קביעת קינטיקה מחייב אנטיגן נוגדן גבוהה זיקה באמצעות ארבע פלטפורמות biosensor

מטרת מחקר ביו-חיישנים זה היא להשוות את היכולת של ארבע פלטפורמות החיישנים הביולוגיים המשמשות באופן שגרתי לספק נתונים קינטיים איכותיים ולספק תובנות לגבי אתגרים טכניים ושיקולים בעיצובים ניסיוניים להערכת אינטראקציות נוגדנים-אנטיגן בעלות זיקה גבוהה. מחקר זה עונה על שאלות מפתח בתחום גילוי התרופות לבחירת פלטפורמות חיישנים ביולוגיים ופורמטי בדיקה המאפשרים את התוצאות האמינות ביותר בעת הערכת מועמדים לנוגדנים טיפוליים. היתרון העיקרי של מחקר זה הוא בכך שהוא מספק השוואה ישירה ומקיפה בין פלטפורמות החיישנים הביולוגיים השונות, בכל הנוגע לעקביות הנתונים, איכותם ויעילותם התפעולית.

הדגמת וידאו של ארבעת הפרוטוקולים היא קריטית, מכיוון שהיא עוזרת למשתמשים חדשים עם ניסיון מעשי מועט ללמוד כיצד להגדיר ניסויים במכשירים אלה. למדידות קינטיות ב- Biacore T100, לחץ על קובץ, פתח שיטה חדשה ופתח את קובץ השיטה. סקור את הפרמטרים בשיטה.

בסוגי מחזורים, הגדר את זמן המגע ל-220 שניות ללכידה 1 מעל נתיב זרימה 2, 110 שניות ללכידה 2 מעל נתיב זרימה 3 ו-55 שניות ללכידה 3 מעל נתיב זרימה 4. קצב הזרימה הוא 10 מיקרוליטר לדקה עבור כל מחזורי הלכידה. בחר דוגמה 1 וסמן פתרון לדוגמה כמשתנה.

לאחר מכן, הגדר את זמן המגע ל-600 שניות, ואת זמן הניתוק ל-2, 700 שניות על נתיב זרימה 1, 2, 3, 4. קצב הזרימה מוגדר ל -30 מיקרוליטר לדקה. לאחר מכן, בחר התחדשות 1, הזן גליצין HCl pH 1.5 בשדה התמיסה, והגדר את זמן המגע ל-20 שניות על נתיב זרימה 1, 2, 3, 4.

בהגדרות משתנות, הזן ריכוזי טיטרציה כפולים של 100 ננו-מולרי עד 6.25 ננו-מולרי עבור מחזור 1-3, 50 ננו-מולרי עד 3.12 ננו-מולרי עבור מחזור 4-8, ו-5 ננו-מולרי עד 0.323 ננו-מולרי עבור מחזור 9-10. בהפעלת התקנה, בחר את נתיב זרימת הזיהוי 2-1, 3-1, 4-1 ולאחר מכן לחץ על הבא. בדוק את ה-prime לפני ההפעלה ולאחר מכן לחץ שוב על הבא.

בחר Sample and Reagent Rack 1 והגדר את המיקום עבור הריאגנטים. הכניסו את הריאגנטים לבקבוקוני הדגימה הבודדים בהתאם והכנסו את המתלה למכשיר. נקישה הוצא מתלה כדי לפתוח את דלת תא מגש הדגימה ולאחר מכן הכנס את מתלה הדגימה למכשיר.

לאחר מכן לחץ על התחל והזן שם ניסוי שיישמר כדי להתחיל את הריצה. עבור המדידות הקינטיות ב-ProteOn XPR36, התחל אימוביליזציה על ידי בחירת פרוטוקולים ולאחר מכן דגימות. הגדר EDC/Sulfo-NHS כמפעיל בבארות H1-H6, חלבון A/G כליגנד ב-G1-G6, אתנולאמין כמנטרל ב-F1-F6, גליצין כמחולל ב-E1-E6, PBS-T-EDTA כריק ב-D1-D6, דגימת נוגדן X חד-שבטי כליגנד ב-C1-C6, ו-PCSK9 אנושי כאנליט בבארות B1-B6.

בחר שלבים ולאחר מכן לחץ פעמיים על אימוביליזציה בעורך הפרוטוקולים. השלבים כוללים שלוש זריקות אופקיות עוקבות של EDC/Sulfo-NHS, חלבון A/G ואתנולמין מולארי אחד. כל הזרקה צריכה להיות בעלת קצב זרימה של 30 מיקרוליטר לדקה וזמן מגע של 300 שניות.

לאחר מכן, לחץ על צור מחדש. הזרקו שלוש פעימות של 18 שניות של גליצין במהירות של 100 מיקרוליטר לדקה הן בכיוון האופקי והן בכיוון האנכי. עקוב אחר זה עם שני פולסים של 60 שניות של PBS-T-EDTA ב-25 מיקרוליטר לדקה, גם בשני הכיוונים.

