Name: קביעת קינטיקה מחייב אנטיגן נוגדן גבוהה זיקה באמצעות ארבע פלטפורמות biosensor (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 27 s
Description: למדו לבצע מדידות קינטיקה של אינטראקציות נוגדן-אנטיגן באמצעות ארבע פלטפורמות ביוסנסור שונות. הפרוטוקולים המוצגים מסייעים לחוקרים לבחור את הפלטפורמה המתאימה ביותר לפיתוח תרופות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים נח כנ&quot;ל ואדם מיילס לקבלת סיוע טכני על MX96 IBIS.

<ol><li>Cooper, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+biosensors+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Optical biosensors in drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 1 (7), 515-528 (2002).</li>
<li>Van Regenmortel, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+antigen-antibody+interactions+with+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Rec%22%5BJournal%5D)">Measurement of antigen-antibody interactions with biosensors.</a> J Mol Rec. 11 (1-6), 163-167 (1998).</li>
<li>Davidoff, S. N., Ditto, N. T., Brooks, A. E., Eckman, J., Brooks, B. D. Surface Plasmon Resonance for Therapeutic Antibody Characterization. Label-Free Biosensor Methods in Drug Discovery. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://link.springer.com/10.1007/978-1-4939-2617-6_3">http://link.springer.com/10.1007/978-1-4939-2617-6_3</a> 35-76 (2015).</li>
<li>Canziani, G. A., Klakamp, S., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+screening+of+antibodies+from+crude+hybridoma+samples+using+Biacore%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Kinetic screening of antibodies from crude hybridoma samples using Biacore.</a> Anal Biochem. 325 (2), 301-307 (2004).</li>
<li>Katsamba, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+high-affinity+antibody%2Fantigen+interaction+performed+by+multiple+Biacore+users%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a high-affinity antibody/antigen interaction performed by multiple Biacore users.</a> Anal Biochem. 352 (2), 208-221 (2006).</li>
<li>Abdiche, Y. N., Malashock, D. S., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+blocking+assays+using+Octet%2C+ProteOn%2C+and+Biacore+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Exploring blocking assays using Octet, ProteOn, and Biacore biosensors.</a> Anal Biochem. 386 (2), 172-180 (2009).</li>
<li>Abdiche, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Epitope+Binning+Assays+on+Label-Free+Array-Based+Biosensors+Can+Yield+Exquisite+Epitope+Discrimination+That+Facilitates+the+Selection+of+Monoclonal+Antibodies+with+Functional+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Epitope Binning Assays on Label-Free Array-Based Biosensors Can Yield Exquisite Epitope Discrimination That Facilitates the Selection of Monoclonal Antibodies with Functional Activity.</a> PLoS ONE. 9 (3), e92451(2014).</li>
<li>Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+monoclonal+antibody+market%5BTitle%5D)+AND+%22mAbs%22%5BJournal%5D)">The therapeutic monoclonal antibody market.</a> mAbs. 7 (1), 9-14 (2014).</li>
<li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher-throughput%2C+label-free%2C+real-time+molecular+interaction+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis.</a> Anal Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).</li>
