במבחנה צמיחה של העכבר זקיקים Preantral תחת Microgravity מדומה
17 בדצמבר 2017
טכניקה מאוד מבטיח לייצר רקמות בונה בלי באמצעות מטריצת התרבות תאים במצב microgravity מדומה. באמצעות מערכת תרבות סיבוביים, בדקנו זקיק השחלות הצמיחה וההתבגרות oocyte במונחים של זקיק הישרדות, מורפולוגיה, צמיחה, הפונקציה oocyte תחת התנאי microgravity מדומה.
גידול במעבדה (In vitro) של זקיקים פרה-אנטרליים של עכבר תחת מיקרו-גרביטציה סימולטיבית. ניתן לחלק את התהליך כולו לארבעה חלקים. חלק ראשון, בידוד מכני של זקיקים מהשחלות באמצעות מחטים תחת מיקרוסקופ סטריאו.
חלק שני, כליסה של זקיק בודד על ידי העברתו בפיפט למרכזו של כל חרוז אלגינאט. חלק שלישי, העברת חרוזי האלגינאט המכילים את הזקיקים הבודדים אל טיפת מדיום תרבית במערכת תרבית מסתובבת המייצרת מיקרו-כבידה סימולטיבית. חלק רביעי, איסוף חרוזי האלגינאט ושחרור הזקיקים מחרוזי האלגינאט על ידי אינקובציה במדיום המועשר ב-Alginate lyase למשך 30 דקות ב-37 °C.
בידוד ותגליפה של זקיקים. אספו את השחלות למדיום טיפול ולאחר מכן העבירו את השחלות ללוחית בארות עם תחתית שטוחה. תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי, בידדו את הזקיקים מהשחלות באמצעות שתי מחטים.
יש להיזהר לא לפגוע בממברנה הווסוקולרית. הכינו צלחת עם טיפות של מצע גידול וכסו אותה בשמן. העבירו את הזקיקים אל הצלחת שהוכנה.
שטפו את הזקיקים במצע החדש ולאחר מכן העבירו אותם לתוך טיפות של מצע. כל טיפה של מצע מכילה זקיק אחד. הכינו צלחת תרבית מרכזית והוסיפו את תמיסת הכמיסה למעגל החיצוני.
הכינו מבחנה של תמיסת alginate בריכוז 0.8%. הוסיפו 0.5 µL מתמיסת ה-alginate למרכז הצלחת. הוסיפו טיפות של תמיסת ה-alginate אל תוך תמיסת הכליאה במעגל החיצוני של הצלחת.
העבירו את הזקיק אל תמיסת האלגינאט במרכז הצלחת. שטפו את הזקיקים בתמיסת האלגינאט. העבירו את הזקיקים למרכז כל חרוז אלגינאט דרך השכבה הרכה של התמיסה.
כל חרוץ אלגינט מכיל זקיק בודד. שטפו את חרוצי האלגינט בתמיסת האנקפסולציה כדי להקשיח את החרוצים. העבירו את חרוצי האלגינט לכלי חד המכיל תמיסת טיפול (handling medium).
תרבית in vitro של זקיקים encapsulated תחת טיפול במיקרו-כבידה סימולטיבית. עבור קבוצת הביקורת, יש להוסיף 150 milliliter של מצע תרבית לצלוחית חדשה ולכסות אותה בשמן. העבירו שלושה חרוזי alginate לתוך טיפת המצע.
דגרו את הצלחת באינקובטור דו-חמצני לצורך תרבית. לטיפול במיקרו-כבידה סימולטיבית, הכינו צלחת עם שמן, הסירו את מכסה הפתח, והוסיפו את השמן לכלי דרך הפתח הפתוח, עד שהכלי כמעט מלא. הוסיפו 50 milliter של מצע גידול לתוך השמן.
העבירו שלושה חרוזי אלגינאט לתוך טיפת המצע. החזירו את מכסה הפתח הפתוח. יש להסיר את בועות האוויר מהכלי.
הסר את מכסה פתח המזרק. מקם שני מזרקים עם שמן על פתח המזרק. תמרן את בועות האוויר מתחת לפתח המזרק.
משכו את הבועות לתוך המזרק והזריקו את אותו נפח של שמן החוצה מהמזרק השני. ודאו שאין בועות אוויר בכלי. סגרו את השסתומים, הסירו את המזרקים והחזירו את מכסה פתח המזרק.
כבר הכנו ארבעה כלים עם חרוזי אלגינט. כעת הגיע הזמן לקבע את הכלים לבסיס המסתובב. כווננו את קצב הסיבוב עד שטיפת המדיום תהיה במצב של איזון.
