Name: פרוטאין tRNA Agarose גל מבחני פיגור לניתוח של N 6 -Treonylcarbamoyladenosine TCDA פונקציה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: חקור אינטראקציות חלבון-RNA באמצעות מבחני עיכוב ג'ל אגרוז לניתוח קשרי tRNA עם חלבוני TcdA. שיטה זו מאפשרת זיהוי מהיר של קשרים ספציפיים בסיסי בביולוגיה של RNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

MCV הוא חבר של CIB Intramural תוכנית &quot;מולקולרית מכונות לחיים טובים יותר&quot; (MACBET). המחקר המוביל לתוצאות אלו קיבל מימון מהמוסד הספרדי של סאלוד קרלוס השלישי (PI12 / 01667 ל- MCV), ה- Ministerio de Economía y Competitividad (CTQ2015-66206-C2-2-R ו- SAF2015-72961-EXP ל- MCV ), הממשלה האזורית של מדריד (S2010 / BD-2316 ל MCV), ואת הנציבות האירופית (Framework Program 7 (FP7)) פרויקט ComplexINC (חוזה מס &#39;279039 כדי MCV). למממנים לא היה תפקיד בתכנון המחקר, איסוף הנתונים וניתוחם, ההחלטה לפרסם או הכנת כתב היד.