לאחר מכן, לחץ על ליגנד והזריק נוגדן חד שבטי 1, נוגדן חד שבטי 2 בכיוון האנכי, תוך שימוש בקצב זרימה של 25 מיקרוליטר לדקה וזמן מגע של 160 שניות. לאחר לחיצה על Analyte, הזריק חמישה ריכוזים של PCSK9 אנושי במאגר ריק על פני שישה ערוצים אופקיים בו זמנית. השתמש ב-40 מיקרוליטר לדקה למשך 600 שניות של זמן אסוציאציה, ולאחר מכן 2,700 שניות של זמן דיסוציאציה.

לאחר מכן, לחץ על התחדש והזריק שני פולסים של 18 שניות של גליצין במהירות של 100 מיקרוליטר לדקה הן בכיוון האופקי והן בכיוון האנכי. לאחר מכן, הכינו את הדגימות והריאגנטים בצלחת אחת של 96 בארות בהתאם למיקומי הריאגנטים המוגדרים. העבר את הצלחת למכשיר ולאחר מכן לחץ על הכרטיסייה הפעלה, בחר את הפרוטוקול ולחץ על התחל.

מודגמת הזרקה מקבילה של שש מחטים בהקלטה של נתוני ניסוי חיים. עבור המדידות הקינטיות ב-Octet RED384, הגדר את השיטה הניסיונית על ידי לחיצה תחילה על ניסוי, ולאחר מכן אשף ניסוי חדש, ניסוי קינטיקה חדש, ולאחר מכן קינטיקה בסיסית בתוכנת רכישת הנתונים. לאחר מכן לחץ על שנה צלחות ושנה 96 בארות ל-384 בארות הן בלוח 1 והן בלוח 2.

הגדר את סוגי הדגימה והמיקומים בלוח כמתואר בפרוטוקול הטקסט. נווט אל הגדרת הבדיקה כדי להגדיר את הגדרת הניסוי. מערך הניסוי מוגדר כזמן בסיס של 30 שניות, זמן התחדשות של 30 שניות, זמן שיווי משקל של 18 שניות, טעינה עם זמן של 200 שניות, זמן אסוציאציה של 500 שניות וזמן דיסוציאציה של 1,800 שניות.

מהירות הטלטול מוגדרת ל-1,000 סל"ד. כדי להוסיף את השלבים לרשימת שלבי הבדיקה, ראשית, לחץ על שלב ולאחר מכן לחץ על הבארות הממוקמות במדגם או בלוחית המגיב. ראשית, הזן את הוראות התחדשות שיווי המשקל כדי להתנות מראש את חיישני לכידת ה-Fc האנטי-אנושיים בשלושה מחזורים של טבילות של 15 שניות בגליצין לסירוגין עם טבילות של 15 שניות ב-1XKB.

לאחר מכן, הזן את הוראות הטעינה כדי ללכוד את דגימות הנוגדנים החד-שבטיים על חיישני לכידת ה-Fc האנטי-אנושיים למשך 200 שניות. לאחר מכן, הזן את הוראות הבסיס כדי לבסס את אות האינטרפרומטריה של השכבה הביולוגית למשך 60 שניות לפני שלב השיוך. הזן את שלב האסוציאציה כדי לטבול את החיישנים בבארות המכילות ריכוזים משתנים של PCSK9 אנושי למשך תקופת אסוציאציה של 500 שניות.

היכנס לשלב הדיסוציאציה כדי לטבול את החיישנים הקשורים ל-PCSK9 לבארות חדשות של 1XKB לתקופת דיסוציאציה של 1, 800 שניות. לבסוף, לשלב ההתחדשות, טבלו את החיישנים הקשורים לנוגדנים חד-שבטיים PCSK9 לבארות גליצין עם שני פולסים של 18 שניות בין כל מחזור קשירה. עבור/י אל ״סקירת ניסויים״, החלק/י בין השלבים ולאחר מכן לחץ/י על כפתור הפתיחה הירוק כדי לפתוח את תא הדגימות.

העבירו את לוחות הדגימה לתוך המכשיר. נווט אל הפעל ניסויים, הזן זמן השהיה של 60 שניות ונער את לוחית הדגימה בזמן ההמתנה. הגדר את טמפרטורת הצלחת ל-25 מעלות צלזיוס, הזן את שם הפעלת הניסוי ולאחר מכן לחץ Go.Live איסוף הנתונים מוצג כאן.

למדידות קינטיות רב-מחזוריות ב-IBIS-MX96, התקן את שבב החיישן לתוך המיקרו-ספוטר הזרימה הרציפה. פתח את תוכנת CFM2.0 ולאחר מכן לחץ על הגדרות טעינה ו-96 Amine Couple. הנח את שתי לוחות הדגימה והמגיב למדפסת CFM.