העבר הן את הכליים והן את הבסיס לדגרה עם פחמן דו-חמצני לצורך תרבית. החלפת מצע גידול. הסר את מכסה הפתח הפתוח, ואסוף את חרוזי האלגינט ואת השמן לצלוחית חדשה.
אתרו והעבירו את כדוריות האלגינאט לכלי עם תווך טיפול. השקימו את מערכת תרבית כלי הדמיה כפי שבוצע קודם לכן. אחזור זקיקים.
הסר את מכסה הפתח הפתוח, ואסוף את חרוזי האלגינט ואת השמן לצלוחית חדשה. הפרד את הזקיקים שסוכו מהחרוזים על ידי הדגרה בתווך טיפול, בתוספת alginate lyase, למשך 30 דקות ב-37 °C. תוצאות. בדיקת חיוניות תאים הראתה כי בזקיקים בודדים שגודלו בתנאי כבידה רגילים ישנם יותר תאים חיים ופחות תאים מתים מאשר בזקיקים שגודלו בתנאי מיקרו-כבידה סימולטיבית.
גודל הזקיק עלה באופן משמעותי תחת שני תנאי כבידה. סיכום. השיטה שלנו מספקת מודל לחקר המנגנונים המעורבים בתהליכי הפיתוח in vitro של תאי ביצית ותאי גרנולוזה תחת תנאי מיקרו-כבידה סימולטיבית.
סקירה כללית
מחקר זה מתאר פרוטוקול לתרבית של זקיקי ביض פרה-אנטראליים של עכבר בתנאי מיקרו-כבידה סימולטיבית באמצעות מערכת תרבית מסתובבת. הגישה כוללת בידוד וכליאה של זקיקים בתוך חרוזי אלגינאט, גידולם בתנאי כבידה רגילים ובתנאי מיקרו-כבידה סימולטיבית, והערכת הישרדות הזקיקים, צמיחתם ומבנה העל (ultrastructure) של הביציות. הממצאים מדגישים את השפעת המיקרו-כבידה על חיוניות הזקיקים ועל התפתחות הביציות, ובכך מספקים מודל למחקר נוסף של פולוסיקולוגנזה (folliculogenesis) במבחנה תחת כבידה משתנה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של הרבייה
- ביולוגיה התפתחותית
- הנדסת רקמות
רקע
- סביבות של כבידה אפסית עלולות להשפיע על התפתחות תאים ורקמות.
- תרבית זקיקים חוץ-גופית (In vitro) היא כלי בעל ערך לחקר התפתחות הביצית ותאי הגרנולוזה.
- מערכות המדמות מיקרו-גרביטציה מאפשרות לחקור את תפקידה של הגרביטציה בתהליך הפוליקולוגנזה.
- כליאת אלגינאט תומכת בתרבית זקיקים תלת-ממדית.
מטרת המחקר
- ביסוס פרוטוקול לתרבית זקיקים פרה-אנטרליים של עכבר תחת סימולציה של מיקרו-גרוויטציה.
- השוואת הישרדות והתפתחות הזקיקים בין תנאי כבידה רגילים לתנאי סימולציה של מיקרו-גרוויטציה.
- הערכת ההשפעות של מיקרו-גרוויטציה על התפתחות הביצית ותאי הגרנולוזה.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- בידוד מכני של זקיקים פרה-אנטראליים משחלות של עכברים בני 14 ימים באמצעות מחטים תחת מיקרוסקופ סטריאו.
- כמיסה של זקיקים בודדים בחרוזי אלגינאט בריכוז 0.8%.
- גידול של הזקיקים הכמוסים במערכת כלי מסתובב לסימולציית מיקרו-גרביטציה, עם תרביות ביקורת מקבילות בכבידה רגילה.
- שליפה ושחרור של הזקיקים מהכיסוי באמצעות אלגינאט ליאז.
- הערכת הישרדות הזקיקים, מדידת קטרי הזקיקים והוואוציטים, וניתוח אולטרה-מבני של הוואוציטים.
תוצאות עיקריות
- זקיקים שגודלו תחת כבידה רגילה הראו חיוניות תאים גבוהה יותר בהשוואה לאלו שגודלו תחת מיקרו-כבידה סימולטיבית.
- גודל הזקיקים עלה באופן משמעותי בשני תנאי הכבידה.
- מיקרו-כבידה סימולטיבית הובילה לירידה בהישרדות הזקיקים ולדיכוי ביטוי של PCNA (proliferating cell nuclear antigen) ושל GDF9 (growth differentiation factor 9).