זהירות: עיין בכל הגיליונות הרלוונטיים של נתוני בטיחות החומרים (MSDS) לפני השימוש. כמה מן הכימיקלים המשמשים בפרוטוקול זה רעילים ומאכל. השתמש בשיטות המתאימות בעת ביצוע החילוץ של tRNA באמצעות פנול, כולל שימוש במכסה אדים ובציוד מגן אישי (משקפי מגן, כפפות, מעיל מעבדה, מכנסיים באורך מלא, נעלי אצבע סגורות וכו &#39; ). פרוטוקול זה משתמש שאינו רעיל כתם חומצה גרעין. השימוש בכתמים חלופיים עשוי לדרוש אמצעי זהירות נוספים וסילוק מיוחד של סוכן מכתים אם רעילים ו / או מסרטנים ( למשל , ethidium bromide). 1. הכנת ג&#39;ל Agarose <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול 2 גרם של agarose ולהוסיף אותו בקבוק זכוכית להכין 2% w / v agelose ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 מ&quot;ל של 1x tris-borate-ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) (TBE) פועל חיץ בקבוק המכיל agarose. ממיסים על ידי חימום במיקרוגל. במרווחים של 30 שניות, מערבולת את התוכן כדי לערבבגם לחזור על שלב זה עד agarose הוא מומס לחלוטין. אפשר פתרון agarose להתקרר עד כ 50-60 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלטת את הקצוות הפתוחים של מגש ג&#39;ל כדי ליצור עובש, במקום מסרק מתאים כדי ליצור את הבארות ולטיל את agarose מותכת לתוכו. הימנע היווצרות בועה ולתת לו לחזק בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מוצק, במקום מגש ג&#39;ל ביחידה אלקטרופורזה ולמלא אותו עם חיץ TBE עד הג &#39;ל מכוסה לחלוטין. </li></ol> 2. הכנת tRNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אקספרס tRNA (UUU) ב E. coli <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בבוקר, השתמש בבקבוקון של E. coli BL21 קפוא (DE3) שהפך עם וקטור הביטוי pET23d-EcUUU 2 (הנמל קידוד גנים E. coli tRNA (UUU)), כדי להקטין את מלח לוריא נמוך מלח (LB) צלחת בתוספת 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ampicillin. להפוך את הצלחת ומניחים אותו לתוך 37 ° C חממה עד מושבות להופיע (מאוחר אחר הצהרייםOon). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן אחד גדל היטב, מושבה אחת ב 5 מ&quot;ל LB בתוספת 100 מיקרוגרם / mL ampicillin ולגדול לילה בסל&quot;ד 220 ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, גלולה התאים (6,500 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C), להחליף בינוני עם 5 מ&quot;ל טרי LB בתוספת 100 מיקרוגרם / mL ampicillin ו resuspend. השתמש ההשעיה לחסן 200 מ&quot;ל LB בתוספת 100 מיקרוגרם / mL ampicillin. לגדול במשך 5 שעות ב 220 סל&quot;ד ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר צפיפות אופטית של התרבות ב 590 ננומטר (OD 590 ) הגיע 0.6 - 0.8, להוסיף 1 mM IPTG לתרבות כדי להפעיל את הביטוי של הגן tUNA (UUU). לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר התאים על ידי centrifuging את התרבות ב XG 6,500 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמוגה ומיצוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תא גלולה במאגר 5 תמוגה מ&quot;ל (0.3 M אצטט אצטט, 10 מ&quot;מ EDTA). מנקודה זו ואילך, מאגרים autoclaved בשימוש ולשמור את כל דגימות המכילות tRNA ב 4 ° C כדי למנוערנ&quot;א השפלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח 1 של פנול חומצה (pH 4.3) כדי גל גלולה resuspended במכסה המנוע קטר. מערבבים במשך 1 דקות על ידי היפוך lyse התאים צנטריפוגות ב XG 10,000 (10 דקות, 4 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את השלב מימית העליון המכיל את tRNA מסיסים (UUU) (וריכוזים קטנים יותר של בריכות tRNA אחרים) באמצעות פיפטה מקפיד לא לשאוב את השלב האורגני (התחתון). מחק את השכבה התחתונה ואת גלולה, אשר מורכב השלב אורגני פסולת התא, לתוך מיכל הולם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזרז את tRNA על ידי ערבוב יסודי של המסיסים (מימית) שלב עם נפח 2.5% 100 / V אתנול v על ידי היפוך במשך שעה 1 ב 4 ° C. צנטריפוגה התערובת ב XG 15,000 (30 דקות, 4 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג את supernatant בזהירות resuspend גלולה עשיר tRNA ב 4 מ&quot;ל חיץ סינון ג&#39;ל (20 מ&quot;מ נתרן פוספט או אשלגן פוספט, pH 7.4, 0.1 מ&quot;מ EDTA). הפעל 5 μL של הבריכה tRNA resuspended על 2% w / v agelose ג&#39;ל. הערה:איכות טובה tRNA מופיע כלהקה אחת (גודל מולקולרי בין 50-100 bp). