Name: ב Electrooration Ovo ב המוח עוף שמיעה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: למדו לשלוט בביטוי גנים במוח השמיעה של עוף באמצעות אלקטרופורציה in ovo. שיטה זו מאפשרת חקר התפתחות נוירונים שמיעתיים והבנת הפרעות שמיעה קשורות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לד&quot;ר. Leslayann Schecterson, יואן ואנג, אנדרס Barria וגברת Ximena Optiz-Araya לסיוע ראשוני עם פרוטוקול הגדרת למתן פלסמידים. עבודה זו נתמכה על ידי NIH / NIDCD מענק DC013841 (JTS).

כל הנהלים אושרו על ידי אוניברסיטת נורת &#39;ווסטרן טיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש ועדות, וביצעו בהתאם המוסדות הלאומיים לבריאות הנחיות לטיפול ושימוש של חיות מעבדה. 1. טיפול ביצים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכישת ביצים מופרות מספק מקומי. שמור ביצים על 13 מעלות צלזיוס במקרר לא יותר מ 5 ימים לפני הדגירה. עוברי הכדאיות יורדת באופן משמעותי לאחר שבוע 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוגית כל ביצה עם אתנול 70% לפני ההגדרה בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע 1-2 תריסר ביצים על צדם בחממה עם הטמפרטורה מוגדר 38 ° C ב לחות 50%. זה מבטיח מיקום העובר הנכון electroporation ואת הכדאיות האופטימלית, בהתאמה. הערה: לאחר 48-52 שעות של הדגירה, הביצים יהיו בבית המבורגר המילטון (HH) שלב ~ 12-13 ומוכן electroporation. </li></ol> 2. הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלסמיד מיXing <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μL של 0.1% ירוק מהיר (0.1% ב 18 MΩ deionized ו מזוקקים H 2 O [DDH 2 O]) עבור כל 7 μL של תערובת DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור שיתוף electroporation של פלסמידים מרובים, לערבב פלסמידים ביחס 1: 1. ריכוז ה- DNA הסופי צריך להיות 5-8 מיקרוגרם / μL. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מילוי הזרקת פיפטה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך pipettes על משיכה micropipette. ממלאים את פיפטה עם 1-2 פלסמידים μL באמצעות מחט 28G מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבור קצה פיפטה 10 - 20 מיקרומטר באמצעות מלקחיים. השתמש במיקרוסקופ כדי לסייע בקביעת גודל קצה פיפטה שבור. צרף את פיפטה לבעלים פיפטה של ​​picospritzer. </li></ol></li></ol> 3. חלון הערה: הליך החלונות פורסם לפני 13 . עיין באיגוד 13 למידע חזותי נוסף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגבו את כל המכשירים ואת אזור העבודה עם 70%אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את המספר הרצוי של ביצים להגדיר מתוך האינקובטור (בין 6-10), לעזוב בטמפרטורת החדר, בנפרד ביצים ספוג עם אתנול 70% שוב. ביצים להישאר קיימא לפחות 2 שעות לאחר הסרת חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הביצה על גבי אור אור כדי לזהות את המיקום העובר. מעגל את מרכז האזור הכהה ( כלומר , עובר) עם עיפרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט 19G, לתקוע חור בקצה הסופי של הביצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקעו חור נוסף ליד המעגל המצויר על הצד המחודד של הביצה. הסר חתיכה קטנה של קליפת החיצונית (כ 16 מ&quot;מ 2 ) עם מחט 19G ולאחר מכן להסיר חתיכה קטנה של קליפת הביצה הפנימית (כ 8 מ&quot;מ 2 ) עם מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מזרק 3 מ&quot;ל מצויד מחט 19G, למשוך 1.5-2.5 מ&quot;ל של אלבומין מהביצה דרך חור קהה סוף. הקפד זווית המחט למטה ב 45 °. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את החור הקצה בקצה עם חתיכת סרט קטנה (1 ס&quot;מ x 1 ס&quot;מ). לכסות את המעגל נמשךד החור השני עם קלטת (2.5 ס&quot;מ x 4 ס&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מספריים מעוקל (חיתוך קצה = 2.5 ס&quot;מ), לחתוך חלון בתוך המעגל. מספריים צריך להיות מקביל קליפה ואת הקוטר של החלון צריך להיות פחות מ 2 ס&quot;מ. </li></ol> 4. הזרקה פלסמיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את picospritzer. הגדר את הלחץ 18 psi ואת משך עד 5 μs. הפעל את טנק אוויר מנורה עבור מיקרוסקופ לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך פתרון 30 מ&quot;ל המניות של דילול 1:10 של חנות קנה דיו הודי מעורבב סטרילי פוספט שנאגרו מלוחים (PBS). חנות ב 4 ° C. הזרקת דיו הודית היא צעד חשוב כדי לקבל הדמיה טובה יותר של העובר עוף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים מזרק 1 מ&quot;ל עם פתרון דיו הודי מדולל. צרף מחט 27G ו לגרש כל הבועות כי הם נמצאים מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מחט רק מתחת לממברנה חלמון ~ 2 - 3 מ&quot;מ מן העובר להזריק ~ 0.2 מ&quot;ל של דיו הודית בעדינות מתחת לעובר. לַעֲשׂוֹתלא להזריק יותר מ 0.5 מ&quot;ל של דיו הודית כפי שהוא עשוי להקטין את הישרדות העובר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הביצה בחלון על בעל ביצה מתחת למיקרוסקופ לנתיחה. השתמש ההגדלה הגבוהה ביותר עבור הדמיה הטובה ביותר של האתר הזרקה פלסמיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, להסיר את הממברנה על אזור ההזרקה. אזורי שמיעה שמיעה של אינטרסים ( כלומר , NM ו- NL) נובעים Rhombomeres 5 ו 6 (R5 / R6). R5 / R6 ממוקמים סמוך לאוטוציסט (מבנה עוברי בחוליות המתפתח באוזן הפנימית), המשמשים כציוני דרך עבור זריקות פלסמיד R5 / R6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להנמיך את פיפטה מלא DNA לתוך הצינור העצבי שמעל אזור R5 / R6 ובין otocysts באמצעות micromanipulator. סכמטי של מיקום אידיאלי מוצג באיור 1 א . