רתימת DNA- מופעלות בצד האוכלוסייה פנוטיפ לזהות ולטהר תאי גזע סרטניים מ דוגמאות ביולוגיות

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות אוכלוסיות תאי גזע סרטניים משוערים בדגימות ביולוגיות על סמך יכולת שחול הצבע של תאי אוכלוסיית הצד. שיטה זו מתייחסת לשאלת מפתח בחקר תאי גזע סרטניים לגבי אמצעים אמינים לגילוי וטיהור של תאי גזע סרטניים מדגימות ביולוגיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא פורסת סמנים פונקציונליים ולכן מספקת רזולוציה טובה יותר.

בנוסף, הביטוי של נשאי תרופות ABC אלה נשמר מאוד בקרב תאי גזע סרטניים ולכן אנו יכולים להשתמש בטכניקה זו עבור ישויות סרטן רבות ושונות. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות לקראת גילוי טיפולים אנטי-סרטניים בתאי גזע מכיוון שהיא מאפשרת ניתוח במורד הזרם כגון פרופיל ביטוי גנים ואימות מטרה בתאי סרטן מטוהרים מאוד. כך ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי המאפיינים של תאי גזע סרטניים.

אנו יכולים גם להשתמש בשיטה זו כדי לאפיין כמערכת המורכבת ממוביל תרופות ABC המבטא אוכלוסיות כמו מח העצם. מי שתדגים את ההליך תהיה אליזבת הופלנר, טכנאית מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, תרבית את קו תאי הסרטן האנושי הרצוי ב-37 מעלות צלזיוס ב-10 עד 30 מיליליטר של מדיום RPMI 1640 בתוספת 10% FBS, שני מילימטר L-גלוטמין ואנטיביוטיקה.

כאשר התאים מגיעים לכ-70 עד 90% מפגש, הסר את המדיום והוסף שני מיליליטר של 0.05% טריפסין-EDTA כדי לנתק את התאים משטח צלחת התרבות. לאחר מכן, שטפו את התאים עם 10 מיליליטר של מדיום תרבית, העבירו את המתלה לצינור נקי של 15 מיליליטר וסובבו אותו ב -250 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר שהתאים גלולים, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מדיום תרבית.

מערבבים מנה קטנה של תרחיף התאים עם תמיסה כחולה טריפן וסופרים את התאים באמצעות המוציטומטר. להכנת דגימות בדיקה, השעו את התאים במדיום תרבית טרי כדי לקבל תרחיף תאים חד פעמי של עשרה עד שישה תאים למיליליטר. לאחר התאמת צפיפות התאים, העבירו שלושה מיליליטר מהדגימה לצינור תחתון עגול של 15 מיליליטר המסומן כבדיקה.

לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוטולר של צבע סגול לדגימה ומערבל בעדינות את המתלה. לאחר מכן, הכינו בקרות עיכוב על ידי העברת 500 מיקרוליטר של הצבע המכיל תרחיף תאים לשני צינורות ציטומטריית זרימה המסומנים כבקרה. הוסף 50 מיקרומולר של Verapamil לראשון.

ו -20 מיקרומולר של פומיטרמורגין C לצינור השני. וערבבו את התמיסות על ידי פיפטינג עדין. מכסים את כל הצינורות בכובעים ודוגרים אותם בחום של 37 מעלות צלזיוס בחושך למשך 90 דקות.

מערבבים בעדינות את הדגימות כל 15 דקות. לאחר השלמת הצביעה, שטפו את בקרות העיכוב בשלושה עד ארבעה מיליליטר PBS קר כקרח. והכינו ציטוטים של דגימת הבדיקה לצביעה לאחר מכן עם נוגדנים.

שטפו גם את הכמות הזו וסננו את כל הדגימות דרך מסננות חתוכות של 70 מיקרון כדי להסיר אגרגטים פוטנציאליים של תאים. ואז צנטריפוגה את המתלים ב -250 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר השעיית הכדור שהתקבל ב-100 מיקרוליטר PBS, שמור על התאים על הקרח מוגנים מפני אור.

