גיליון מבוסס אור מיקרוסקופ פלואורסצנטי של חיים או קבוע מוכתמת Tribolium castaneum עובר

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לצפות בהתפתחות של עוברי Tribolium castaneum באופן לא פולשני לאורך תקופות זמן ארוכות מאוד. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מבוססת יריעות אור עוזרת לענות על שאלות הקשורות למורפוגנזה באורגניזם מודל החרקים המתהווה Tribolium castaneum המתייחס לדפוסי נדידת התאים והתפשטותם מהבלסטודרם המוקדם ועד לתחילת תנועת השרירים. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהגורמים הקריטיים כמו פוטו-הלבנה ופוטוטוקסיות נשמרים למינימום גם כאשר העוברים נצפים במשך מספר ימים.

כדי להרכיב עובר לתא הדגימה באמצעות עמוד אגרוז, מלאו תחילה מזרק של מילימטר אחד במים מזוקקים והשתמשו בצינור גומי קטן כדי לחבר את המזרק לנימים מזכוכית. מלאו את הנימים באמצע הדרך במים מזוקקים, ואז השתמשו במברשת צבע כדי להעביר עובר לצד הפנימי של פתח נימי הזכוכית, והדביקו את הנימים לתוך האגרוז הנוזלי, תוך שהם מושכים לאט כמה מיקרוליטרים של האגרוז יחד עם העובר לתוך הנימים. כאשר העובר נמצא במקומו צריכים להיות כמה מיקרוליטרים של אגרוז מעל ומתחת לעובר.

כאשר האגרוז התמצק, קצר את הנימים לאורך של כחמישה מילימטרים. יש למלא את השבר הנותר לחלוטין באגרוז ולמצוא את העובר ברבעון השני. לאחר מכן הכנס את גליל הפלדה עם הסיכה לתא הדגימה, והדביק את שבר הנימים על גבי הסיכה, עמוד האגרוז צריך לבלוט כמה מילימטרים מאזור שבר הנימים המכיל את העובר.

כדי להרכיב את העובר לתא הדגימה באמצעות חצי כדור אגרוז יש לשאוב תחילה 200 מיקרוליטר של אגרוז נוזלי למזרק של מילימטר אחד, ולהשתמש במזרק כדי למלא את צינור הפלדה בתא הדגימה באגרוז מראש הצינור עד שנוצר חצי כדור בפתח התחתון. כאשר האגרוז התמצק, הרימו עובר עם קצה מברשת צבע וסדרו מחדש את העובר כך שהקצה הקדמי יהיה נגיש. טבלו את חצי הכדור של אגרוז באגרוז נוזלי כדי לכסות את חצי הכדור בסרט דק והניחו את העובר עם הקצה הקדמי שלו זקוף על הקוטב של חצי הכדור של אגרוז.

סובב את צינור הפלדה והשתמש במברשת כדי לתקן את מיקום העובר לפי הצורך. באופן אידיאלי פחות ממחצית משטח העובר צריך להיות מכוסה באגרוז והצדדים צריכים להיות תלולים ככל האפשר. יותר מדי אגרוז על פני העובר מוביל להתכווצות מכנית ולהפחתת חילופי הגזים והיונים, מה שמשפיע באופן דרמטי על שיעור ההישרדות של העובר.

לאחר מכן הכנס לאט את צינור הפלדה לתא הדגימה. כדי להרכיב את העובר לתא הדגימה באמצעות מחזיק קורי עכביש, בחר תחילה עובר עם מברשת הצבע והנח את מברשת הצבע בצד. לאחר מכן, מכסים את החור המחורר של מחזיק קורי העכביש בחמישה עד שמונה מיקרוליטרים של אגרוז נוזלי, ואז מסירים את רוב האגרוז עד שנשאר רק סרט אגרוז דק.

הניחו את העובר על סרט האגרוז והתאימו את מיקומו בזהירות, העבירו את העובר למרכז ציר ה-x של החור המחורר ויישרו את הציר האחורי הקדמי המוארך שלו עם הציר המוארך של החור המחורר. הקפד להניח את העובר על סרט האגרוז תוך 10-15 שניות לאחר יישומו, כלומר בזמן שהאגרוז עדיין נוזלי, אחרת הוא לא יתחבר כראוי. לאחר מכן הכנס לאט את מחזיק קורי העכביש לתא הדגימה, ממקם את המחזיק כך שלא יפריע לאור העירור והפליטה.