<li>Keighley, W. <a target="_blank" href="http://www.ddw-online.com/p-149288">The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process.</a> Drug Disc World. 12 (3), 39-45 (2011).</li>
<li>Lad, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+kinetic+screening+of+hybridomas+to+identify+high-affinity+antibodies+using+bio-layer+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">High-throughput kinetic screening of hybridomas to identify high-affinity antibodies using bio-layer interferometry.</a> J Biomol Screen. 20 (4), 498-507 (2015).</li>
<li>Bravman, T., Bronner, V., Nahshol, O., Schreiber, G. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/s12195-008-0036-4">The ProteOn XPR36TM Array System-High Throughput Kinetic Binding Analysis of Biomolecular Interactions.</a> Cell Mol Bioeng. 1 (4), 216-228 (2008).</li>
<li>Eddings, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+continuous-flow+print+head+for+micro-array+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Improved continuous-flow print head for micro-array deposition.</a> Anal Biochem. 382 (1), 55-59 (2008).</li>
<li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor+the+Octet%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor the Octet.</a> Anal Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).</li>
<li>Abdiche, Y. N., Lindquist, K. C., Pinkerton, A., Pons, J., Rajpal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+ProteOn+XPR36+biosensor+into+a+36-ligand+array+expedites+protein+interaction+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Expanding the ProteOn XPR36 biosensor into a 36-ligand array expedites protein interaction analysis.</a> Anal Biochem. 411 (1), 139-151 (2011).</li>
<li>Rich, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+benchmark+study+using+affinity-based+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A global benchmark study using affinity-based biosensors.</a> Anal Biochem. 386 (2), 194-216 (2009).</li>
<li>Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+biosensor+platforms+in+the+evaluation+of+high+affinity+antibody-antigen+binding+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics.</a> Anal Biochem. 508, 78-96 (2016).</li>
<li>Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dataset+of+the+binding+kinetic+rate+constants+of+anti-PCSK9+antibodies+obtained+using+the+Biacore+T100+ProteOn+XPR36%2C+Octet+RED384%2C+and+IBIS+MX96+biosensor+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Data+in+Brief%22%5BJournal%5D)">Dataset of the binding kinetic rate constants of anti-PCSK9 antibodies obtained using the Biacore T100 ProteOn XPR36, Octet RED384, and IBIS MX96 biosensor platforms.</a> Data in Brief. 8, 1173-1183 (2016).</li>
<li>Bouvier, E. S. P., Koza, S. M. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0165993614001952">Advances in size-exclusion separations of proteins and polymers by UHPLC.</a> Trends Anal Chem. 63, 85-94 (2014).</li>
</ol>

עמלות פרסום עבור וידאו-במאמר זה שולמו על ידי Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals.

