רתימת DNA- מופעלות בצד האוכלוסייה פנוטיפ לזהות ולטהר תאי גזע סרטניים מ דוגמאות ביולוגיות
10 במאי 2017
שיטות המאפשרות אפיון ובידוד של אוכלוסיות תאי גזע מדגימות ביולוגיות הן קריטיות לקידום טיפולים מוכווני תאי גזע בסרטן ומעבר לו. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לבידוד תאי גזע סרטניים באמצעות פנוטיפ האוכלוסייה בצד מופעלות בצד.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לזהות אוכלוסיות משוערות של תאי גזע סרטניים בדגימות ביולוגיות, בהתבסס על יכולת דחיית צבע של תאי אוכלוסיית הצד (side population cells). שיטה זו נותנת מענה לשאלה מרכזית במחקר תאי גזע סרטניים בנוגע לאמצעים מהימנים לזיהוי וניקוי של תאי גזע סרטניים מדגימות ביולוגיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא רותמת סממנים תפקודיים ובכך מספקת רזולוציה טובה יותר.
בנוסף, הביטוי של נשאי תרופות ABC אלו שמור מאוד בקרב תאי גזע סרטניים, ולכן ניתן להשתמש בטכניקה זו עבור ישויות סרטניות שונות רבות. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות עד לגילוי טיפולים אנטי-תאי גזע סרטני, כיוון שהיא מקלה על ניתוחים המשכיים כגון פרופיל ביטוי גנים ותיקוף מטרות בתאי סרטן מטוהרים מאוד. לפיכך, שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי מאפייניהם של תאי גזע סרטניים.
ניתן להשתמש בשיטה זו גם כדי לאפיין מערכות הכוללות אוכלוסיות המבטאות נשאי תרופות מסוג ABC, כגון מחית העצם. את הפרוצדורה תדגים אליזבת הופלנר, טכנאית מהמעבדה שלי. לתחילת העבודה, יש לגדל את שורת תאי הסרטן האנושיים הרצויה ב-37 °C ב-10 עד 30 milliliters של מצע RPMI 1640 המועשר ב-10% FBS, 2 millimeter L-glutamine ואנטיביוטיקה.
כאשר התאים מגיעים למסף של כ-70 עד 90% confluence, הסירו את המצע והוסיפו שני מיליליטר של 0.05% trypsin-EDTA כדי לנתק את התאים מפני השטח של צלחת התרבית. לאחר מכן, שטפו את התאים עם 10 מיליליטר של מצע תרבית, העבירו את התרחיף למבחנה נקייה של 15 מיליליטר, וסובבו אותו ב-250 ×g בטמפרטורה של 4 °C למשך חמש דקות. לאחר שהתאים שקעו, השליכו את העלייה (supernatant) ותלו את המשקע במיליליטר אחד של מצע תרבית.
ערבבו מנה קטנה של תרחיף התאים עם תמיסת trypan blue וספרו את התאים באמצעות המוציטומטר. להכנת דגימות הבדיקה, השעו את התאים במצע גידול טרי כדי לקבל תרחיף תאים בריכוז של 10⁶ תאים ל-mL. לאחר התאמת צפיפות התאים, העבירו 3 mL מהדגימה למבחנה בעלת תחתית עגולה בנפח 15 mL המסומנת כדגימת בדיקה (test).
לאחר מכן, הוסיפו 10 micromolar של צבע סגול לדגימה וערבבו בעדינות את התוחלת באמצעות vortex. לאחר מכן, הכינו בקרות עיכוב על ידי העברה של 500 microliters של התוחלת התائية המכילה את הצבע לשתי מבחנות ציטומטריית זרימה המסומנות כבקרות. הוסיפו 50 micromolar של Verapamil למבחנה הראשונה.
הוסיפו 20 µM של Fumitremorgin C למבחנה השנייה. ערבבו את התמיסות באמצעות פיפטור עדין. סגרו את כל המבחנות עם פקקים והדגירו אותן בטמפרטורה של 37 °C בחושך למשך 90 דקות.
נער את הדגימות בעדינות מדי 15 דקות. עם השלמת הצביעה, שטוף את בקרות העיכוב ב-3 עד 4 מיליליטר של PBS קר במקרר. הכן אליקוטות של דגימת הבדיקה לצביעה משולבת (costaining) עוקבת עם נוגדנים.