כדי ליצור את מערך הנוגדנים, לחץ על הפעלה כדי להפעיל את המדפסת ולהעביר את ה-EDC/Sulfo-NHS במחצית העליונה של לוחית הריאגנט לחיישן באמצעות 48 מיקרו-ערוצים ולמחזר אותם על פני החיישן למשך חמש דקות. העבירו את דגימות הנוגדנים החד-שבטיים במחצית העליונה של לוחית המקור לחיישן, והעבירו אותן על פני המשטחים המופעלים למשך 10 דקות. לאחר מכן, העבירו את מאגר הקיבוע מצינור חרוטי של 50 מיליליטר על פני הנוגדן למשך חמש דקות.

עגן את שבב החיישן המודפס לתוך המכשיר. בתוכנת הבקרה, לחץ על קובץ, פתח מדידה, מדידה קיימת ובחר את קובץ השיטה. העבר את שבב החיישן המודפס למכשיר.

בתפריט הכללי, בחר G-System Prime תחת סקריפט מערכת מלא. לאחר מכן, בחר G-Quench כדי לנטרל את משטחי הנוגדנים החד-שבטיים על ידי הזרקת 150 מיקרוליטר של אתנולמין מולארי אחד. במחזור הניתוח, בחר A-AP Standard Run תחת קבצי Script של IBIS.

הגדר 1.0 דקות לנקודת ההתחלה, 10.0 דקות לאסוציאציה ו-90 צעדים לדיסוציאציה במהירות של שמונה מיקרוליטר לשנייה. בתוך המחזורים, הזריק PCSK9 אנושי בריכוז אחד בכל פעם, לאחר חמש זריקות חיץ. לחדש את משטחי הנוגדנים החד-שבטיים עם גליצין בין כל מחזור קשירה.

חיישני קשירה רשומים בשכבות התאמה של מודל קינטי אחד לאחד מוצגות עבור הנוגדנים המקיימים אינטראקציה עם PCSK9 אנושי בארבעה מכשירים. פרופילי הקישור של הנוגדנים בצפיפות מרובה דומים בין המכשירים. למרות שקבועי הקצב הקשורים לכל אחד מהנוגדנים השתנו בין המכשירים, סדרי הדירוג שלהם נותרו כמעט זהים.

נבדקה יכולת השחזור והעקביות של זיקות בשיעורים קינטיים על פני משטחי נוגדנים מרובים. כפי שמוצג כאן, נצפתה ליניאריות חזקה עבור כל קבועי הקצב שנוצרו באמצעות Biacore T100 ו-ProteOn XPR36. עם זאת, קבועי הקצב שנוצרו על ידי Octet RED384 היו פחות ליניאריים עקב תנודות בחלק משיעורי היציאה מהם.

זה נגרם באופן פוטנציאלי על ידי אידוי דגימה לאורך זמן במיקרו-לוחית. קבועי הקצב שנוצרו על ידי IBIS-MX96 היו גם פחות ליניאריים עקב תנודות בהטרוגניות פני השטח. פעילויות קשירת הנוגדנים הקשורות לרוב המערכות היו עקביות, בעוד שפעילות נמוכה פי עשרה נצפתה בשיטה המצומדת לאמין מ-IBIS-MX96.

ייתכן שהדבר נבע מהשבתת נוגדנים, או יצירת כיווני נוגדנים שלא היו מוליכים לקשירת אנטיגן. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להגדיר ניסויים בכל אחת מארבע פלטפורמות החיישנים הביולוגיים, וכיצד לבחור טכנולוגיית חיישנים ביולוגיים מתאימה למטרת המחקר שלכם. מחקר ההשוואה ראש בראש שלנו מראה שלכל פלטפורמת חיישנים ביולוגיים יש יתרונות וחסרונות משלה.

למרות מגבלות שיטתיות מובנות מסוימות במכשירים, הסדר הישיר של קבועי קצב האסוציאציה והדיסוציאציה היה בקורלציה גבוהה בין הכלים הללו. לצורך דירוג המועמדים, בהנחה שמספר הדגימות וכמות החומרים אינם גורמים מגבילים, ניתן להשתמש בכל אחד מהמכשירים הללו, מכיוון שהם יכולים להבדיל בין הנוגדנים באופן דומה, ללא קשר למכשיר הייבוא. יש פשרה בין אמינות הנתונים לתפוקת הדגימה.

Biacore T100, ואחריו ProteOn XPR36R, הציגו את איכות הנתונים והעקביות הטובות ביותר. ואילו Octet RED384 ו-IBIS-MX96 מפגינים גמישות ותפוקה גבוהות עם פשרות בדיוק ועקביות הנתונים. למחקרים הדורשים זיהוי רגיש ואמין, Biacore T100 או ProteOn XPR36 הם המתאימים ביותר.

למחקרים שבהם מהירות היא גורם קריטי ומעורבים מספר רב של דגימות, עדיף Octet Red384 או IBIS-MX96. מכשירים עם נוזל זרימה רציפה X מספקים נתונים באיכות גבוהה לפתרון אינטראקציות עם שיעורי דיסוציאציה איטיים. המגבלה העיקרית של מכשיר ה-BRI fluid ex-a-fray היא אידוי הדגימה לאורך זמן במיקרו-פלטה, מה שעלול לגרום לסחיפה כלפי מעלה, ולפגוע בדיוק הנתונים.