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיהור של tRNA (UUU) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תרגול כרומטוגרפי סטנדרטי 12 , לטעון את tRNA resuspended (UUU) על עמודה סינון ג&#39;ל המכינה ברזולוציה גבוהה (מידות: 16 x 600 מ&quot;מ, נפח המיטה: 120 מ&quot;ל, טווח רזולוציה: 1,000-70,000 דה) בעבר equilibrated ב חיץ סינון ג&#39;ל (שלב נייד). הגדר את קצב הזרימה 1 מ&quot;ל / דקות כדי elute דגימות. הערה: נקודת השיא של ה- tRNA (UUU) משתרעת על 75.5 מ&quot;ל. בדרך כלל, תשואה של 0.5-1.0 מ&quot;ג / L tRNA של התרבות ניתן להשיג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את דגימות בנפחים אלוטי נציג ידי electrophoresing 5-10 μL של כל מדגם על 2% w / v agelose ג&#39;ל. </li></ol></li></ol> 3. הכנת דגימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אקספרס ולטהר TcdA על פי López-Estepa et al . 2 . הערה: עד 250 מיקרומטרTCDA ניתן להשתמש עבור המחקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה את הסכום המקביל של TcdA לפי טבלה 1 לתוך שכותרתו כראוי 1.5 צינורות צנטריפוגה מ&quot;ל. הוסף 1.6 מ&quot;מ טריס (2-carboxyethyl) פוספין (TCEP) (ריכוז סופי) ו לערבב בעדינות באמצעות פיפטה. סגור את המכסה לדגור את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מיקרומטר של טריפוספט אדנוזין (ATP) ו 50 מ&quot;מ MgCl 2 (ריכוז סופי). מערבבים עם פיפטה לדגור את התערובת במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מטוהרים tRNA (UUU) (סעיף 2.3) לפי טבלה 1 , לערבב עם פיפטה ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) עד 100 נפח סופי μL. מערבבים כראוי ולהוסיף גליצרול לריכוז סופי של 10% v / v. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס המדגם בקצרה לסובב את תוכן הצינור (10,000 xg, 1 דקות, 4 ° C). </li></ol> 4. ג&#39;ל טוען ופיתוח אלקטרופורזה<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים יחידת אלקטרופורזה לתוך מגש מלא קרח כתוש כדי לשמור על החדר ב 4 מעלות צלזיוס במהלך לרוץ אלקטרופורזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות, פיפטה 5 μL של כל מדגם לתוך המקביל היטב. הוסף סמן מתאים DNA גודל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את האלקטרודות לחריצים המתאימים של יחידת אספקת החשמל. הפעל את יחידת אספקת החשמל ולהגדיר את המתח ל 100 V ולהפעיל את הג &#39;ל במשך 90 דקות. </li></ol> 5. מכתים ג &#39;ל כדי לראות אינטראקציה חלבון tRNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון מכתים על ידי ערבוב 50 מ&quot;ל של TBE עם 1x של כתם ה- DNA מתאים. הימנע חשיפת הפתרון מכתים לאור השמש על ידי כיסוי המכיל מכתים עם רדיד אלומיניום. הערה: כתמי ה- DNA מאוחסנים בדרך כלל כ -10,000 או 20,000 מניות מרוכזות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 90 דקות של אלקטרופורזה, להסיר בזהירות את הג&#39;ל מהמגש ומניחים אותו במיכל עם פתרון מכתים. מניחים אותו על נדנדה במהירות נמוכה נדנדה בטמפרטורת החדרUre עבור 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הג &#39;ל agarose מהמכל מכתים, הקש עליו בזהירות על פיסת תאית או נייר סינון כדי להסיר נוזלים עודפים, ומניחים אותו ישירות על transilluminator. להדליק את האור UV לדמיין להקות המכילות tRNA. צלם תמונה של הג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלבון מכתים (אופציונלי). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את הפתרון מכתים ה- DNA בבטחה (על פי נהלי הבטיחות) ולהחליף אותו עם 50 מ&quot;ל CoLassie מבריק כחול (CBB) פתרון. מניחים את המגש על נדנדה בטמפרטורת החדר ואת הכתם לילה (&gt; 12 שעות). מחק את הפתרון מכתים CBB ולהחליף אותו עם 50 מ&quot;ל PBS להסיר צבע עודף. Destain עבור 1 שעות על נדנדה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחזות חלבון המכילים מתחמי tRNA תחת transilluminator אור ולקחת תמונות של ג &#39;ל להשוות עם תמונה tRNA UV ג&#39;ל. </li></ol>