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל לחץ אוויר (18 psi, 5 μs משך) מן picospritzer להוציא את ה- DNA של הצינור העצבי. </li></ol> 5. Electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את tהוא הנוכחי / מתח ממריץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו מזרק 3 מ&quot;ל עם PBS ו לצרף את מסנן מזרק. הוסף 1-2 טיפות של PBS על העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להנמיך את האלקטרודה דו קוטבית לעובר באמצעות micromanipulator עם האלקטרודה השלילית מעל האתר ההזרקה (המדיאלי) ואת האלקטרודה חיובית לרוחב R5 / R6 ( איור 1 א ). הימנע מגע ישיר עם העובר. השתמש אלקטרודות דו קוטבית שבו חומר האלקטרודה הוא אירידיום פלטינה. התאם את המרווח בין הטיפים 0.5 מ&quot;מ עם מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מתח הנוכחי / מתח, דופק 20 פעמים ב 50 V עבור 1 אלפיות השנייה במרווחים של 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר electroporation, להוסיף טיפה אחת של PBS על פני השטח חשוף. בעדינות להסיר את האלקטרודה ולנקות אותו עם רקמה מעבדה 70% אתנול. סגור את החלון לחשוף את העובר עם קלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית ביצה עם סוג פלסמיד מוזרק ואת תאריך הצוהר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום ביצים בחזרה לתוך חממה עם הצד החלון למעלה. דגירה על 38 מעלות צלזיוס עם 50לחות עד לשלב ההתפתחות הרצויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם וקטור טט על הוא electroporated לשליטה הזמנית של ביטוי גנים, להחיל Doxycycline (Dox) כל 24 שעות כדי לעורר ביטוי גנטי (ראה סעיף 6). </li></ol> 6. Tet על מערכת עבור שליטה זמנית של ביטוי גנים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פלסמידים הבאים: PCAGGS-T2TP: טרנספוזאז להביע פלסמיד. PT2K-CAGGS-rtta-M2: פלסמיד כי ביציבות מבטא את חלבון דוקס מחייב. PT2K-BI-TRE-EGFP: פלסמיד המכיל מקדם דו-כיווני דו-כיווני (TRE), המביא לידי ביטוי את הכתב של EGFP ואת הגן השני המעניין. הערה: שלוש פלסמידים לעיל צריך להיות שיתוף electroporated ביחס 1: 1: 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת פתרון המניות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים Dox סטרילי PBS לייצר פתרון 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​המניות. חנות ב -20 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישום Dox: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעורר את האקספרסיביותN של הגן של עניין במהלך שלבי התפתחות מסוימים, להחיל Dox כל 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר החלת Dox, לקחת את הביצה החוצה, לפתוח את החלון, פיפטה 50 Dox μL על הממברנה chorioallointoic, לסגור את החלון והכניס את הביצה בחזרה לתוך החממה. </li></ol></li></ol> הכנת אזור הניתוח לפרוסות גזע המוח הערה: הסעיפים הבאים (7 - 9) והנהלים פורסמו לפני 14 . עיין בפניות אלו לקבלת מידע חזותי נוסף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון אגר (40 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​agarose, כלומר 4% ב DDH 2 O). יוצקים פתרון אגר לתוך צלחת פטרי ולאפשר לו לחזק בטמפרטורת החדר. חנות מכוסה צלחת אגר במקרר לשימוש עתידי במהלך חיתוך גזע של רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רציף בועה מלאכותית של המוח השדרה (ACSF) עם 95% O 2 ו 5% CO 2 (pH 7.2-7.4 ו osmolarity: 295-310 mOsm / L).</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו את אזור העבודה ואת vibratome עם EtOH 70% ולשטוף את הלהב עם מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים משטח קליטת נוזל נקי על אזור העבודה עם כלי הניתוח המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את צלחת אגר מתוך המקרר, לחתוך קוביית אגר קטן (10 מ&quot;מ x 10 מ&quot;מ x 8 מ&quot;מ). דבק את גוש אגר אל הבמה של החדר vibratome-sllicing באמצעות סרגלינג זמין מסחרית. </li></ol> 8. בידוד של עוף אודיורי המוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את הביצה באתר החלון מוקלט. לנקב את שק הממברנה עם אזמל ולהסיר את הראש של העוף עוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערוף את העוף במספריים חדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את קצה הלהב מעט אחורי לעיניים. חתך דרך הגולגולת על קו האמצע מקורי אל הזנב. החל לחץ קל בהתאם לגיל העובר. עוברים מבוגרים דורשים יותר לחץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לדחוף הצידה עור ונוצות לחשוף את הגולגולת ולאמת לחתוך קו האמצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגשת בקשהלחץ trong, פרוסת החלק מקורי של הגולגולת עם סכין גילוח. מיד מקום להב האחורי לעיניים לחתוך דרך הגולגולת כולה ורקמת המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך חתכים midline ל-לרוחב עם מספריים באזור הזנב של הגולגולת, שרירי הצוואר הקדמי מעט על שני צידי הראש.לגלות המוח והמוח על ידי משיכת משם הגולגולת ורקמות עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים רקמות המצורפות גזע המוח עם מספריים ולהסיר את גזע המוח, אשר חופשיים חופשי מן הגולגולת. </li></ol> 9. הכנת פרוסות גזע עבור ויוו Electrophysiology או הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להצמיד את המוח דרך tecta אופטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המוח הקטן על ידי חיתוך peduncles עם מספריים, לחשוף את הרצפה של החדר הרביעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פינצטה, להסיר את כל רקמות קרום וכלי הדם משטח גזע המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחסום את גזע המוח, לעשות חתך אופקית בקצה מקורי ביותר של הרצפה של הארבעההחדר, רק הזנב אל קליפת המוח. הפוך חתכים לרוחב בניצב דרך tecta אופטי לבודד את גזע המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כמות קטנה של דבק סופר על שלב vibratome ישירות מול בלוק אגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את גזע המוח על חוט השדרה באמצעות פינצטה ומניחים אותו על דבק סופר עם הצד מקורי למטה בצד הגבי לכיוון להב vibratome. הסר דבק עודף עם רקמות מעבדה או נייר סינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים ACSF חמצן לתוך שלב vibratome. הגדר את הלהב vibratome בזווית 20-22 מעלות. התחל vibratome ב-תנודה משרעת מקסימלית. להזיז את הבמה כלפי הלהב כך החלק העליון של הרקמה מקביל עם הלהב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר במהירות להב אל רקמת המוח. להאט את הלהב במידה ניכרת לפני מגע הלהב עם רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוסת רקמה עם המהירות האיטית ביותר האפשרית קדימה. לאחר להב הוא דרך כל החלק רקמות העטרה, בעדינות להסיר את הפרוסה באמצעות פיפטה העברת/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחתון את הבמה 200-300 מיקרומטר ו פרוסת שוב. חזור על עד ציוני דרך אנטומיים של גרעיני השמיעה להיות גלוי, למשל, באזור neuropil הגב / הגחון נפרדת של NL ואת המיקום המדיאלי של NM ביחס NL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשמור על פרוסות ACFS. זה יכול להיעשות בטמפרטורת החדר (22 מעלות צלזיוס) או ליד תנאים פיזיולוגיים (~ 41 מעלות צלזיוס) באמצעות אמבט מים חמים. הערה סדר חיתוך. הפרוסה הראשונה מתאימה לאזור הזנב ביותר של רקמות הפרוסה האחרונה מתאימה לאזור מקורי ביותר. זה מייצג בצורה גסה את הארגון הטונוטופי של גזע המוח השמיעתי, מאזורי קידוד נמוכים לתדר גבוה, בהתאמה. </li></ol>