- אוציטים מקבוצת המיקרו-כבידה הראו anomalias במבנה העל (ultrastructural abnormalities).
מסקנות
- השיטה המתוארת מאפשרת את חקר התפתחות הזקיקים והביציות in vitro תחת כבידה זעירה סימולטיבית.
- כבידה זעירה סימולטיבית משפיעה לרעה על הישרדות הזקיקים ועל איכות הביציות.
- נדרשת אופטימיזציה נוספת של מערכת התרבית כדי לדגמן טוב יותר פולוכולוגנזה in vitro תחת תנאי כבידה משתנים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
תרבית של זקיקים פרי-אנטרליים של עכבר תחת סימולציה של מיקרו-גרביטציה מספקת מערכת מבוקרת לבחינת ההשפעה המכניסטית של כוחות פיזיקליים משתנים על פוליקולוגנזה מוקדמת. מודל זה מאפשר הערכה כמותית של הישרדות הזקיקים, צמיחת הביציות וסמנים מולקולריים, ובכך תומך בביטחון ניבוי במחקרי ביולוגיה התפתחותית. גישה זו מספקת בסיס לקבלת החלטות מותאמות סיכון עבור מחקרים תרגומיים בתחומי הנדסת הרקמה והרבייה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית של התפתחות זקיקים וביציות תחת תנאי כבידה משתנים.
- תומך בתיקוף תפקודי של סממנים מולקולריים כגון PCNA ו-GDF9 בהבשלת תאי גרנולוזה וביציות.
- מספק פלטפורמה כמותית לבדיקת השערות בביולוגיה של הרבייה ובהנדסת רקמות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מקיים מערכת תרבית תלת-ממדית (3D) הניתנת לשחזור להערכת חיוניות זקיקים ומדדי גדילה.
- מסייע בסטנדרטיזציה של קריאות כמותיות, כולל קטרי הזקיקים והציטות.
- מאפשר ניתוח השוואתי של הישרדות וביטוי מולקולרי תחת תנאים פיזיקליים משתנים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מציע מודל לחקר מנגנונים רלוונטיים למחלה המשפיעים על איכות הביציות ועל הישרות הזקיקים.
- תומך בהלימה בין ממצאים in vitro לבין פיתוח ביומרקרים תרגומיים בתחום בריאות הרבייה.
- מספק מידע לאסטרטגיות פרה-קליניות לאופטימיזציה של מערכות תרבית רקמות בסביבות שאינן סטנדרטיות.
שילוב בקו תהליכי (Pipeline) ובזרימת עבודה
שיטה זו משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני, בכך שהיא מאפשרת מחקרים מכניסטיים בשלבים מוקדמים ופיתוח מערכי בדיקה כמותיים עבור ביולוגיה של הרבייה והנדסת רקמות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקה מונחית-השערות של השפעת כוח הכבידה על פוליקולוגנזה והבשלת תאי ביضית.
- סריקה: מספקת פלטים כמותיים וסטנדרטיים לבדיקת חיוניות וצמיחה תחת תנאים מבוקרים.
- אנליטיקה: מספקת נקודות סיום מדידות כגון שיעורי הישרדות, ביטוי סממנים מולקולריים ואנליזה אולטרה-מבנית.
- מחקר תרגומי: מגשר בין ממצאים in vitro למודלים פרה-קליניים עבור רפואה רבייתית ורפואת רגנרציה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר עבור מחקרים מכניסטיים בסוגי רקמות ותאים מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: משפר את הביטחון החזוי במודלים של ביולוגיה התפתחותית וביולוגיה של הרבייה.
- ערך תפעולי: מקדם סטנדרטיזציה ושחזוריות בתהליכי עבודה של תרביות תלת-ממד והערכה כמותית.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס לקבלת החלטות לגבי המשך קידום תוכניות להנדסת רקמות ובריאות הרבייה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים של יוזמות מחקר מכניסטיות ותרגומניות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בבידוד זקיקים, אנקפסולציה וטכניקות של תרביות תלת-ממדיות.
- דורש גישה למערכות תרבית מסתובבות ייעודיות ותשתית אנליטית להערכה כמותית.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של בדיקות חיוניות וניתוח סממנים מולקולריים.
- עשוי לדרוש התאמה לסוגי רקמות או מינים שונים, בהתאם למיקוד המחקר.
- אופטימיזציה של פרמטרי סימולציית מיקרו-גרביטציה היא קריטית לאמינות ולשחזור המודל.