<ol><li>Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gel+retardation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The gel retardation assay.</a> Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).</li>
<li>López-Estepa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structure+and+small-angle+X-ray+analysis+of+CsdL%2FTcdA+reveal+a+new+tRNA+binding+motif+in+the+MoeB%2FE1+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">The crystal structure and small-angle X-ray analysis of CsdL/TcdA reveal a new tRNA binding motif in the MoeB/E1 superfamily.</a> Plos One. 10 (4), e0118606(2015).</li>
<li>Miyauchi, K., Kimura, S., Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cyclic+form+of+N6-threonylcarbamoyladenosine+as+a+widely+distributed+tRNA+hypermodification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A cyclic form of N6-threonylcarbamoyladenosine as a widely distributed tRNA hypermodification.</a> Nat Chem Biol. 9 (2), 105-111 (2013).</li>
<li>Bolstad, H. M., Botelho, D. J., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+protein-protein+interactions+within+the+Cysteine+Sulfinate+Desulfinase+Fe-S+cluster+biogenesis+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of protein-protein interactions within the Cysteine Sulfinate Desulfinase Fe-S cluster biogenesis system.</a> J Proteome Res. 9 (10), 5358-5369 (2010).</li>
<li>Loiseau, L., Ollagnier-de Choudens, S., Lascoux, D., Forest, E., Fontecave, M., Barras, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+heteromeric+CsdA-CsdE+cysteine+desulfurase%2C+assisting+Fe-S+cluster+biogenesis+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of the heteromeric CsdA-CsdE cysteine desulfurase, assisting Fe-S cluster biogenesis in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 280 (29), 26760-26769 (2005).</li>
<li>Fried, M. G., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equilibrium+studies+of+the+cyclic+AMP+receptor+protein-DNA+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Equilibrium studies of the cyclic AMP receptor protein-DNA interaction.</a> J Mol Biol. 172 (3), 241-262 (1984).</li>
<li>Garner, M. M., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gel+electrophoresis+method+for+quantifying+the+binding+of+proteins+to+specific+DNA+regions%3A+application+to+components+of+the+Escherichia+coli+lactose+operon+regulatory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system.</a> Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).</li>
<li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+mobility+shift+assays+for+RNA-protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic mobility shift assays for RNA-protein complexes.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014 (4), 435-440 (2014).</li>
<li>Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+protein-RNA+interactions+by+gel+mobility+shift%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift.</a> Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).</li>
<li>Yakhnin, A. V., Yakhnin, H., Babitzke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel+mobility+shift+assays+to+detect+protein-RNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Gel mobility shift assays to detect protein-RNA interactions.</a> Methods Mol Biol. 905, 201-211 (2012).</li>
<li>Ream, J. A., Lewis, L. K., Lewis, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+agarose+gel+electrophoretic+mobility+shift+assay+for+quantitating+protein%3A+RNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Rapid agarose gel electrophoretic mobility shift assay for quantitating protein: RNA interactions.</a> Anal Biochem. 511, 36-41 (2016).</li>
<li>Hagel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel-filtration+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Gel-filtration chromatography.</a> Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 10, Unit 10.9 (2001).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

