שריר הלב מבוססי תא מפעיל ומייצב עצמי ביורובוט - חלק 2
9 במאי 2017
במחקר זה, actuator ביולוגי עצמית התייצבות, biorobot שחייה עם זרועות פונקציונליות אלסטומרי פונקציונלי מזרקים עם cardiomyocytes, מתורבת, ומאופיינת המאפיינים הביוכימיים והביומכניים שלהם לאורך זמן.
המטרה הכוללת של מחקר זה היא לאכלס מכשירים מיקרו-מיוצרים בתאי שריר לב ולאפיין את התכונות הביוכימיות והביומכניות של התאים במכשירים אלה כמו גם את ביצועיהם לאורך זמן. ניתן לשנות את החומר המתואר כאן בקלות לניסויים אחרים הדורשים תוספת תאים בצפיפות גבוהה במכשירים מיקרו-מפוברקים. היתרון העיקרי של הביו-אקטוטור שפותח בסרטון זה הוא שניתן לאמץ אותו בקלות כדי לכמת את כוחות התכווצות התאים מכל סוג תא אחר.
ניתן להשתמש בו גם כדי לחקור את השינויים במאפיינים הביומכניים של תאי גזע כשהם עוברים התמיינות. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את שלבי זריעת התאים עם תיאורים מטקסטים. הם צריכים להתבצע כראוי כדי להבטיח חיבור תאים קונפלואנט על זרועות השלוחה החיונית לתפקוד ביולוגי תקין.
מי שידגים את ההליך יהיה Neerajha Nagarajan מהמעבדה שלי. עם הביו-רובוט, התחל בבקבוק T25. השתמש במגנט כדי להחזיק אותו במקומו בתחתית הבקבוק.
המגנט אינו נחוץ למפעילים הביולוגיים מכיוון שהם לא יזוזו בגלל משקל חרוז הזכוכית בבסיס. גלגלו יריעת פלסטיק מרובעת קטנה לשימוש כמשפך והניחו את המשפך הסטרילי מעל המפעילים בביו-רובוטים. התאם את הקוטר בקצה הרחב יותר כך שיתאים למכשיר ולגובה כך שיתאים היטב כאשר החלק העליון של הבקבוק מהודק.
השתמש בבקבוק נפרד כדי לבדוק ולהתאים את התאמת המשפך. התאמה צמודה של המשפך תבטיח שלא תהיה דליפה של התאים כאמור לשאר המדיה. זה חיוני למתן כיסוי משולב של זרוע השלוחה.
כשהמשפך במקומו, השעו מחדש את הקרדיומיוציטים ב-DMEM מלא בצפיפות של 16 מיליון תאים למיליליטר וזרקו לאט לאט 400 מיקרוליטר מהתרחיף על המכשירים דרך כל משפך. לאחר מכן, העבר לאט את הצלוחיות בחזרה לאינקובטור מבלי להפריע למכשירים או למשפכים שבתוכה. אפשר לתאים להיצמד למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
לאחר תקופת הדגירה, הסר לאט את המשפך. שטפו בעדינות את הדגימות עם PBS ומלאו מחדש כל בקבוק ב-10 מיליליטר DMEM טרי שלם. לאחר מכן, הסר את המגנט מהביו-רובוט כך שהם יהיו צפים והנח את הצלוחיות בחזרה לתוך החממה.
התקן מצלמה המצוידת בעדשת זום בחממה כדי לדמיין את המכשירים בתרבות. לאחר מכן, הוסף פס תאורת LED לשימוש כמקור אור. לאחר מכן, חבר את המצלמה למחשב ופתח את תוכנית ההדמיה.
לאחר הכניסה לתוכנית, לחץ על תמונת המצלמה ב שלח לשונית כדי לפתוח את כל אפשרויות המצלמה ולבחור את המצלמה המחוברת. מרשימת הכרטיסיות, בחר Live והעבר את התמונה למיקוד באופן ידני על-ידי כוונון חוגת העדשה. לאחר מכן, בחר יבול של אזור העניין מהחלונית העליונה.
