תא שריר לב מבוסס מפעיל ומייצב עצמי ביורובוט - חלק 1

המטרה הכוללת של סרטון זה היא לתאר כיצד לפתח ולאפיין אקטואטור ביולוגי המשתמש בזרועות קנטילבר גמישות מ-PDMS בתאי שריר לב (cardiomyocytes). אקטואטורים אלו משולבים לאחר מכן בבסיס שעבר שינוי כדי ליצור ביו-רובוט שחייה בעל ייצוב עצמי. שיטת האימות המתוארת כאן היא ייחודית, שבה מבנה הבסיס המכני שונה כדי ליצור ביו-רובוט שחייה בעל ייצוב עצמי שניתן לקבוע את מיקומו גם באופן חיצוני באמצעות מגנטים.

היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לשנות בקלות את תכונות הבסיס כדי להתאים את כושר הציפה של ההתקן ולצורך ייצוב עצמי. ניתן ליישם את השיטה לפיתוח התקנים חדשניים אחרים שידרשו ייצוב עצמי וציפה. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקשו בביצועה, מכיוון שעיוות מכני של הזרועות התלויות (cantilevers) הוא מאתגר.

בשל גודלן הדק, הן עלולות להיקרע בקלות או להייתקע בצורות מוזרות. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן קשה ללמוד את השלבים ואת ההרכבה ללא עזר חזותי. כדי להתחיל, הניחו פרוסת סיליקון על ספינר לרזיסט פוטוגרפי.

מרחו שכבה דקה של פוטורזיסט (photo resist) על פרוסת הסיליקון (wafer) ובצעו ציפוי בסבב (spin coat) במהירות של 2,000 RPM למשך 20 שניות כדי להגיע לעובי יעד של 1.2 micrometers. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה לפרוסות סיליקון כדי להעביר את הפרוסה המצופה לפלטה חמה שחוממה מראש ל-120 degrees Celsius. כסו את הפרוסה בצלחת פטרי רדודה ואפו אותה למשך 10 דקות.

שקלו ששה גרמים של בסיס PDMS ושילבו אותם עם 0.6 גרמים של חומר מעקש PDMS. ערבבו את רכיבי ה-PDMS ביסודיות במשך חמש דקות. הניחו את תערובת ה-PDMS בתא ואקום ויצרו ואקום של 100 millibar למשך 30 דקות.

בסיום הפעולה, שחררו את הוואקום והוציאו את המיכל. השאירו את המיכל מכוסה עד למועד השימוש ב-PDMS. לאחר שהוופר התקרר, החזירו אותו למסובב הפוטורזיסט (photo resist spinner).

שפכו באיטיות את כל תערובת ה-PDMS לאחר ניקוי הגזים על גבי הווייפר, באופן שימנע היווצרות בועות חדשות. לאחר מכן, בצעו ציפוי בסחרור (spin coat) של הווייפר במהירות של 1,200 RPM למשך חמש דקות. בעזרת פינצטה לווייפרים, הוציאו את הווייפר מהמכשיר לציפוי בסחרור והניחו אותו בתנור שחומם מראש.

אפו את הפרוסה למשך לילה וその後 קררו את הפרוסה לטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הכינו חרטת לייזר כדי ליצור תבנית בשכבת ה-PDMS הדקה. התחילו בהפעלת חרטת הלייזר ומערכת הפליטה שלה.

לאחר מכן, הדליקו את המחשב המחובר למכונת החריטה בלייזר ופתחו את התוכנה של מכונת החריטה. תחת File, פתחו את קובץ התכנון של המפעיל הביולוגי. לחצו על כפתור Settings, לחצו על Blue, ושנו את הגדרת ההספק ל-3% ואת המהירות ל-4%. לחצו על Set, לחצו על Red, ושנו את המצב ל-Skip.

לאחר מכן לחצו על Set. בצעו את אותה הפעולה עבור Black. לחצו על כפתור Apply כדי לסיים את ההגדרות.