החלבון tRNA agarose ג&#39;ל פיגור assay המתואר כאן ניתן לשנות במספר דרכים. ראשית, אחוז agarose בג&#39;ל ניתן לצמצם על מנת לאפשר הפרדה והדמיה של מתחמי חלבון tRNA גדול באופן משמעותי מאשר אחד ניתח כאן (120 kDa). שנית, אם חלבון המטרה הוא thermolabile, יש לנקוט אמצעי זהירות נוספים כדי להבטיח כי הטמפרטורה נשמרת מתחת לטמפרטורה המקסימלית המקובלת על ידי הזזת מנגנון אלקטרופורזה לחדר קר או באמצעות חבילות קרח בתוך החדר אלקטרופורזה מיד להפיג את החום המיוצר במהלך הריצה. חיבורים אחרים חיץ ( ...

<html> Assay ג&#39;ל פיגור 1 (הידוע גם בשם assay ניטור אלקטרופורטי ניידות, EMSA) היא שיטה אלקטרופורטית שנועדה ללמוד ולאפיין אינטראקציות חומצה חלבון-חלבון. זה מאפשר ניתוח של DNA- חלבון כמו גם אינטראקציות חלבון- RNA ובמיוחד, אינטראקציות בין tRNA ו tRNA מחייב חלבונים, תוך שימוש ברכיבים מטוהרים או תערובות מורכבות של חלבונים ( למשל , lysates התא) או חומצות גרעין ( למשל , tRNA בריכות). יש לנו להחיל מבחני פיגור ג&#39;ל לחקר האינטראקציה בין tRNA מטוהרים (UUU) ו TcdA, N 6- threonylcarbamoyladenosine (לא 6 A) dehydratase, אשר cyclizes את שרשרת הצד threonylcarbamoyl המצורפת A37 ב לולאה גזע ליקוד (ASL) של tRNAs למחזורי t 6 (ct 6 A) 2 , 3 . TcdA ידוע גם בשם CsdL 3 ,F.&gt; 4. הגן tcdA / csdL יוצר אשכול עם csdA ו- csdE גנים 5 , אשר לקודד את desulfurase ציסטאין ואת acceptor גופרית של מערכת cystinase desulfinate cystinase (CSD) מערכת והוא נדרש כדי לשמור על פונקציית TCDA ב vivo 3 . הרציונל מאחורי מבחני הפיגור ג&#39;ל הוא, בעוד מולקולות חומצות גרעין חופשי נודדות במהירות לחזית של ג&#39;ל acrylamide או agarose מכוח המטען השלילי הגדול שלהם, את הניידות האלקטרופורטית של קומפלקסים חלבונים של חומצות גרעין אותו מופחת באופן דרמטי. צמצום הניידות הוא דמיינו כמו &quot;משמרת&quot; של קומפלקס חומצות גרעין, אשר לפתור כמו להקות נפרדות. טעון חיוביים גדול מורכבים חומצה גרעין מורכבים להראות שינוי גדול יותר או ירידה ניידות על ג&#39;ל. מאז ניטרול המטען של המתחם היא תופעה אוניברסליתעבור מתחמי חומצה גרעין חלבונים, assay פיגור ג&#39;ל ניתן ליישם מגוון רחב של קומפלקסים סוגי חומצה גרעין. השיטה היא פשוטה, זול, והוא יכול להתבצע במעבדות עם ציוד מינימלי. זה דורש רק כמויות קטנות של חלבונים ו tRNA. זהו יתרון על פני טכניקות ביופיסיקליות חלופיות, שבדרך כלל צורכות כמויות גדולות יותר של מדגם. Assay פיגור ג&#39;ל כבר בשימוש נרחב לחקר גורמי שעתוק. Assay שימש כדי לנתח קינטיקה מחייב, כוח, וספציפיות של גורמי שעתוק עבור רצפי DNA שונים. זה היה באמת בתחום זה כי EMSA פותחה לראשונה 6 , 7 . ג&#39;ל מבחני פיגור עם RNA 8 , 9 , 10 , 11 ו מולקולות tRNA שימשו גם במחקר ריבוזוםוכדי לנתח, כפי שאנו עושים כאן, האנזימים שמשנים נוקליאוזידים tRNA לאחר תעתיק. פרמטרים שונים רבים משפיעים על התוצאה של assay פיגור ג&#39;ל כגון טמפרטורה, איכות החלבון מדגם tRNA, ואת כוחו של הכריכה. תכנון וביצוע זהיר של הניסוי הוא קריטי עבור הפרשנות של התוצאות של חומצה גרעין חופשי מינים הקשורים חלבון. כאן, השתמשנו גנים סינתטיים קידוד tRNA (UUU) משובטים לתוך וקטור ביטוי אשר יזם חסר האתר Shine-Dalgarno ריבוזום מחייב, המוביל סינתזה של כמויות גדולות של tRNA 2 . פרוטוקול מפורט זה נועד לספק מדריך ברור לביצוע ניסויי tRNA ג&#39;ל פיגור תוך הימנעות טעויות נפוצות.

<table><tbody><tr><td>E. coli BL21(DE3)</td><td>Novagen</td><td>70235</td><td>DE3 lysogen מכיל T7 פולימראז עם השראת IPTG.</td></tr><tr><td>pET23d</td><td>Novagen</td><td>69748-3</td><td>pET23d מעניק עמידות לאמפיצילין; מקדם T7.</td></tr><tr><td>ניתן להשתמש גם במרק LB, מלח נמוך (מרק לנוקס L), מלפורד מגורען</td><td></td><td>GL1703</td><td>מרק LB קונבנציונאלי, מלח גבוה.</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10419313</td><td></td></tr><tr><td>אינקובטור שייקר (תרמוסטד)</td><td>NBS</td><td>Excella E24&nbsp;</td><td>ניתן להשתמש בכל חממת שייקר עם בקרת טמפרטורה.</td></tr><tr><td>איזופרופיל-בטא-D-תיוגלקטופירנוזיד (IPTG), >=99%</td> <td>Acros Organics</td><td>BP1755</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אצטט, נטול מים, >99%</td><td></td><td></td> חומצה <td></td></tr><tr><td>אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA), מלח דיסודיום, >99%</td> <td>Acros Organics</td><td>AC327205000</td><td>מזיק בשאיפה.</td></tr><tr><td>צנטריפוגה (מקוררת)</td><td>Eppendorf</td><td>5430</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה (מקוררת) רוטור</td><td>Eppendorf</td><td>5430/5430P</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Sorvall</td><td>RC5C</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה רוטור</td><td>Sorvall</td><td>SLA-3000</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פנול, רוויה במאגר ציטראט 0.1 M, pH 4.3 &plusmn; 0.2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4682</td><td>רעילות חריפה (דרך הפה, העור, שאיפה),</td></tr><tr><td>אתנול קורוזיבי מוחלט לניתוח, 100% v/v</td><td>Merck Millipore</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט דיביסיק דיהידרט, Na2HPO4, >=99%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן דימימן פוספט, KH2PO4</td><td>Merck</td><td>48,730,250</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 16/60 Superdex 75&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28989333</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Melford</td><td>MB1200</td><td></td></tr><tr><td>Tris [Tris(hydroxymethyl) aminomethane HCl]</td> <td>Melford</td><td>T1513</td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Melford</td><td>B0503</td><td></td></tr><tr><td>Microwave</td><td>Haier</td><td>HDA-2070M</td><td></td></tr><tr><td>TCEP [Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride]</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706</td><td>קורוזיבי למתכות ולעור.</td></tr><tr><td>ATP [אדנוזין 5&פריים;-טריפוספט דיסודיום מלח הידרט], דרגה I, >=99%</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד (MgCl2), נטול מים, >=98%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl), >99%</td> <td>פישר ביוריאגנטים</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי (KCl), >99%</td> <td>Melford</td><td>P0515</td><td></td></tr><tr><td>NZYDNA סולם VI</td><td>NZYtech</td><td>MB8901</td><td></td></tr><tr><td>ספק כוח</td><td>בן זוג</td><td>EV261</td><td></td></tr><tr><td>יחידת אלקטרופורזה</td><td>מעבדה אמיתית</td><td>RELSMINI10</td><td></td></tr> אמיתי <tr><td>בטוח צביעת חומצות גרעין</td> Real <td>Laboratory</td><td>RBMSAFE</td><td>20,000X מלאי</td></tr><tr><td>UV Transilluminator (G:Box/EF)</td> <td>Syngene</td><td>2216498</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0770</td><td></td></tr><tr><td>נדנדה (ג'ירו-רוקר)</td><td>סטיוארט</td><td>SSL3</td><td></td></tr><tr><td>מיקסר מערבולת&nbsp;</td><td>מותג פישר</td><td>13214789</td><td></td></tr></tbody></table>