עבור בדיקות הדמיה חיות, הגדר תחילה את דולג הזמן, ולאחר מכן במצב אור השידור מקם את העובר לאורך ציר X ו-Y למרכז שדה הראייה מבלי לחשוף את העובר ללייזר. סובב את העובר 360 מעלות בשלבים של 90 מעלות כדי לבחון את הרקמה לאיתור נזק שעלול היה להתרחש במהלך תהליך ההרכבה. במצב התפרחת, הגדירו את ה-Z-Stack לכל כיוון, הוסיפו חיץ מרחבי של 25 עד 50 מיקרומטר לפני ומאחורי העובר והגדירו את מרווח ה-Z.

להדמיה לטווח ארוך ודא שתא הדגימה מלא במאגר הדמיה מספיק ומכסה את פתח תא הדגימה. לאחר מכן התחל בתהליך ההדמיה, תוך מעקב אחר הרכישה הנכונה לאורך כל הכיוונים בכל הערוצים עבור כל העוברים. בתום תקופת ההדמיה, הסר את מחזיק הדגימה מתא הדגימה והעביר את העובר למגלשת אובייקט.

אם נעשה שימוש בעמוד אגרוז השתמש בלהב חד כדי לחלץ את העוברים מהאגרוז שמסביב. אם נעשה שימוש בחצי כדור אגרוז, העבירו את חצי הכדור עם צד שטוח לשקופית האובייקט. לשיטת מחזיק קורי העכביש השתמש במברשת צבע כדי לפרוק בעדינות את העובר מסרט האגרוז.

לאחר מכן דגרו את החלקת החפץ העמוס בעובר בצלחת זכוכית קטנה באווירת לחות רוויה בתנאים סטנדרטיים עד שהזחלים בוקעים. כדי לעבד את הנתונים של העובר הנצפה, פתח את הקבצים המעניינים בתוכנת ניתוח ההדמיה המתאימה וסובב את ה-Z-Stacks כדי ליישר את הציר האחורי הקדמי של העובר עם ציר ה-Y לפי הצורך. חתוך את ה-Z-Stacks לאורך ציר X ו-Y כך שיישאר רק רקע מינימלי ולאחר מכן חשב את ההקרנה המקסימלית Z עבור כל Z-Stack.

לאחר מכן, בהתאם לקו הטרנסגני ולשיטות ההדמיה, בצע את התאמות העוצמה הדינמיות המתאימות של ערימות הזמן כדי לתקן כל פוטו-הלבנה או פלורה לתנודות ביטוי לפי הצורך. באמצעות קו טרנסגני המבטא חלבון היתוך Histone 2B M-Emerald בשליטת מקדם אלפא-טובולין אחד נרשמו 66 שעות של התפתחות עוברית בטמפרטורת החדר מנסיגת פס הנבט לסגירת הגב. ניתן להשתמש בקו מלכודת משפר זה כדי לדמיין אשכולות עצביים בתוך נספחי הראש ואת הדינמיקה של נדידת שחמת במהלך סגירת הגב.

הדמיה של קו טרנסגני דומה הנושא את אותו גן טרנס-גן אך במיקום גנומי שונה, החלקים האופטיים של המעבר מקיבה להתארכות פס הנבט מראים את סידור התאים הפנימי של רצועת הנבט המתהווה. באמצעות הקו הטרנסגני גליה-כחול, רכישת Z-Stacks לאורך כיוונים מרובים באמצעות סיבוב דגימה מאפשרת התבוננות בארגון מחדש של תאי גליה לאורך ומסביב לחוט העצב הגחוני, כמו גם בדינמיקת ההתפשטות שלהם בצד הגבי של אונות הראש באותו עובר. ניתן להשתמש בצבעי פלורסנט קטנים גם לתיוג ספציפי של מבנים בין-תאיים כדי להדגיש מאפיינים עובריים מסוימים כגון שחמת השחמת, תאי שחמת הגחון האחוריים, או רקמת רצועת נבט מי שפיר תלת-שכבתית המופיעה במהלך סגירת חלון הסרוזה.

צביעת צבע פלואורסצנטי בצבע כפול מאפשרת הדמיה נוספת של שני מבנים בין-תאיים באותו עובר. למשל שלד הציטו של האקטין והמעטפת הגרעינית. לאחר סיום ההקלטה, חשוב שבקרת האיכות של הניסוי תחזיר את העוברים ותגדל אותם לבוגרים בריאים ופוריים.

ניתן לשלב הליך זה עם טכניקות אחרות כגון הבדל RNA הורי כדי לנתח פנוטיפים שהופלו.