<ol><li>Grothe, B., Pecka, M., McAlpine, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20664077">Mechanisms of sound localization in mammals.</a> Physiol Rev. 90 (3), 983-1012 (2010).</li>
<li>Anderson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+timing+is+linked+to+speech+perception+in+noise%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural timing is linked to speech perception in noise.</a> J Neurosci. 30 (14), 4922-4926 (2010).</li>
<li>Shannon, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speech+recognition+with+primarily+temporal+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Speech recognition with primarily temporal cues.</a> Science. 270 (5234), 303-304 (1995).</li>
<li>Carr, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+development+of+time+coding+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Evolution and development of time coding systems.</a> Curr Opin Neurobiol. 11 (6), 727-733 (2001).</li>
<li>Carr, C. E., Soares, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+convergence+and+shared+computational+principles+in+the+auditory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Evol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary convergence and shared computational principles in the auditory system.</a> Brain Behav Evol. 59 (5-6), 294-311 (2002).</li>
<li>Rubel, E. W., Parks, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+development+of+brain+stem+auditory+nuclei+of+the+chicken%3A+tonotopic+organization+of+n.+magnocellularis+and+n.+laminaris%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris.</a> J Comp Neurol. 164 (4), 411-433 (1975).</li>
<li>Rubel, E. W., Smith, D. J., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+development+of+brain+stem+auditory+nuclei+of+the+chicken%3A+ontogeny+of+n.+magnocellularis+and+n.+laminaris%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris.</a> J Comp Neurol. 166 (4), 469-489 (1976).</li>
<li>Schecterson, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrkB+downregulation+is+required+for+dendrite+retraction+in+developing+neurons+of+chicken+nucleus+magnocellularis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis.</a> J Neurosci. 32 (40), 14000-14009 (2012).</li>
<li>Chesnutt, C., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid-based+short-hairpin+RNA+interference+in+the+chicken+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo.</a> Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).</li>
<li>Oertel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+of+timing+in+the+brain+stem+auditory+nuclei+of+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Encoding of timing in the brain stem auditory nuclei of vertebrates.</a> Neuron. 19 (5), 959-962 (1997).</li>
<li>Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+origins+of+auditory+brain-stem+nuclei+in+the+chick+hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain.</a> Dev Biol. 224 (2), 138-151 (2000).</li>
<li>Cramer, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EphA4+signaling+promotes+axon+segregation+in+the+developing+auditory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system.</a> Dev Biol. 269 (1), 26-35 (2004).</li>
<li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> J Vis Exp. (8), e306(2007).</li>
<li>Sanchez, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+culture+of+chicken+auditory+brainstem+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation and culture of chicken auditory brainstem slices.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li>
<li>Jhaveri, S., Morest, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+architecture+in+nucleus+magnocellularis+of+the+chicken+auditory+system+with+observations+on+nucleus+laminaris%3A+a+light+and+electron+microscope+study%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal architecture in nucleus magnocellularis of the chicken auditory system with observations on nucleus laminaris: a light and electron microscope study.</a> Neuroscience. 7 (4), 809-836 (1982).</li>
<li>Matsui, R., Tanabe, Y., Watanabe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+adeno-associated+virus+vector+efficiently+transduces+neurons+in+the+embryonic+and+post-embryonic+chicken+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Avian adeno-associated virus vector efficiently transduces neurons in the embryonic and post-embryonic chicken brain.</a> PLoS One. 7 (11), e48730(2012).</li>
<li>Koppl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+nerve+terminals+in+the+cochlear+nucleus+magnocellularis%3A+differences+between+low+and+high+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Auditory nerve terminals in the cochlear nucleus magnocellularis: differences between low and high frequencies.</a> J Comp Neurol. 339 (3), 438-446 (1994).</li>
<li>Hyson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+analysis+of+interaural+time+differences+in+the+chick+brain+stem%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Behav%22%5BJournal%5D)">The analysis of interaural time differences in the chick brain stem.</a> Physiol Behav. 86 (3), 297-305 (2005).</li>
<li>Jones, T. A., Jones, S. M., Paggett, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+hearing+in+the+chicken+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Emergence of hearing in the chicken embryo.</a> J Neurophysiol. 96 (1), 128-141 (2006).</li>
<li>Saunders, J. C., Coles, R. B., Gates, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+auditory+evoked+responses+in+the+cochlea+and+cochlear+nuclei+of+the+chick%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The development of auditory evoked responses in the cochlea and cochlear nuclei of the chick.</a> Brain Res. 63, 59-74 (1973).</li>
<li>Woolf, N. K., Ryan, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+auditory+function+in+the+cochlea+of+the+mongolian+gerbil%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">The development of auditory function in the cochlea of the mongolian gerbil.</a> Hear Res. 13 (3), 277-283 (1984).</li>
<li>Walsh, E. J., McGee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+development+of+auditory+nerve+and+cochlear+nucleus+neuronal+responses+in+kittens%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Postnatal development of auditory nerve and cochlear nucleus neuronal responses in kittens.</a> Hear Res. 28 (1), 97-116 (1987).</li>
<li>Uziel, A., Romand, R., Marot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cochlear+potentials+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Audiology%22%5BJournal%5D)">Development of cochlear potentials in rats.</a> Audiology. 20 (2), 89-100 (1981).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ב electroporation אובו היא שיטה להביע או להפיל גנים של עניין על מנת לנתח את תפקוד הגן vivo 8 , 9 . בעובר עוף, היא שיטה חדשנית להבעת גנים מקודדים פלסמיד לתוך אזורים שונים גזע המוח השמיעתי 8 . כדי להבטיח ביטוי אופטימלי, נדרשים מספר צעדים קריטיים. ראשית, רק להזריק עוברי אשר otocysts נראים בבירור. אם otocysts אינם גלויים העובר הוא לא בשלב ההתפתחות הנכון electroporation. שנית, ...