לאחר מכן, צייר ידנית מלבן במסגרת הווידיאו התוחם את מכשיר המפעיל הביולוגי ואת זרועות השלוחה כדי לסמן את אזור העניין. במקרה של ביו-רובוטים, צלם את כל המסך על מנת להקליט את תנועת השחייה של המכשיר. לאחר מכן, בחר הגדרות מצלמה והגדר את קצב הפריימים על ידי התאמת החשיפה ויחס הפיקסלים של התמונה החיה.
הגדר את קצבי הפריימים לכ-30 פריימים לשנייה. לבסוף, לחץ על כפתור ההקלטה כדי להתחיל להקליט את הסרטונים. פתח את תוכנת התכנות על ידי לחיצה על הסמל.
לאחר הטעינה, לחץ על קובץ, פתח ובחר את קובץ הסקריפט m להפעלת ניתוח תמונה. ודא שתמונות ה-TIF המוקלטות וגרסאות ה-AVI שלהן נמצאות באותה תיקיה כמו קובץ m ולאחר מכן לחץ על הפעל כדי להפעיל את קובץ ה-script. לחץ על הפעל כדי להפעיל את התוכנית בפועל.
לאחר ההפעלה, לחץ על לפתוח כפתור ואתר את קובץ ה-TIF או AVI שעומד להיות מנותח. לאחר מכן, לחץ על כפתור הבסיס. בחר את הנקודה שבה השלוחה מתחברת לבסיס בחלק העליון ולחץ על Enter.
פעולה זו תציב סמן מרובע על התמונה עבור כל מסגרת כדי לציין את מיקום בסיס השלוחה. לאחר מכן, לחץ על כפתור קנה המידה ולאחר מכן לחץ ידנית על קצה אחד של חרוז הזכוכית. הבא את מצביע העכבר לצד הנגדי של חרוז הזכוכית והקש Enter.
זה ישרטט קו המודד את קוטר חרוז הזכוכית ויקשר את הקוטר לפיקסלים המוצגים. לחץ על לחצן ניתוח. לאחר מכן, לחץ לאורך השלוחה במרחק קצר מהסמן המרובע הראשון המייצג את בסיס השלוחה.
המשך ללחוץ לאורך השלוחה כולל הקצה והקש Enter בסיום. פעולה זו תציב X על כל נקודה שנלחצת על השלוחה. לבסוף, בדוק אם העיגול המונח על גבי עוקב נכון אחר פרופיל השלוחה.
אם נכון, לחץ על כפתור המסגרת הבא. פעולה זו תעבור למסגרת הבאה בקובץ TIF. חזור על תהליך זה לכל המסגרות.
לאחר עיבוד כל המסגרות, לחץ על יצוא לחצן. התחל בפתיחת תוכנת ניתוח התמונות וטעינת קובץ הווידאו של ביו-רובוט השחייה. לאחר מכן, פתח את תוכנת הגיליון האלקטרוני.
בסרטון הביו-רובוט הטעון, אתר התייחסות לגודל כגון חרוז הזכוכית. השתמש בכלי ישר כדי לצייר קו על פני חרוז הזכוכית. לאחר מכן לחץ על Analyze ובחר Set Scale.
הגדר את השדה מרחק ידוע ל-3,000 מיקרומטר ולחץ על אישור. בחר נקודה בהתקן שאינה מתנדנדת בין מסגרות כדי לשמש כסמן ורשום את קואורדינטות X ו- Y של נקודה זו בגיליון האלקטרוני. חזור לחלון תוכנת ניתוח התמונות ולחץ על מקש החץ ימינה כדי לעבור למסגרת הבאה. הצבע שוב על הסמן ורשום את קואורדינטות ה- X וה- Y החדשות בגיליון האלקטרוני.
חזור על תהליך זה עבור כל המסגרות והשתמש בנתונים כדי לנתח את תנועת הביו-רובוט כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. הלחצים הסטטיים והדינמיים של המפעיל חולצו ממתח פני השטח מדי יום. מתח סטטי הוא מתח ההתכווצות שהתאים מפגינים על פני השטח במצב מנוחה ולחץ דינמי הוא הלחץ שנוצר על ידי התאים בהתכווצות מקסימלית.