ראש-בראש מחקר ההשוואה שלנו מראה כי כל אחת מפלטפורמות biosensor יש עוצמות וחולשות משלו. למרות הפרופילים המחייבים של הנוגדנים דומים ידי השוואה ויזואלית (איורים 3 - 6), ואת סדר הדירוג של קבועי קצב הקינטית רכש הם מאוד עקביים המכשירים (איור 7), התוצאות שלנו מראות כי SPR מבוססים מכשירים עם fluidics זרימה הרציף) טוב יותר בפתרון אינטראקציות זיקה גבוהה עם שיעורי ניתוק איטיים. להיסחף כלפי מעלה במהלך שלב הניתוק הוא ציין מערכי נתונים (למשל, מב 2, מב 5, ו מב 9; איור 5) שנוצר על ידי מכשיר fluidics ללא BLI. ממצא זה ניתן לייחס במידה רבה אידוי מדגם לאורך זמן microplate, שהינה מגבלה עיקרית של המערכת. עם ההגבלה הטבועה הזו, בפעם ניסיון גם מוגבלת פחות מ 12 h; ולכן הניסויים תוכנתו עם shפעמי orter (עמותה של 500 ו 30 ניתוק דקות) בהשוואה לאלו של פלטפורמות האחרות (עמותת 10 דקות ו 45 ניתוק דקות). עם זאת, קיצור זמן הניסוי לא הופיע כדי להקטין את ההשפעה של אידוי על נתוני איכות / עקביות, כמו קבועי קצב שנוצר על ידי מכשיר המבוסס BLI להראות פחות ליניאריות כתוצאה מתנודות חלק מחוץ שיעורי (איור 8C ). בנוסף אידוי מדגם, ההבדלים ריאגנטים הלכיד בשימוש אולי תרמו גם להבדלים בתוצאות שהתקבלו. בעוד חלבון A / G שמש בכל שלוש פלטפורמות SPR מבוסס fluidics, חיישני AHC שמשו פלטפורמת BLI הלא fluidics. מאז חלבון A / G הוא עלול להיות בעל זיקה חלשה עבור מהבז מ עושה AHC, משטח biosensor מבוסס נוגדנים, אשראי החוץ-השיעורים במתחם מב-אנטיגן מן משטחי החלבון A / G עשויה להופיע מהר מלאכותית מאלה המתקבל משטח AHC. אפשרות זו נתמכת בy נתוני הניסוי מראים כי הערכים מחוץ השיעור שנוצרו על ידי פלטפורמת BLI היו נמוכים באופן עקבי מאלה המתקבלים מכשירים האחרים (איור 7, קו אדום). אף על פי כן, הפלטפורמה BLI יש יתרונות שונים על פני פלטפורמות אחרות. לדוגמא, הוא גמיש מאוד לגבי בחירת חיישן ותצורת assay בשל החיישנים טרום מצופה השונים לשימוש מיידי. בניסויים שלנו, שימוש בחיישני AHC בטל את הצורך בצעדים וקיבוע ליגנד, צמצום זמן ההכנה. יתר על כן, פלטפורמת BLI דורשת הרבה פחות תחזוקה לעומת פלטפורמות SPR fluidics האחרות, הכוללות תצורות מתג צינורות וערך מסובכות. תכונה זו מהווה יתרון עבור ניסויים הכוללים דגימות גולמיות שיכול לגרום לבעיות סתימה וזיהום. ככל שהביקוש זיהוי יעיל, מהיר, מדויק של עליות מועמדים טיפולית, את הצורך דותפוקת osensor גם עולה. בין ארבע פלטפורמות biosensor, התפוקה מן biosensor מסוגל 96-ליגנד הדפסת מערך הוא הגבוה ביותר, ואחריו biosensor מצמיד לתבנית 36-ליגנד מזגזגי biosensor המבוסס BLI עם הודעה סימולטני ערוץ 16, אשר בסופו של דבר להגדיל מספר האינטראקציות נמדדו מחזור מחייב יחיד 96, 36 ו 16, בהתאמה. ותפוקה אלה גבוהות משמעותיים מזה של פלטפורמת SPR המסורתית, אשר מוגבלת על ידי בעל תאי זרימה ארבע בלבד מחוברים באמצעות זרימת סדרה יחידה. מאז הניסויים שלנו מעורב סט מדגם קטן יחסית של 10 מבזים העריכו בצפיפויות משטח מרובות עם פעמי ניתוק ארוכות, throughputs אינסטרומנטלי שחק תפקיד מתון בקביעת היעילות של הניסויים. לא היו הבדלים משמעותיים פעמים הניסיוניות של השלוש פלטפורמות תפוקה גבוהה, ובכל מקרי הניסויים הושלמו ביום אחד. מצד השני, ניסויי SPR זרימת סדרתי המסורתיים נדרשים 3 ימים כדי להשלים, למרות אוטומצית הליכה משם רכישת נתונים לאחר התקנה. במחקרים אחרים הכרוכים מספר רב של דגימות (כלומר במאות או אלפי), עבור בדירוג מחוץ שיעור / הקינטית למטרות הקרנה או אפיטופ binning, התפוקה הופכת לגורם קריטי. למרות התפוקה ב MX96 IBIS היא סדר הגודל גבוהה יותר מזה של החיישנים הביולוגיים האחרים ולכן הוא בחירה אופטימלית