בשלב הבא, בחרו ב-Activate the Engraver. לאחר מכן לחצו על Relocate כדי להעביר את העיצוב למרכז המסך. לאחר מכן, לחצו על כפתור Focus View ולחצו על קצה העיצוב כדי להזיז את נקודת לייזר ההדריך לנקודה התואמת.

יישרו בזהירות את פרוסת הסיליקון (wafer) עם נקודת לייזר ההכוונה באמצעות ידיים מוגנות בכפפות. לאחר היישור, בחרו ב-Start Engraving the Prior Job כדי להתחיל את תהליך החריטה. על מנת לייצר את בסיס המפעיל הביולוגי (biological actuator), נדרש מכלים לאפייה.

ראשית, הניחו את המכל על מאזניים ואפסו את המאזניים. לאחר מכן, שפכו PDMS שמעורב מראש והניחו חרוזי זכוכית נקיים בקוטר 3 מילימטר על תערובת ה-PDMS במרווחי זמן קבועים. השאירו רווח של לפחות 5 מילימטר מסביב לכל חרוד עבור בסיס המפעיל הביולוגי.

הניחו את המכל בתוך תא ואקום, הפחיתו את הלחץ ל-100 millibar וכבו את משאבת הוואקום. לאחר 30 דקות, שחררו את הוואקום והוציאו את המכל. השאירו את המכל מכוסה עד למועד השימוש.

בשלב הבא, חממו פלטה חשמלית ל-40 °C והניחו בזהירות את מיכל ה-PDMS עם חרוזי הזכוכית על הפלטה. כסו את המיכל ואפו אותו למשך לילה. לאחר קירור, השתמשו בסכין גילוח כדי לחתוך קוביות של 5 millimeter מתוך גוש ה-PDMS, כך שבמרכז כל קובייה יהיה חרוז זכוכית אחד.

לאחר מכן, טבול את קצה מחט ב-PDMS נוזלי שהוכן טרי והנח טיפה של PDMS על אזור הבסיס החרוט של הוופר. מרח את הטיפה כך שתכסה לחלוטין את אזור הבסיס בגודל 5 מילימטר על 5 מילימטר. לבסוף, השתמש בפינצטה כדי להניח את הקובייה המכילה את חרוז הזכוכית על אזור הבסיס המכוסה ב-PDMS נוזלי.

חזור על תהליך זה עבור כל התקן. עם הסיום, העבר את הפרוסה ללוח חימום בטמפרטורה של 40 °C וכסה אותה לאפייה למשך הלילה. השתמש בפינצטה חדה כדי לקלף את הקנטילבר מהפרוסה ולהצמידו לדופן הבסיס.

לאחר מכן, נתקו בזהירות את כל המכלול מהוופר על ידי משיכת הבסיס. כדי להתחיל, חזרו על תהליך הייצור ששימש עבור המפעילים הביולוגיים עד לשלב חריטת הלייזר. עם זאת, עבור ייצור ביו-רובוטים, השתמשו בתכנון הביו-רובוט במהלך חיתוך הלייזר.

בשלב הבא, הכין את תערובת ה-PDMS עם המיקרו-בלוונים ואת תערובת ה-PDMS עם אבקת הניקל כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף. שפוך בזהירות את התמיסות למכלים נפרדים תוך שימוש במאזניים. הנח את שני המכלים בתא ואקום והורד את הלחץ ל-100 millibar למשך 30 דקות.

לאחר ניקוי הגזים, הניחו את המכלים על פלטה מחממת בטמפרטורה של 40 degrees Celsius, למשך הלילה. השתמשו בסכין גילוח כדי לחתוך את בסיסי הביורובוטים מכל אחד מהפולימרים, בממדים התואמים לגודלו של כל ביורובוט כפי שמוצג כאן. הניחו את בסיס ה-PDMS עם הניקל על פלטה ממתכת, כאשר נייר ניגוב לחדר נקי מונח ביניהן.