ככל שהתאים התבגרו בתרבית, נצפתה עלייה הדרגתית במתחים סטטיים ודינמיים לאורך זמן. הם הפגינו כוח משיכה מקסימלי של 50 מילי-ניוטון למטר וכוח התכווצות מרבי של כ-165 מילי-ניוטון למטר ביום השישי. במקביל ללחצים הסטטיים והדינמיים, סמנים להתבגרות, גדילה והתפשטות של קרדיומיוציטים, וקישוריות בין תאים גדלים גם הם עד היום השישי.
בהתבסס על ניתוח הווידאו, מוצגת כאן ההשוואה בין מהירות השחייה הממוצעת, תדירות הפעימות והמרחק שנע בכל מהלך עבור שלושה ביו-רובוטים עם פרופילי שחייה שונים. למרות שלביו-רובוטים האנכיים יש את תדירות הפעימות הקטנה ביותר, הם הציגו את מהירות השחייה והמרחק הגבוהים ביותר. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לזרוע תאי שריר לב במכשירים מיקרו-מיוצרים שיכולים לתפקד כמפעילים ביולוגיים וביו-רובוטים.
תהליך רכישת התמונה וניתוח הנתונים שלאחר מכן המתואר בסרטון זה מדגים דרך נוחה לאפיין את התנהגות התא כמו גם את ביצועי המכשיר. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שתוחלת החיים של הקרדיומיוציטים מוגבלת ופעילות התאים מגיעה לשיאה ביום השישי. לאחר מכן, הוא פוחת עם הזמן.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מתמקד באכלוס מכשירים המיוצרים במיקרו-פבריקציה בתאי שריר לב, ואפיון תכונותיהם הביוכימיות והביומכניות לאורך זמן. הביו-אקטואטור שפותח יכול לכמת כוחות התכווצות של תאים ולבחון דיפרנציאציה של תאי גזע.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מפעילים ביולוגיים
- תרבית קרדיומיוציטים
- אפיון ביו-מכני
רקע
- התקנים המיוצרים במיקרו-פבריקציה חיוניים לחקר התנהגות תאים.
- תאי שריר הלב (cardiomyocytes) הם קריטיים להבנת תפקוד הלב.
- אפיון תאים על התקנים אלה יכול לחשוף תובנות חשובות.
- זריעה נכונה של תאים היא קריטית לתפקוד ביולוגי.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה להוספת תאים בצפיפות גבוהה על גבי התקנים שיוצרו במיקרו-פבריקציה.
- אפיון ביצועיהם של קרדיומיוציטים לאורך זמן.
- מתן הדגמה חזותית של טכניקות לזריעת תאים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- זריעה של קרדיומיוציטים על זרועות קנטילבר אלסטומריות.
- גידול וניטור של תכונות ביוכימיות.
- הערכת תכונות ביומכניות לאורך זמן.
- הדגמות חזותיות לסיוע בלמידת טכניקות זריעה של תאים.
תוצאות עיקריות
- זריעה מוצלחת של קרדיומיוציטים על גבי התקנים המיוצרים במיקרו-פבריקציה.
- השגת אפיון של תכונות ביוכימיות וביומכניות.
- הוכחת יכולת לכימות כוחות התכווצות של תאים.
- שיטה הניתנת להתאמה לסוגי תאים ולמחקרים אחרים.
מסקנות
- הביואקטואטור שפותח יכול לשמש עבור סוגי תאים שונים.
- שיטות ויזואליות משפרות את ההבנה של זריעת תאים מורכבת.
- הממצאים תורמים לתחום הנדסת הרקמות והרפואה הרגנרטיבית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
עבודה זו מבססת פלטפורמה ניתנת להרחבה לכימות כוחות התכווצות של קרדיומיוציטים, המאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית בתהליכי תיקוף מטרות בלב ובסריקה פנוטיפית. על ידי אספקת תוצרי קריאה ביומכניים כמותיים, היא תומכת בביטחון חיזוי בזיהוי מובילים ובבחירת מודלים פרה-קליניים לטיפולים קרדיווסקולריים. יכולת ההתאמה של המערכת לסוגי תאים אחרים מגבירה את התועלת ממנה לאורך תהליכי גילוי הדורשים הערכה תפקודית של רקמות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות מדידה ישירה של כוחות כיווץ הנוצרים בתאים כקריאה תפקודית של מעורבות המטרה (target engagement).