קידוד עצבי מהיר של צליל הוא חיוני עבור פונקציות השמיעה נורמלי. אלה כוללים יכולות לוקליזציה צליל 1 , דיבור באפליה רעש 2 , ואת ההבנה של אותות תקשורת רלוונטיים אחרים רלוונטיים 3 . נוירונים אנלוגיים הממוקמים בגזע המוח השמיעתי של שני avians ו יונקים הם מאוד מיוחדים עבור קידוד עצבי מהיר 4 . אלה כוללים את גרעין העוף magnocellularis (NM), גרעין laminaris (NL) ואת האנלוגים יונקים שלהם, גרביים שבלול anteroventral (AVCN) ואת המדיום מעולה זית (MSO), בהתאמה. עם זאת, מנגנוני התפתחות המסדירים קידוד עצבי מהיר הם הבינו היטב את המוח השמיעתי. לכן, כדאי ללמוד גנים ספציפיים אשר אחראים על קידוד עצבי מהיר על מנת להבין טוב יותר את הביטוי, הרגולציה והפונקציה שלהם ב- auפיתוח דיטורי. העובר בפיתוח עוף הוא כלי מחקר יעיל ומבוסס ללמוד שאלות ביולוגיות בסיסיות של פיתוח מערכת השמיעה 6 , 7 . ההתקדמות המולקולרית האחרונות התייחסו לשאלות ביולוגיות אלה בעובר המתפתח על ידי הבעת או דפיקות גנים של עניין על מנת לנתח את תפקוד הגן vivo 8 , 9 . לחקור את התפקיד הרגולטורי של גנים ספציפיים היא התקדמות משמעותית בהבנת הפתולוגיות הקשורות גירעונות השמיעה. כאן, אנו מציגים electroporation אובו של גנים מקודדים פלסמיד לתוך המוח גזע עוף שמיעה שם קידוד עצבי מהיר של צליל מתרחשת 10 . על ידי מיקוד שמיעתי אזורים שמיעתי הקשורים rhombomeres 5 ו 6 11 , 12 (R5 /R6), אנו מראים שליטה מרחבית של transfection פלסמיד ב NM ו NL. בנוסף, אנו מראים הרגולציה הזמנית של הביטוי על ידי אימוץ טקט על וקטור המערכת. זהו הליך נוגד תרופה המבטא את הגנים של עניין בנוכחות doxycycline (Dox) 8 .