פרוטאין trna agarose ג&#39;ל מבחני פיגור לניתוח של<em&gt; n</em<sup&gt; 6</sup&gt; -treonylcarbamoyladenosine tcda פונקציה

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

אנו מדגימים שיטות הביטוי וטיהור של tRNA (UUU) ב Escherichia coli ואת הניתוח על ידי מבחני ג&#39;ל פיגור של הכריכה של tRNA (UUU) כדי TcdA, N 6- threonylcarbamoyladenosine (לא 6 א) דהידראטאז, אשר cyclizes threonylcarbamoyl בצד שרשרת A37 ב לולאה גזע anticodon (ASL) של tRNAs כדי מחזורי לא 6 A (Ct 6 A). תמלול של גנים סינתטיים קידוד tRNA (UUU) הוא המושרה ב coli עם 1 מ&quot;מ isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ואת התאים המכילים tRNA נקצרים 24 שעות שלאחר אינדוקציה. חלק RNA הוא מטוהרים באמצעות שיטת חומצה פנול החילוץ. טהור tRNA מתקבל על ידי כרומטוגרפיה סינון ג&#39;ל כי ביעילות מפריד את מולקולות tRNA בגודל קטן מחומצות גרעין שלם שלם או מקוטעת. כדי לנתח TCDA מחייב tRNA (UUU), TcdA מעורבב עם tRNA (UUU) ומופרדים על ג&#39;ל agarose יליד על 4 מעלות צלזיוס.TRNA חופשי (UUU) נודדת מהר יותר, בעוד TCDA-tRNA (UUU) מתחמי עוברים פיגור ניידות כי ניתן לצפות על מכתים של ג &#39;ל. אנו מראים כי TcdA הוא אנזים tRNA (UUU) מחייב. זה assay פיגור ג&#39;ל ניתן להשתמש כדי ללמוד מוטציות TCDA ואת ההשפעות של תוספים וחלבונים אחרים על הכריכה.