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי כימות הבשלת קרדיומיוציטים והשתלבות תפקודית לאורך זמן, ובכך מפחית עמימות לגבי מנגנון המטרה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר פלטים ביומכניים כמותיים וסטנדרטיים (מאמץ סטטי/דינמי, תדירות פעימות, מהירות שחייה) המתאימים לפיתוח בדיקות ולסריקת תרכובות.
- ערך תפעולי: מבטיח מוכנות של הבדיקה באמצעות זריעה רפרודוקטיבילית של תאים ויצירת שכבה רציפה (confluent sheet), מה שמאפשר הערכה מהימנה של תרכובות במחקרים על מערכת הלב וכלי הדם.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מספק תובנות על מערכות הרלוונטיות למחלה על ידי קישור סממנים של הבשלה של cardiomyocyte לביצועים פונקציונליים, ובכך תומך בהתאמה של סמנים ביולוגיים תרגומיים.
- ערך תפעולי: מסייע בקבלת החלטות על קידום פרויקטים מותאם סיכון באמצעות מעקב אחר הירידה הפונקציונלית לאחר שיא הפעילות, ובכך מספק מידע על המשכיות פרה-קלינית ותיעדוף תיקי פיתוח.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף מטרות מוקדם דרך זיהוי מובילים ועד להערכה פרה-קלינית, ומספקת נתונים תפקודיים המנחים החלטות של המשך או הפסקת התהליך (go/no-go) בכל שלב.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים ביולוגיים על ידי קורלציה בין הפרעות גנטיות או פרמקולוגיות לבין שינויים בכוח התכווצות ובסטרס תאי.
- סריקה: מספקת מוכנות של המערך ושחזוריות באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים לזריעת תאים ומדדים ביומכניים כמותיים לאורך מספר נקודות זמן.
- אנליטיקה: מספקת מדידות מפושלות בזמן של סטרס סטטי/דינמי, תדירות פעימות ומדדי דחף, המאפשרים ניתוח השוואתי של השפעות תרכובות או מודיפיקציות גנטיות.
- מחקר תרגומי: מקשר בין הגילוי לוולידציה פרה-קלינית על ידי הדגמת רציפות בבשלות תפקודית של קרדיומיוציטים ומעקב אחר ביצועים מבוסס מכשיר.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כפלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר וניתנת להתאמה לסוגי תאים ולמערכי מחקר שונים, תוך מקסום ה-ROI באזורי טיפול תרפויטיים מרובים.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזוי באמצעות אפיון ביומכני כמותי ורזולוציית זמן של כיווצות התאים והבשלתם.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ויכולת הרחבה באמצעות פרוטוקולי זריעה, דימות ואנליזה מוגדרים הממזערים שונות התלויה במשתמש.
- ערך אסטרטגי: משפר קבלת החלטות מסוג go/no-go על ידי הפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים, באמצעות הפחתת סיכונים פונקציונלית מוקדמת של יעדים לבביים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם-סיכון על ידי אספקת מדדים כמותיים ואובייקטיביים להשוואה בין מועמדים מובילים או מודלים של מחלות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרביות ראשוניות של קרדיומיוציטים, טיפול במיקרו-פבריקציה וניתוח תמונות בשיטת time-lapse.
- תלוי בגישה לאינקובטורים בעלי יכולות דימות, עדשות זום, תאורת LED ותוכנה למעקב אחר תנועה וחישוב מאמץ.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים של צפיפות הזריעה, ייצור המשפעות והגדרות קצב הפריימים כדי להבטיח תוצאות הדירות בין אתרים.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבה לסוגי תאים שאינם קרדיומיוציטים, כולל פונקציונליזציה של פני השטח ולוחות זמנים לבשלות.
- מוגבל על ידי תוחלת החיים הסופית של קרדיומיוציטים ראשוניים, כאשר שיא הפעילות נצפה סביב היום השישי, מה שמחייב ביצוע ניסיוני בעיתים הנכונות.
שאלות נפוצות בנושא ביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:14
Cell Seeding and Culture of the Biorobots and Actuators
2:52
Imaging Biorobots and Actuators
4:14
Image Analysis of the Biological Actuators on a Stationary Base
6:01
Analysis of Swimming Biorobots
7:20
Results: Biomechanical Analysis of Cardiomyocyte-loaded Actuators and Biorobots
8:41
Conclusion