<table><tbody><tr><td>ביצי עוף לבנה מופרות</td><td>Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Parker Hannifin</td><td>052-0500-900</td><td>Picospritzer III, ערוץ יחיד או כפול</td></tr><tr><td>ממריץ זרם/מתח</td><td>Grass Technologies</td><td>SD9</td><td>SD9 מחטי</td></tr><tr><td>מזרק מיקרופיל</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF28G67-5</td><td>28 מד, אורך 67 מ"מ, (חבילה של 5)</td></tr><tr><td>מחזיק אלקטרודות</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1280</td><td>MP סדרה: יישומי לחץ לא חשמלי</td></tr><tr><td>מגרה מיקרואלקטרודה</td><td>FHC</td><td>PBSA1075</td><td></td></tr><tr><td>PBSA1075 מיכל אוויר/רגולטור</td><td>NU שירותי</td><td></td> מעבדה <td>אוויר יבש 300 CF</td></tr><tr><td>מהיר</td><td>ירוק סיגמא אולדריץ'</td><td>F7258-25G</td><td>F7258-25G</td></tr><tr><td>סרט פלסטיק שקוף</td><td>סקוטש</td><td>191</td><td></td></tr><tr><td>דוקסיציקלין היקלאט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>מקרר ביצים</td> מקרר <td></td><td>יין Vissani</td><td>13.3 - 16.1 & deg; ג (56-61&deg; ו)</td></tr> <tr><td>אינקובטור</td><td>חובה-בטור</td><td></td><td>38 מעלות; C (100 &deg; F), ~50% לחות</td></tr><tr><td>היקף דיסקציה</td><td>Zeiss</td><td>4.35E+15</td><td>SteREO Discovery, מיקרוסקופ V8, 50.4X</td></tr><tr><td>מקור אור קר</td><td>Zeiss</td><td>4.36E+15</td><td>CL6000</td></tr><tr><td>LED מיקרומניפולטורים</td><td>Narishige יפן</td><td>דגם: MM-3</td><td>2 מיקרומניפולטורים</td></tr><tr><td>צינורות נימיים</td><td>מכשיר סאטר</td><td>BF150-86-10</td><td>בורוסיליקט עבה דופן (מידות)</td></tr><tr><td>מזרקים</td><td></td><td></td><td>1 מ"ל, 3 מ"ל</td></tr><tr><td>מחטים</td><td>BD Precision Glide&nbsp;</td><td></td><td>27 גרם x 1 1/4, 19 גרם x 1 1/2</td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>סטולטינג</td><td></td><td>מס' 5 סופר פיין דומונט</td></tr><tr><td>מחזיק ביצים</td><td>בהתאמה</td><td></td> אישית <td>בסיס חימר עובד גם כן</td></tr><tr><td>חולץ מיקרופיפטה</td><td>מכשיר</td><td></td> סאטר <td>דגם P-97</td></tr><tr><td>מסנן מזרק</td><td>Ultra Cruz</td><td>sc-358811</td><td>PVDF 0.22 &mu; מ</td></tr></tbody></table>

ב electrooration ovo ב המוח עוף שמיעה

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Electroporation היא שיטה המציגה גנים של עניין לתוך אורגניזמים ביולוגיים רלוונטיים כמו עוף העוף. זה כבר זמן רב כי העובר עוף הוא מודל מחקר יעיל לחקר תפקודים ביולוגיים בסיסיים של פיתוח מערכת השמיעה. לאחרונה, העובר עוף הפך חשוב במיוחד בחקר ביטוי גנים, רגולציה הפונקציה הקשורים השמיעה. ב electroporation אובו ניתן להשתמש כדי למקד אזורים המוח השמיעתי אחראי על פונקציות שמיעה מיוחדות מאוד. אזורים אלה כוללים את גרעין העוף magnocellularis (NM) ואת גרעין laminaris (NL). NM ו נוירונים NL נובעים מבשרי מובהק של rhombomeres 5 ו 6 (R5 / R6). כאן, אנו מציגים electroporation אובו של גנים מקודדים פלסמיד ללמוד מאפיינים הקשורים גנים באזורים אלה. אנו מראים שיטה לשליטה מרחבית וזמנית של ביטוי גנים המקדמים גם רווח או הפסד של פנוטיפ פונקציונליEs. על ידי מיקוד שמיעתי אזורים שמיעתי הקשורים R5 / R6, אנו מראים transfection פלסמיד ב NM ו NL. הרגולציה הזמנית של ביטוי גנים יכולה להיות מושגת על ידי אימוץ מערכת וקטורית. זהו הליך תרופתי מעורר אשר מבטא את הגנים של עניין בנוכחות doxycycline (Dox). ב ov electroporation טכניקה - יחד עם או ביוכימיים, פרמקולוגיים, או מבחני תפקודית vivo - מספק גישה חדשנית ללמוד פיתוח נוירון השמיעה תופעות פתופיזיולוגיות הקשורות.