שטפו גם מנות אלו וסננו את כל הדגימות דרך מסננים עם נקביים של 70 micron כדי להסיר צברים פוטנציאליים של תאים. לאחר מכן, סבבו את התליות בצנטריפוגה ב-250 ×g בטמפרטורה של 4 °C למשך חמש דקות. לאחר השהיה מחדש של המשקע שהתקבל ב-100 µL של PBS, שמרו את התאים על קרח במיגון מאור.
בשלב הבא, הוסיפו פאנל מתאים של נוגדנים מצומדים לפלואורוכרום לתאים שנצבעו מראש בצבע סגול. ערבבו את התוךים במכשיר וורטקס והדגירו אותם בטמפרטורה של 4°C בחושך למשך 20 עד 30 דקות. לאחר ההדגרה, שטפו את התאים ב-3 עד 4 מיליליטר של PBS קר מאוד, וסננו את הדגימה במידת הצורך.
לאחר מכן, סבבו בצנטריפוגה ב-250 ×g בטמפרטורה של 4 °C למשך חמש דקות. השליכו את הנוזל העליון (supernatant) והשעיקו מחדש את התאים שהשקיעו ב-100 µL של PBS. לבסוף, הוסיפו 7-AAD לתאים שצבעו מראש בצבע סגול.
דגרו את הדגימות במשך 5 עד 10 דקות בחושך. כדי לנתח את התאים באמצעות ציטומטר הזרימה, הגדירו שער (gate) לאוכלוסיית תאים מתאימה על גרף פיזור של FSC SSC. לאחר מכן, באמצעות אותות FSC שונים, הסירו מהאוכלוסייה שנבחרה את כל צבירי התאים.
הסר תאים המראים צביעה חיובית ל-7-AAD כדי לקבל את אוכלוסיית התאים החיוניים. כדי ליצור תרשים פיזור (dot plot) עבור פליטת הצבע הכחול והאדום, הצג את הערוץ הפלואורסצנטי הכחול בציר ה-y ואת הערוץ הפלואורסצנטי האדום בציר ה-x. העבר את שני הערוצים למצב ליניארי וכייל את מתח הגלאי בהתאם, כך שאוכלוסיית הצד (side population) תמוקם בחלק השמאלי התחתון של התרשים.
לאחר מכן, הגדירו שער (gate) עבור אוכלוסיית הצד (side population). הפסיקו את הרכישה. בשלב הבא, טענו את בקרות העיכוב ורכשו את הנתונים.
לבסוף, צרו תרשים פיזור (dot plot) המציג את הפלואורסצנציה האדומה של צבע סגול בציר ה-x וערוץ פלואורסצנציה מתאים בציר ה-y, המוצגים במצב לוגריתמי. טענו את הדגימה, לאחר מכן כווננו את מתחי הגלאי בהתאם וזהו את חלקם של תאי אוכלוסיית הצד (side population) המבטאים את המרקר העלי שבדקתם. לאחר מכן, רשמו את הנתונים.
הוצגו כאן תוצאות מייצגות של ניתוח אוכלוסיית צד (side population) שבוצע בתאי סרטן שחלה אנושיים. אוכלוסיית הצד, שהובחנה באמצעות ניתוח פליטה כחולה ואדומה-סגולה, זוהתה ברביע השמאלי התחתון של תרשים הפיזור והיוותה 0.70% מכלל האוכלוסייה שנותחה. שימוש מאוחר יותר במעכבי שאיבה (efflux inhibitors) הוביל להיעלמות אות הפלואורסצנציה שנצפה בתאים שזוהו קודם לכן, דבר המאשר את פנוטיפ אוכלוסיית הצד שלהם.
לבסוף, תאי השחלה אנושיים אופיינו גם מבחינת ביטוי של ABCG2. צביעה חיובית ל-ABCG2 נצפתה ב-0.67% מהתאים, התואמת לאוכלוסיית הצד (side population) שזוהתה. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע הליך זה בערך כשעתיים עד שלוש שעות, אם הוא מבוצע כהלכה.
בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי הפנוטיפ של אוכלוסיית הצד (side population) תלוי באופן מוחלט ביחס אופטימלי בין ריכוז הצבע לצפיפות התאים. לכן, מומלץ מאוד לבצע אופטימיזציה של שני המשתנים הללו לפני הניסוי. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון פרופיל ביטוי גנים כדי לאפיין עוד יותר את תאי אוכלוסיית הצד, ובכך לזהות מטרות חדשות הספציפיות לתאי גזע סרטניים לצורך פיתוח תרופות בעתיד.
לאחר פיתחוה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הביולוגיה של תאי גזע לבחון את המאפיינים של תאי גזע רקמתיים ותאי גזע סרטניים, הן בעכברים והן בבני אדם. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן ביצוע הפרדה של אוכלוסייה צדדית (SP) המופעלת על ידי צבע סגול, וכיצד לזהות תאי גזע סרטניים משוערים בדגימות ביולוגיות במעבדה שלכם. זכרו כי עבודה עם דגימות ביולוגיות עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט באמצעי זהירות כגון שימוש בציוד מגן אישי (PPE) ובמטעי בטיחות ביולוגית בעת ביצוע פרוצדורה זו.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מפרט שיטה פונקציונלית המבוססת על ציטומטריה זרימה לזיהוי ובידוד של אוכלוסיות תאי גזע סרטניים (CSC) מדגימות ביולוגיות הטרוגניות. הגישה מנצלת את יכולת פליטת הצבע של תאי אוכלוסיית צד (SP), המתווכת על ידי נשאי תרופות ממשפחת ABC, ובכך מספקת אמצעי חסון להבחנה של תאי CSC לצורך אנליזות המשך וגילוי מטרות טיפוליות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של הסרטן
- חקר תאי גזע
- ציטומטריית זרימה
רקע
- תאי גזע סרטניים מניעים את צמיחת הגומה ואת חזרתה, מה שהופך את זיהוים ומיגורם לסדר עדיפות טיפולי.
- זיהוי CSC מסורתי נשען על סממנים פנישאיים (למשל CD44, CD133) ופעילות אנזימטית (למשל aldehyde dehydrogenase).
- בדיקות תפקודיות המבוססות על דחיקה של צבע על ידי נשאי ABC מציעות גישה חלופית שאינה תלויה בפנוטיפ.
- בדיקת האוכלוסייה הצדדית (SP) מזהה תאים בעלי יכולת השהייה גבוהה, המהווה סימן היכר של תאים דמויי גזע.
מטרת המחקר
- לספק פרוטוקול מפורט לזיהוי ובידוד של תאי גזע סרטניים (CSCs) באמצעות בדיקת SP המבוססת על צבע סגול, התואמת למכשירי סייטומטריה של זרימה סטנדרטיים.
- להדגים את התועלת של שיטה זו עבור אנליזות המשך ותיקוף של מטרות טיפוליות.
- להדגיש את היתרונות של זיהוי CSCs פונקציונלי על פני זיהוי פנוטיפי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- גידול של קווי תאי סרטן אנושיים בתנאים סטנדרטיים.
- צביעת תאים בצבע סגול להערכת יכולת פליטת הצבע (dye extrusion).
- שימוש במעכבי ABC transporter (Verapamil, Fumitremorgin C) כביקורות לאישור זהות ה-SP.
- ניתוח בציטומטריה זורמת לסינון (gating) וכמימות של תאי SP, עם צביעה נוספת בנוגדי גוף והערכת חיוניות (7-AAD).
תוצאות עיקריות
- תאי SP זוהו בהצלחה בדגימות של תאי סרטן שחלה אנושיים, והם מהווים כ-0.7% מהאוכלוסייה.
- טיפול במעכב השפרה (Efflux inhibitor) ביטל את אות ה-SP, ובכך אישר את הפנוטיפ התפקודי.
- ביטוי של ABCG2 נמצא במתאם עם פракציית ה-SP, דבר התומך בספציפיות של הבדיקה.
- ניתן להשלים את הפרוטוקול בתוך 2–3 שעות, והוא ניתן להתאמה לסוגי סרטן ורקמות שונות.
מסקנות
- בדיקת SP מבוססת הצבע הסגול היא שיטה אמינה ובעלת יישום רחב לזיהוי ובידוד של CSCs.
- זיהוי פונקציונלי של CSCs מאפשר ניתוחים מדויקים יותר בשלבים הבאים, כולל פרופיל ביטוי גנים ותיקוף מטרות.