לאחר מכן, הוסף פאנל מתאים של נוגדנים מצומדים פלורוכרום לתאים הצבועים מראש בצבע סגול. מערבלים את המתלים ודוגרים אותם בארבע מעלות צלזיוס בחושך למשך 20 עד 30 דקות. לאחר הדגירה יש לשטוף את התאים בשלושה עד ארבעה מיליליטר PBS קר כקרח, לסנן את הדגימה אם רוצים.

ואז צנטריפוגה ב-250 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים הגלולים ב-100 מיקרוליטר PBS. לבסוף, הוסף 7-AAD לתאים הצבועים מראש בצבע סגול.

ודגרו על הדגימות במשך חמש עד 10 דקות בחושך. כדי לנתח את התאים באמצעות ציטומטר הזרימה, שער אוכלוסיית תאים מתאימה על תרשים נקודות FSC SSC. לאחר מכן, באמצעות אותות FSC שונים, אל תכלול מהאוכלוסייה שנבחרה את כל מצברי התאים.

אל תכלול תאים החושפים צביעה חיובית של 7-AAD כדי להשיג את אוכלוסיית התאים בני הקיימא. ליצירת תרשים נקודות לפליטת צבע כחול ואדום, הציגו את ערוץ הפלואורסצנט הכחול על ציר ה-y ואת הערוץ הפלואורסצנטי האדום על ציר ה-x. העבר את שני הערוצים למצב ליניארי והתאם את מתח הגלאי בהתאם כך שאוכלוסיית הצד ממוקמת בחלק השמאלי התחתון של העלילה.

לאחר מכן, שער את האוכלוסייה הצדדית. ולעצור את הרכישה. לאחר מכן, טען את בקרות העיכוב ורכוש את הנתונים.

לבסוף, צור תרשים נקודות המציג את הפריחה האדומה של צבע סגול על ציר ה-x ותעלת פריחה, מתאימה על ציר ה-y, המשורטטת במצב לוגריתמי. טען את הדגימה ולאחר מכן כוונן את מתחי הגלאי בהתאם וזהה את הפלג של תאי האוכלוסייה הצדדיים המבטאים את המשטח הנחקר. לאחר מכן, רשום את הנתונים.

מוצגות כאן תוצאות מייצגות של ניתוח אוכלוסיית הצד שבוצע בתאי סרטן שחלות אנושיים. אוכלוסיית הצד שהובחנה על ידי ניתוח פליטת כחול ואדום-סגול זוהתה ברבע התחתון השמאלי של תרשים הנקודות והיוותה 0.70% מכלל האוכלוסייה שנותחה. השימוש המאוחר יותר במעכבי פליטה הביא להיעלמות אות התפרחת שנצפה עבור התאים שזוהו קודם לכן המאשר את פנוטיפ אוכלוסיית הצד שלהם.

לבסוף, תאי השחלה האנושיים אופיינו גם במונחים של ביטוי ABCG2. צביעה חיובית ABCG2 נצפתה ב-0.67% מהתאים המתאימים לאוכלוסיית הצד שזוהתה. לאחר שליטה, ניתן לבצע הליך זה תוך כשעתיים-שלוש אם הוא מבוצע כראוי.

כאשר מנסים הליך זה, חשוב לזכור כי פנוטיפ אוכלוסיית הצד תלוי אך ורק ביחס אופטימלי של ריכוז צבע לצפיפות התאים. לכן מומלץ מאוד לחות של שני המשתנים לפני הניסוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו פרופיל ביטוי גנים על מנת לאפיין עוד יותר תאי אוכלוסיית צד ובכך לזהות מטרות ספציפיות לתאי גזע סרטניים חדשים לפיתוח תרופות עתידיות.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של תאי גזע לחקור את המאפיינים של תאי גזע רקמתיים ותאי גזע סרטניים, הן בעכברים והן בגברים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע SA של אוכלוסיית צד המופעלת על ידי צבע סגול וכיצד לזהות תאי גזע סרטניים משוערים בדגימות ביולוגיות במעבדה שלך. אל תשכח שעבודה עם דגימות ביולוגיות עלולה להיות מסוכנת ביותר וכי יש לנקוט באמצעי זהירות כגון שימוש ב-PPE וארונות בטיחות ביולוגיים בעת עבודה עם הליך זה.