אנו מראים כאן כי ב electroporation אובו מאפשר ביטוי גנים במערכת ביולוגית המתפתחת בדרך כלל. גנים מקודדים פלסמיד מוזרקים בפוקוס לתוך הצינור העצבי שמעל R5 / R6. דוגמה סכמטית של האלקטרודה ופיפטה מיקומים יחסית סמנים אנטומיים חשובים מוצג בתרשים 1A . המיקום הנכון של הזרקת פלסמיד הוא אישר 24 שעות לאחר electroporation ומוצג בתרשים 1B . הזרקת ממוקד של פלסמידים לתוך הצינור העצבי שמעל R5 / R6 היתרים ביטוי אזו...

נוירונים גזעיים של גזע המוח של avians ויונקים הם מיוחדים עבור קידוד עצבי מהיר, תהליך בסיסי עבור פונקציות השמיעה הרגילה. נוירונים אלה נובעים מבשרי ברורים של המוח האחורי עובריים. אנו מציגים טכניקות ניצול electroporation להביע גנים במוח האחורי של עוברים עוף ללמוד תפקוד הגן במהלך פיתוח השמיעה.

ב Electrooration Ovo ב המוח עוף שמיעה

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

המטרה הכללית של נוהל זה היא להפעיל בקרה מרחבית וזמנית על ביטוי גנים בגזע המוח השמיעתי של העוף. השימוש באלקטרופורציה in ovo מספק גישה חדשנית לחקר התפתחות נוירונים שמיעיים ותופעות פתופיזיולוגיות נלוות. נוהל זה יכול לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום ההתפתחות העצבית השמיעתית, כגון כיצד הבקרה על ביטוי גנים מקדמת רכישה או אובדן של פנוטיפ הדרושים להתפתחות תקינה של גזע המוח השמיעתי.את הפרוצדורה תדגים ד"ר Ting Lu, עמיתת פוסט-דוקטורט מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, הכינו תמיסות פלסמיד על ידי הוספה של 1 µL של תמיסת Fast Green עבור כל 7 µL של תערובת DNA. לאחר מכן, ערבבו תמיסות DNA ביחס של אחד-לאחד לצורך אלקטרופורציה בו-זמנית של מספר פלסמידים.לאחר הכנת תמיסת הפלסמיד, ייצרו פיפטות באמצעות שובך פיפטות (micropipette puller). לאחר מכן, השתמשו במחט זריקה בכי মাপ 28 כדי למלא את הפיפטה ב-1 עד 2 µL של תמיסת הפלסמיד. בעזרת פינצטה, שברו את קצה הפיפטה לרוחב של 10 עד 20 מיקרון ומדדו את גודל הקצה השבור תחת מיקרוסקופ, ולאחר מכן חברו את הפיפטה ל-picospritzer באמצעות מחזיק פיפטות.לפני התהליך, יש לאחסן ביצים שנרכשו מספק מקומי למשך לא יותר מחמישה ימים במקרר בטמפרטורה של 13 degrees Celsius. לתחילת העבודה, חטאו את הביצה ב-70%ethanol, ולאחר מכן, כדי להשיג מיקום נכון של העובר, דגרו את הביצה על צדה בטמפרטורה של 38 degrees Celsius ובלחות של כ-50%humidity להבטחת חיוניות אופטימלית. לאחר 48 עד 52 שעות של דגירה, כאשר הביצה מגיעה לשלב Hamburger-Hamilton 12 עד 13 בקירוב, חטאו את אזור העבודה ואת כל המכשירים ב-70%ethanol.לאחר מכן הוצא את הביצה מהמדגרה, השאר אותה בטמפרטורת החדר, ונגב אותה שנית עם 70% ethanol. באמצעות מאיר, זהה את מיקומו של העובר, הנראה כאזור כהה, וסמן אותו בעזרת עיפרון על ידי ציור עיגול סביב מרכזו. דקור חור בקצה הקהה של הביצה באמצעות מחט בכיול 19-gauge, ולאחר מכן בצע חור שני ליד העיגול שסומן, בקצה החד של הביצה.השתמשו במחט בכי মাপ 19 כדי להסיר חתיכה קטנה מהקליפה החיצונית של הביצה, ובעזרת פינצטה, הסירו חתיכה קטנה מקרום הביצה הפנימי. לאחר מכן, החדירו מחט בכי মাপ 19 המחוברת למזרק של 3 מיליליטר דרך החור שבקצה הקהה של הביצה, ושאבו 1.5 עד 2.5 מיליליטר של אלבומין. כסו את החור שבקצה הקהה של הביצה בחתיכת סרט דביק בגודל 1 סנטימטר על 1 סנטימטר, ולאחר מכן כסו את המעגל ששורטט ואת החור השני בחתיכת סרט דביק בגודל 2.5 סנטימטר על 4 סנטימטר.בעזרת מספריים מעוקלים עם קצה חיתוך של 2.5 סנטימטרים, ובשמירה עליהם במקביל לקליפת הביצה, גזרו חלון בתוך העיגול המסומן. כדי להזריק את הפלסמיד, הפעילו את ה-picospritzer וכוון את הגדרות המכשיר להפעלת לחץ של 18 PSI למשך חמישה מיקרו-שניות, לאחר מכן הפעילו את מיכל האוויר ואת המנורה של מיקרוסקופ הדיסקציה. לאחר מכן, הכינו 30 מיליליטר של תמיסת מלאי של India Ink שנרכש מסחרית ב-PBS סטרילי.