כמויות גדולות של tRNA (UUU) ניתן להשיג על ידי להביע את הגן tRNA ב E. coli תחת שליטתו של מקדם T7 חזק inducible. TRNA לידי ביטוי (UUU) מצטבר בציטופלסמה מועשר מעל הבריכה של tRNAs בשפע טבעי. תהליך טיהור דו-שלבי הכולל שלב ללכידה / מיצוי וג&#39;ל סינון / ליטוש צעד נוצל להשיג tRNA בכיתה EMSA. שלב הלכידה / החילוץ משתמש בפנול 4.3 pH כדי להשיג את המשקעים בו-זמנית של חלבון, פסולת התא, DNA, והפקת tRNA (ומולקולות רנ&quot;א אחרות). בשלב זה, כמות הבריכה ...

פרוטוקול מוצג לייצור tRNA (UUU) וניתוח של tRNA (UUU) במורכבות עם TDAA אנזים ידי מבחני ג &#39;ל agarose פיגור.

פרוטאין tRNA Agarose ג&#39;ל מבחני פיגור לניתוח של<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -Treonylcarbamoyladenosine TCDA פונקציה

We demonstrate methods for the expression and purification of tRNA(UUU) in Escherichia coli and the analysis by gel retardation assays of the binding of ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להדגים בדיקת עיכוב ג'ל של RNA המיועדת לגילוי ואפיון של חלבונים נקשרי RNA. יישום בדיקה זו משמש לחקירת האינטראקציה בין TcdA לבין tRNA. שיטת עיכוב הג'ל באגרוז יכולה לספק תשובות לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה של ה-RNA.לדוגמה, האם חלבון מסוים מקשר עם RNA, האם האינטראקציה היא ספציפית לרצף, ומהו חוזק האינטראקציה. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא משתמשת בכמויות קטנות ומגוונות של דגימות חלבון ו-RNA, ומספקת תוצאות אינפורמטיביות מאוד על אינטראקציות חלבון-RNA במהירות רבה. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי קומפלקסים של חלבון-tRNA, ניתן להחיל אותה גם על מערכות רבות אחרות כגון RNA ריבוסומלי, RNA שליח וכל סוג אחר של מולקולת RNA.בבוקר, הוצא מבחנה שלfrozen E coli BL21 DE3 שהועברו אליה (transformed) וקטור הביטוי pET-23D EC triple-U. בצע מריחה על צלחת לוריא ברוט (luria broth) עם ריכוז מלח נמוך או צלחת LB בתוספת 100 µg/mL ampicillin. הפוך את הצלחת והנח אותה באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עד להופעת מושבות בשעות אחר הצהריים המאוחרות.העבירו מושבה בודדת שגדלה היטב לתוך חמישה מיליליטר של LB בתוספת 100 micrograms per milliliter של ampicillin וגדלו למשך לילה. למחרת בבוקר, השקיעו את התאים. לאחר הצנטריפוגציה, החליפו את המצע בחמישה מיליליטר של LB טרי בתוספת 100 micrograms per mi

protein-trna-agarose-gel-retardation-assays-for-analysis-n6

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

פרוטוקול זה מתאר את הכנת המצע tRNA סינתטי...

ב Assay tRNA מתילציה במבחנה עם histolytica Entamoeba דנ&quot;א Dnmt2 tRNA methyltransferase (Ehmeth) אנזימים

טלומראז מתבטא במוח היילוד וגם באזורים שונים במוח הבוגר. אנו מציגים מבחן TRAP לא רעיל שחוסך זמן לניתוח פעילות הטלומראז באזורים שונים במוח העכבר וזיהוי הבדלים בפעילות הטלומראז בין מוחות עכברים זכרים ונקביים.

פעילות telomerase באזורים שונים של מוח עכבר: הטלומרז לא רדיואקטיבי חזור הגברה פרוטוקול Assay (TRAP)

גליום (III) 5,10,15- pentafluorophenylcorrole (טריס) והאנלוגי Freebase להציג cytotoxicity תא מייקרו הנמוך. כתב יד זה מתאר תגובת RNA שעתוק, RNA הדמיה עם ג'ל מוכתם ברומיד ethidium, ו- RNA כימות עם ספקטרוסקופיה UV-Vis, על מנת להעריך עיכוב שעתוק על ידי corroles ומדגימה שיטה פשוטה של ​​הערכת נכסי מועמד אנטי-סרטני.

