנד של קולטן ה-NMDA.
- העמקת ההבנה בנוגע לדינמיקה ולאינטראקציות של הקולטן.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ניסויי FRET של מולקולה בודדת.
- ניתוח מצבים קונפורמציוניים של קולטן NMDA.
- מדידות מרחק לביסוס מידול מבני.
- שילוב נתוני FRET עם מידע מבני קיים.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מוצלח של שלושה מצבים קונפורמציוניים נפרדים.
- מדידות מרחק מדויקות שהושגו באמצעות FRET.
- תובנות לגבי הדינמיקה של קולטן ה-NMDA.
- מתודולוגיה שתוקפה עבור מחקרי מבנה עתידיים.
מסקנות
- הפרוטוקול שפותח מאפשר ביצוע אנליזת FRET ברמת דיוק גבוהה.
- זיהוי מצבים קונפורמציונליים הוא קריטי להבנת תפקוד הרצפטור.
- ניתן ליישם מתודולוגיה זו במחקרים של רצפטורים אחרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
FRET של מולקולה בודדת בדיוק גבוה מאפשר מדידות מדויקות של המרחק בין צבעים בביומולקולות, ובכך תומך באפיון מבני של מטרות דינמיות. גישה זו מפחיתה ארטיפקטים ניסיוניים ומספקת הגבלות מרחק בדיוק של ~1 Å במערכות קשיחות, מה שמקל על הפחתת סיכונים מכניסטיים בתיקוף מטרות. יכולתה של השיטה להבחין בין מצבים קונפורמציוניים מגבירה את הביטחון בחיזוי בשלבי הגילוי המוקדמים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות זיהוי מצבים קונפורמציוניים נפרדים של חלבוני מטרה.
- ערך תפעולי: מספק הגבלות מרחק כמותיות המבהירות מנגנוני קישור ודינמיקה תפקודית.
- ערך אסטרטגי: תומך בהפחתת סיכונים של מטרות (de-risking) באמצעות תובנות מבניות המכוונות את זיהוי המולקולות המובילות ואת תיעדוף הפורטפוליו.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: יוצר מדידות מרחק הדירות בעלות דיוק גבוה המתאימות לסטנדרטיזציה של בדיקות.
- ערך תפעולי: ממקסם את השימוש בפרמטרי פלואורסצנציה כדי למזער ארטיפקטים ולשפר את מהימנות המדידה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר פיתוח פלטפורמות גילוי רב-פרמטריות וניתנות להרחבה עבור קריאות עקביות בסריקת תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מספק אילוצי מרחק המכסים את הממדיות הביומולקולרית לצורך מידול מבני דינמי.
- ערך תפעולי: מתקף התאמה ניסיונית לנתונים קריסטלוגרפיים בטווח של <3 Å עבור מערכות גמישות.
- ערך אסטרטגי: תומך ביישור סמנים ביולוגיים תרגומיים על ידי קישור מצבים קונפורמציוניים לתוצאות פונקציונליות.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של גילוי מוקדם על ידי אספקת תובנות מבניות המגשרות בין שלבי תיקוף המטרה לזיהוי המוליכים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים באמצעות פתרון של מצבים קונפורמציוניים.
- סריקה: מספקת פלטיים כמותיים הניתנים לשחזור ומוכנים לבדיקה לצורך הערכה אמינה של תרכובות.
- אנליטיקה: מניבה מדידות מרחק מדויקות ונתוני פלואורסצנציה רב-פרמטריים לניתוח תנאים השוואתיים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין דינמיקה מבנית למצבים פונקציונליים של רצפטורים, מה שמאפשר רציפות פרה-קלינית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת יכולת לשימוש חוזר בזיהוי פלואורסצנציה רב-פרמטרי במגוון מחלקות של מטרות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי במבנה המטרה, הפחתת עמימות מכניסטית ושיפור הדיוק במידול מבני.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה של מדידות מרחק בדיוק גבוה.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות לגבי המשך הפרויקט (go/no-go), יעילות הון והפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים באמצעות הפחתת סיכונים מבנית מוקדמת.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מותאם סיכונים המבוסס על אנסמבלים קונפורמציוניים מאומתים והתנהגות דינמית של המטרה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בפלואורסצנציה של מולקולות בודדות ובניתוח יעילות FRET.
- נדרשת מערכת לגילוי פלואורסצנציה רב-פרמטרית (MFD) וחומרה לספירת פוטונים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי סימון ותנאי בופר להשגת תוצאות עקביות.
- כולל שיקולי התאמה לגדלים ביו-מולקולריים משתנים, לגמישות ולהשפעות של מקשרי צבע.
- מוגבל על ידי ארטיפקטים פוטו-פיזיקליים במערכות דינמיות מאוד, אשר מומעטים באמצעות שימוש בממדיות של MFD.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
10:54
Conclusion
9:28
Results: Inter-dye Distance Determination in Single Molecules
1:07
Preparation of Materials
2:57
Pulsed Interleaved Excitation-Multiparameter Fluorescence Detection (PIE-MFD) Instrument Setup
6:14
Burst Integration Fluorescence Lifetime Analysis of Standards
7:34
dsDNA and Protein Sample Measurements and Analysis