שאבו את תמיסת הדיו הסינית (India Ink) למזרק של מיליליטר אחד, לאחר מכן חברו מחט בכיליבר 27 והסירו כל בועות אוויר שמופיעות במזרק. כדי להנחית את העובר, הכניסו את המחט בדיוק מתחת לקרום החלמון, במרחק של כשני עד שלושה מילימטרים מהעובר, והזריקו כ-0.2 מיליליטר של דיו סינית. לאחר מכן, העבירו את הביצה עם החלון למחזיק ביצים, הממוקם תחת מיקרוסקופ דיסקציה, ועברו להגדלה המקסימלית כדי להשיג את התצפית הטובה ביותר של אתר הזרקת הפלסמיד.הסיר באמצעות פינצטה את הקרומים המכסים את אזור ההזרקה. אתר את ה-otocysts והשתמש בהם כנקודות ייחוס לזיהוי ה-rhombomeres חמש ושש, הממוקמים בקרבתם, מהם נוצרים ה-nucleus magnocellularis וה-nucleus laminaris. בעזרת מיקרו-מניפולטור, מקם את הפיפטה המכילה DNA בתוך הצינור העצבי (neural tube) שמעל אזור ה-R5-R6, בין ה-otocysts.הזריקו את ה-DNA אל תוך צינור העצבים באמצעות ה-picospritzer. כדי להתחיל את תהליך האלקטרופורציה, הפעילו את ממריץ המתח, לאחר מכן חברו מסנן מזרק של 0.22 micron למזרק של שלושה מיליליטר ממולא מראש ב-PBS, והוסיפו טיפה אחת עד שתי טיפות של PBS מסונן על העובר. לאחר מכן, העבירו אלקטרודה דו-קוטבית לעבר העובר באמצעות המיקרו-מניפולטור, ומקמו את האלקטרודה השלילית מעל אתר ההזרקה, תוך שמירה על האלקטרודה החיובית בצד של ה-R5-R6.בעזרת ממריץ המתח, הגש 20 פולסים של 50 volts למשך מילישנייה אחת במרווחי זמן של שנייה אחת. ניתן יהיה לראות בועות ליד קצה האלקטרודה. לאחר האלקטרופורציה, הוסף טיפה אחת של PBS על האזור החשוף, הסר בעדינות את האלקטרודה ונקה אותה בעזרת נייר ניגוב למעבדה ו-70% ethanol, ולאחר מכן כסה את החלון שמעל העובר בסרט הדבקה.לבסוף, רשמו את סוג הפלסמיד שהוזרק ואת תאריך ההדגירה המוטבע על קליפת הביצה, והניחו את הביצה באינקובטור כאשר החלון פונה כלפי מעלה. הדגירו את הביצים בטמפרטורה של 38 degrees Celsius עם 50% humidity, עד להגעה לשלב ההתפתחותי הרצוי. 24 שעות לאחר האלקטרופורציה, הוציאו את הביצה מהאינקובטור, פתחו את החלון, ובאמצעות מיקרוסקופ סטריאו, ודאו את המיקום הנכון של הזרקת הפלסמיד המיועד.אם נעשה שימוש בווקטורים מסוג tet-on, יש להעביר בפיפט 50 microliters של Doxycycline אל הקרום הכוריואלנטואידי, לסגור את החלון ולהחזיר את הביצה לדגירה. מוצגות כאן תמונות של פרוסה מגזע המוח שהוכנה מעובר של תרנגולת ביום העובר ה-12, אשר צולמו תחת תאורת ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (differential interference contrast) ותאורת פלואורסצנציה. ניתן לזהות את ה-nucleus magnocellularis ואת ה-nucleus laminaris בתוך פרוסת גזע המוח.תחת הארה פלואורסצנטית, שני המבנים חושפים ביטוי של חלבון פלואורסצנטי צהוב, מה שמאשר ביטוי מרחבי יעיל של הגנים שעברו אלקטרופורציה. ניתן להבחין בביטוי של הגן שעבר אלקטרופורציה גם בפרוסה של גזע המוח הכוללת את ה-nucleus magnocellularis שהתקבלה מעובר של תרנגול ביום 18 להריון. בהגדלה של 80 פעם, גופי התאים האדנדריטיים הקלאסיים נראים תחת הארה של ניגודיות התאבכות דיפרנציאלית (differential interference contrast).גופי תאים ללא דנדריטים חושפים ביטוי של חלבון פלואורסצנטי צהוב, המדגים פעם נוספת כי אלקטרופורציה בתוך הביצה (in ovo electroporation) יכולה להשרות ביטוי גנים באזורים ספציפיים של גזע המוח השמיעתי לצורך מחקרים על התפתחות נוירונים שמיעתיים. לאחר רכישת המיומנות, ובמידה שהיא מבוצעת כהלכה, ניתן לבצע טכניקה זו בשלוש עד שעתיים עבור כ-12 ביצים חיוניות. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות נוספות כגון בדיקות ביוכימיות, פרמקולוגיות ובדיקות תפקודיות in vitro-in vivo, על מנת לענות על שאלות נוספות לגבי האופן שבו פנוטיפים של ביטוי גנים מווסתים את ההתפתחות התקינה של גזע המוח השמיעתי.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לשלוט מרחבית וזמנית בביטוי גנים בגזע השמיעתי של המוח בבית הטיט של עוף. אלקטרופורציה in ovo מאפשרת שליטה גנטית על התמחותים אנטומיים ופיזיולוגיים, וכן על תקופות זמן מוגדרות היטב במהלך ההתפתחות של גזע השמיעתי במוח.