<em&gt; במבחנה</em&gt; אנזימתי Assay למדוד תמלול עיכוב על ידי גליום (III) ו- H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-טריס corroles (pentafluorophenyl)

פרוטוקול זה מתאר את NAME, בדיקה המאפשרת זיהוי מהיר של מולקולות המסוגלות לעכב במבחנה את פעילויות המלווה של חלבון נוקלאוקפסיד HIV-1.

חישול בתיווך Nucleocapsid אלקטרופורזה (NAME) Assay מאפשר זיהוי המהיר של HIV-1 Nucleocapsid המעכבים

אנו מציגים תוכנית אסטרטגית ופרוטוקול לזיהוי וריאנטים גנטיים לא מקודדים המשפיעים על קשירת ה-DNA של גורם השעתוק (TF). פרוטוקול ניסיוני מפורט מסופק לבדיקת משמרת ניידות אלקטרופורטית (EMSA) וניתוח משקעים של זיקה ל-DNA (DAPA) של קשירת TF DNA תלויה בגנוטיפ.

הקרנה עבור וריאנטים גנטיים ללא קידוד תפקודיים באמצעות ניידות Electrophoretic Shift Assay (Emsa) ו Assay משקע זיקת DNA (DAPA)

טלומראז האנושי רוורס טרנסקריפטאז (טרט) מסנתז לא רק דנ א telomeric, אלא גם כפול גדילי RNA באמצעות פעילות RNA פולימראז תלוי-RNA. כאן, אנו מתארים את assay שהוקם כדי לזהות פעילות RNA פולימראז תלוי-RNA של טרט אנדוגני.

גילוי הכמותיים למחצה של RNA תלוית RNA פולימראז פעילות החלבון רוורס טרנסקריפטאז טלומראז אנושי

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור האפיון הביוכימי של שמרים שינוי RNA האנזים, Mod5, ונדון כיצד פרוטוקול זה יכול לחול על אנזימים אחרים שינוי RNA.

Assay ב Vitro לגילוי פעילות טרנספראז tRNA-Isopentenyl

כאן, אנטי נוגדן בתוך שימוש בלתי מתורבת לניתוח ישיר של פעילות מmethyltransferase על סינתטי או בתוך מבחנה מלאכותית המועתק RNA מתואר.

טיפול ללא נוגדנים עבור RNA מתילטרנספראז ניתוח פעילות

אנו מתארים את ההנדסה של פולימראז T7 RNA חדשני הקשור לדנ"א כדי לווסת את תגובות התמלול במבחנה. אנו דנים בצעדים לסינתזה ואפיון חלבונים, מאמתים רגולציה של תמלול הוכחת הרעיון, ודנים ביישומיה במחשוב מולקולרי, אבחון ועיבוד מידע מולקולרי.

RNA פולימראז קשור DNA לתכנות תמלול במבחנה וחישוב מולקולרי

האינטראקציה של שיפוץ כרומטין תלוי ATP עם ליגנד DNA מתוארת באמצעות ספקטרוסקופיה CD. ניתן להשתמש בשינויים הקונפורמציה המושרים על מקדם גנים שניתח על ידי הפסגות שנוצרו כדי להבין את מנגנון הרגולציה התמלולית.

ספקטרוסקופיה של תקליטור לחקר אינטראקציות בין DNA לחלבון

כאן מוצג פרוטוקול לבדיקת אנזימים לחילוף חומרים של חומצות גרעין, תוך שימוש בדוגמאות של אנזימי ליגאז, נוקלאז ופולימראז. הבדיקה משתמשת באוליגונוקלאוטידים מסומנים פלואורסצנטית ולא מסומנים שניתן לשלב ליצירת דופלקסים המחקים נזקי RNA ו/או DNA או מתווכי מסלול, ומאפשרים אפיון התנהגות אנזימים.

שימוש באוליגונוקלאוטידים סינתטיים שעברו שינוי כדי להעריך אנזימים לחילוף חומרים של חומצות גרעין

חקור אינטראקציות חלבון-RNA באמצעות מבחני עיכוב ג'ל אגרוז לניתוח קשרי tRNA עם חלבוני TcdA. שיטה זו מאפשרת זיהוי מהיר של קשרים ספציפיים בסיסי בביולוגיה של RNA.

פרוטאין tRNA Agarose ג'ל מבחני פיגור לניתוח של

גלה סרטונים נוספים