לאחר מכן, הפעילו את פורק הקורונה והביאו את קצה הפורק למרחק של 1 סנטימטר מעל הבסיסים. הזיזו את הקצה סביב הבסיס במשך 15 שניות כדי לטפל בפני השטח. חזרו על תהליך זה כדי לטפל בפני השטח של הבסיסים החרוטים בלייזר, למשך אותו זמן.

לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי להניח את הצד של ה-nickel PDMS שעבר טיפול על הצד המטופל של הסרט. המתינו חמש דקות עד שהחלקים יתחברו זה לזה. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה חדה כדי לקלף את קנטילבר הביורובוט מהוופר ולהניח אותו בתחתית בסיס ה-nickel PDMS.

כעת הוצא את כל המכלול מהוופר. כדי לחבר את ה-PDMS של המיקרו-בלון למכלול, ראשית, הנח טיפה קטנה של PDMS שאינו מאובחה מעליו. לאחר מכן, השתמש בפינצטה כדי להניח את צדו של ה-PDMS ניקל שבו נמצא ה-PDMS דקיק על גבי הטיפה של ה-PDMS שאינו מאובחה.

הניחו את כל המכלול בתוך צלחת פטרי מפלסטיק ולאחר מכן הניחו אותה על פלטה מחממת בטמפרטורה של 40 °C להקשחה למשך הלילה. כדי להכין את המכשירים לזריעת תאים, הניחו תחילה 100 µL של תמיסת Fibronectin במרכז בקבוק תרבית T25 נפרד עבור כל מכשיר. לאחר מכן, הניחו את הביורובוט או את המפעיל הביולוגי כשהם פונים כלפי מטה על גבי טיפת תמיסת ה-Fibronectin.

וודאו שהקנטילבר פרוס וטבול בתוך הטיפה, ולאחר מכן דגרו את הבקבוק בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, הסירו את תמיסת ה-Fibronectin ושטפו את המכשירים פעמיים עם PBS. לאחר מכן, הסירו את ה-PBS ומלאו את הבקבוק ב-10 milliliters של DMEM מועשר ב-10% FBS ו-1% penicillin.

דגרו את המכשיר בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת כדי להוציא את הגזים מה-PDMS. לאחר מכן, השתמשו במגנט כדי להחזיק את הביורובוט בתחתית הבקבוק, והניחו את הבקבוק עם הדגימות במקלח אולטרסוני למשך חמש דקות, כדי להסיר בועות אוויר. כדי לקבוע את העובי הנכון של כל שכבת קומפוזיט, נבחנו יחסי ערבוב שונים של ניקל ומיקרו-בלונים ב-PDMS.

שכבת הניקל PDMS מאפשרת בקרה מגנטית ויציבות של הרובוט. בנוסף, שכבת ה-PDMS של המיקרו-בלון מאפשרת לביורובוט לצוף ולשחות באופן יציב. השילוב של שתי השכבות יוצר את מסגרת הייצוב העצמי של הביורובוט.

באמצעות סקריפט מחשב, נותחה היציבות באופן נומרי והוכח כי קיימים מומנט השחזור חזק בשימוש בשיטה דו-שכבתית זו. חשוב לזכור לשמור על הקנטילבר נקי לאורך הליך זה, ולהקפיד על היחס הנכון של תערובת ה-PDMS ועל עובי הקנטילבר. לאחר צפייה בסרטון זה, עליכם להבין כיצד ניתן לעצב חומרים אלסטומריים לכדי קנטילבר דק לתמיכה בתאי שריר לב (cardiomyocytes), וכיצד ניתן לשנות אותם כדי להשיג תכונות חדשות כגון ציפה או מגנטיות עבור פונקציונליות מתקדמת.

ניתן לשנות הליך אימות זה על ידי שילוב של טכניקות אחרות, כגון שימוש בקוביית יישור בעלת תבנית (patterning alignment cubes), במטרה לקדם את אוריינטציית התאים ולהגדיל את הדור הרביעי. יש לזכור שעבודה עם חורטי לייזר עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון לבישת ביגוד ומשקפי מגן מתאימים, בעת ביצוע הליך זה.