- טכניקה זו מסייעת בגילוי טיפולים חדשניים נגד CSCs ומקדמת את המחקר על תאי גזע בסרטן.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
זיהוי וניקוי מהימנים של תאי גזע סרטניים (CSCs) מהווים נקודת מפנה קריטית בגילוי תרופות לאונקולוגיה, המאפשרים הפחתת סיכונים מכניסטיים ותיקוף מטרות עבור טיפולים אנטי-CSC. בדיקת אוכלוסיית הצד (SP) המופעלת על ידי צבע DNA מנצלת פליטת צבע פונקציונלית כדי לבודד CSCs מדגימות הטרוגניות, ובכך תומכת בביטחון חיזוי בניתוחים המשכיים. יכולת זו משפרת את קבלת ההחלטות בנוגע לתיק הפיתוח על ידי אספקת שיטה חסונה, שאינה תלויה בפנוטיפ, להעשרה ואפיון של CSCs.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה תפקודית של אוכלוסיות CSC לצורך תיקוף מטרות מכניסטיות.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבחנה בין CSCs בהתבסס על פעילות משמרת של נשאי ABC.
- מסייע בביטחון חיזוי בזיהוי נקודות תורפה של CSC לצורך פיתוח טיפולי.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין אוכלוסיות CSC מטוהרות מאוד עבור בדיקות סטנדרטיות בהמשך ומסרוקי תרכובות.
- משפר את הדיוק וההסבירות של הבדיקה על ידי שימוש בסמנים תפקודיים ולא רק פנוטיפיים.
- מאפשר הערכה כמותית של פליטת צבע ועכבה של נשאים (transporters) לקבלת תוצאות בדיקה מהימנות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאים את בידוד ה-CSC לאסטרטגיות של ביומרקרים תרגומיים על ידי מתן אפשרות לאפיון ביטוי גנים של אוכלוסיות מטוהרות.
- מספק רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות תמיכה באפיון תפקודי של CSC בסוגי סרטן שונים.
- מפחית סיכונים בקבלת החלטות על קידום הפיתוח על ידי אישור מעורבות המטרה במערכות CSC הרלוונטיות למחלה.
שילוב בצינור עיבוד ובזרימת עבודה
שיטת בדיקת ה-SP זו משלבת בין שלב הגילוי המוקדם לזיהוי המולקולות המובילות (lead identification), ומספקת סבב עבודה ניתן לשימוש חוזר להעשרה של CSC ולניתוחים מולקולריים המשכיים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים ביולוגיים על ידי בידוד של CSCs המוגדרים באופן תפקודי.
- סריקה: מספקת אוכלוסיות CSC חיות ומוכנות לבדיקה להערכה של תרכובות ובדיקת מעכבים.
- אנליטיקה: מייצרת קריאות כמותיות של פליטת צבע ומעכבי נשאים לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מאפשרת מחקרי ביטוי גנים ובדיקת סמנים ביולוגיים ב-CSCs מטוהרים, ובכך תומכת ברצף פרה-קליני.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתנת להתאמה לסוגי סרטן ורקמות שונות, ובכך מבססת יכולת סטנדרטית למחקר CSC.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות של CSC.
- ערך תפעולי: מנרמל את בידוד ה-CSC באמצעות פרוטוקולים ניתנים לשחזור ובקנה מידה משתנה, התואמים לפלטפורמות של ציטומטריה זרימה.
- ערך אסטרטגי: מספק מידע לקבלת החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) ומשפר את יעילות ההון על ידי אפשור אפיון רהוט של CSC.
- השפעה על פורטפניו: תומך בתעדוף מותאם סיכון של תוכניות טיפוליות אנטי-CSC.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בציטומטריה של זרימה ובבדיקות מבוססות צבעים פונקציונליים.
- נחוש גישה לציטומטרים של זרימה בעלי יכולת לייזר סגול ותוכנה אנליטית מתאימה.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של ריכוז הצבע וצפיפות התאים לצורך הדירות (reproducibility).
- ניתן להתאמה לקווי תאי סרטן ורקמות שונות המבטאים נשאי ABC.
- תלוי בתנאי בדיקה אופטימליים כדי להבטיח זיהוי מדויק של פנוטיפ SP.