in-ovo-electroporation-in-the-chicken-auditory-brainstem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

צ'יק ב electroporation אובו היא טכניקה המאפשרת מניפולציה גנטית של העובר העופות. יישומים נפוצים של טכניקה זו כוללות אנליזה פונקציונלית של גנים המשוערת אלמנטים משפר. וידאו זה מדגים electroporation neural tube אצל ה"ה 10 עוברי אפרוח. טכניקת הזרקת וטיפול נאות ביצה הם דנו.

ב Electroporations אובו של HH 10 עוברים שלב עוף

וידאו זה מדגים כיצד לדמיין מסלולי axonal של קבוצות מוגדרות גנטית של נוירונים בחוט השדרה ניצול חומוס...

פענוח מסלולים axonal של קבוצות מוגדרות גנטית של נוירונים התחתית צ&#39;יק עצבית ניצול ב אובו Electroporation

גזע המוח השמיעתית עוף מורכבת גרעינים אחראי לעיבוד צליל binaural. הכנה אחד פרוסה העטרה שומרת את כל המעגלים, בעוד גישה תרבותית מספק הכנה מיוחדת כדי לחקור את התפתחות מבנה ותפקוד עצבי השמיעה ברמה המולקולרית, התאית הרשת.

הכנה והתרבות של שמיעתית פרוסות עוף גזע המוח

המטרה הכללית של סרט זה היא להראות כיצד לבצע הזרקת רשתית...

ב electroporation לג&#39;ימי ברשתית צ&#39;יק עובריים

כדי להעריך את תפקוד רגולציה של גנים במהלך ההתפתחות של נוירונים המוח התיכון דופאמין, אנו מתארים שיטה...

ב electroporation לג&#39;ימי של המוח התיכון צ&#39;יק לחקר תפקוד הגן בהתפתחות Neuron דופאמין

איבר השמיעה מתווך את השמיעה. כאן אנו מציגים שיטת מיקרו-אלקטרופורציה שונה בביצית המותאמת לחקר התפשטות והתמיינות של תאי אב שמיעתיים באיבר השמיעה המתפתח.

העברת גנים לתוך האיברים השמיעתיים עוף ידי<em&gt; ב אובו</em&gt; מיקרו electroporation

כאן אנו מציגים פרוטוקול להשגת פרוסות גזע מוח שמיעתיות שאינן קורונליות של עובר העוף לחקר תכונות טונוטופיות ומסלולים התפתחותיים בתוך פרוסת גזע מוח אחת. פרוסות אלה כוללות מקטעים סגיטליים, אופקיים ואופקיים/רוחביים המקיפים אזורים טונוטופיים גדולים יותר בתוך מישור פרוסה בודד שהמקטעים הקורונליים המסורתיים.

חיתוך גזע המוח השמיעתי של העוף העוברי להערכת שיפועים טונוטופיים ומיקרו-מעגלים

השתמשנו בטכניקות סטנדרטיות של תגובה לגזע מוחי שמיעתי (ABR) ויישמנו אותן על תרנגולות בוקעות, מודל עופות מקדים לתפקוד שמיעתי. הפרוטוקול מתווה בפירוט את הכנת בעלי החיים ואת טכניקות רכישת ABR, עם שלבים שיכולים להיות מתורגמים למודלים אחרים של עופות או מכרסמים.

הערכה של תגובת גזע המוח השמיעתי באבקועים עופות

הגוזל הוא אורגניזם מודל חסכוני, נגיש וזמין באופן נרחב למגוון מחקרים. כאן מפורטת סדרה של פרוטוקולים להבנת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס ההתפתחות וההתחדשות של האוזן הפנימית של העופות.

בשיטות אובו ואקס אובו לחקר התפתחות האוזן הפנימית של העופות

תוך שימוש באלקטרופורציה של ovo , פיתחנו שיטה לטרנספציה סלקטיבית של האוזן הפנימית השמיעתית וגרעין השבלול בעוברי עוף כדי להשיג פגיעה ספציפית לקבוצת התאים של חלבון פיגור שכלי X שביר במהלך תקופות בדידות של הרכבת מעגלים.

ניתוח תפקוד אוטונומי של תאים של חלבון פיגור שכלי X שביר במעגל שמיעתי על ידי אלקטרופורציה של In Ovo

למדו לשלוט בביטוי גנים במוח השמיעה של עוף באמצעות אלקטרופורציה in ovo. שיטה זו מאפשרת חקר התפתחות נוירונים שמיעתיים והבנת הפרעות שמיעה קשורות.

ב Electrooration Ovo ב המוח עוף שמיעה

גלה סרטונים נוספים