עבור מטרות אלה, יש לו כמה חסרונות. בפרט, הדפסת המערך ידי CFM מציגה סתירות משטח גדולות (איור 1) ואת שחזור נתונים מופחת (איור 8D ו 8E). עבור מדידות הקינטית מדויקות, בסכום של ליגנד על פני שטח biosensor הוא פרמטר קריטי כי צריך להיות מבוקרים על מנת להבטיח כי התגובות המחייבות אינן מוטרדות גורמים משניים כגוןהעברה או הפרעה סטרית המונית. עבור Biacore T100 ו ProteOn XPR36, רמות L R האופטימלי נקבעו בהתבסס על חישוב התקן של ערכי מקסימום R הסט כמתואר במאמר המחקר 17. מצד שני, עבור פלטפורמות אוקטט RED384 ו IBIS MX96, רמות ללכוד מב הושגו באופן אמפירי באמצעות סדרה של 2 פי בדילול נוגדנים סדרתי בזמנים קבועים. חוסר ידע או שליטה של הצעד ללכוד הביא משטח בצפיפות גבוהה אותות תגובה מחייבים גבוהים (איור 2) שאולי נפגעת הדיוק של קבועי קצב הקינטית. יתר על כן, ההפרדה של המדפסת ממגלה SPR אתגר גם בעת ביצוע מדידות מחזור מחייב מספר מעורבים regenerations. הדרך היחידה לבצע את התקנת קינטיקה רב מחזור הייתה דרך צימוד אמין ישיר של מבז, להבדיל ללכוד דרך Fc מב ידי חלבון המשותק / Gשטח של פלטפורמות biosensor השלוש אחרים. כתוצאה מכך, ניסוי צופיות התחדשות נוסף נדרש לקבוע את תנאי התחדשות האופטימליים. התוצאה של התקנה זו נמצאה קשורה% ~ 90 פעילות שטח נצפה נמוכות לעומת השיטה ללכוד FC (איור 9), בנוסף לזמן הניסיון כבר. כדי לבצע את השיטה ללכוד FC, גישה הקינטית חלופה חד מחזור אומץ. גישה זו כוללת הזרקה הרציפה של אנליטי להגדיל ריכוזים ללא התחדשות בין כל הזרקה (איור 2). גישה נוחה מאוד זה, אבל פחות מיושם בדרך כלל לא רק קיצרו את זמן הניסוי והפחתה של צריכת מגיב, אלא גם הפיק קבועי קצב הקינטית מאוד דומים לאלה של חיישנים ביולוגיים אחרים (איור 7). לכן, החלת גישת קינטיקה חד מחזור זה מתגבר על מגבלת התצורה גלומה במכשיר ומציגהזדמנות להשגת קבועי קצב הקינטית ברזולוציה גבוהה באופן תפוקה גבוהה. למרות התפוקה להיות מגבלה עיקרית של Biacore T100, התוצאות שלנו קולקטיביות להראות כי היא הצמיחה את הנתונים העקביים ביותר עם האיכות הגבוהה ביותר. זה היה ואחריו ProteOn XPR36, אשר יש ~ 10 של פי תפוקה גבוהה יותר. יכולתי ליצור נתונים איכותיים הופך יתרון כאשר מאפיינים אינטראקציות גבוהה זיקה-אנטיגן נוגדן שיכול להיות מאתגר מבחינה טכנית כאשר מגבלות זיהוי המכשירים הם הגיעו. בעוד המגבלות השיטתיות מכשור של RED384 אוקטט לעכב מדידה המדויקת של קבועי קצב דיסוציאציה (כלומר, נפילה קצרה של הרגישות לפתור ריקבון אות מספיק איטי מחוץ שיעורים), הן Biacore T100 ו ProteOn XPR36 יכול לספק רגישות ואמינה איתור לבידול.

רכישת פרמטרים קינטיים אמינים לאפיון אינטראקציות נוגדנים-אנטיגן היא מרכיב חיוני בתהליך הגילוי והפיתוח של התרופה1. חיישנים ביולוגיים של תהודה פלזמונית משטחית אופטית (SPR), "תקן הזהב" לזיהוי בזמן אמת של אינטראקציות אלה, שימשו במשך כשני עשורים כדי לאפשר בחירה מוקדמת של מועמדים לנוגדנים טיפוליים העומדים בקריטריונים2,3. בנוסף למתן דירוג זיקה של מועמדים לנוגדנים על ידי סינון קשירה מהיר של סופרנטנטים גולמיים4, וקביעות קבועות קינטיות קפדניות של תכשירים מטוהרים5, חיישנים ביולוגיים יכולים להבדיל עוד יותר את הפעילות התפקודית של מועמדים מובילים באמצעות מחקרי שילוב אפיטופים6,7. 
כדי לענות על הביקוש הגובר למוצרים מבוססי נוגדנים להתוויות טיפוליות שונות8, פותח בשנים האחרונות מגוון רחב של מכשירי ביו-חיישנים חדשניים המגבירים את היעילות של זיהוי ואפיון מועמדים9,10. מכשירים אלה נבדלים זה מזה בתכנון תצורת התעלה המיקרופלואידית ו/או בעקרונות האופטיים המעורבים בזיהוי אינטראקציות ביו-מולקולריות. באופן ספציפי, ה-Octet RED38411, ProteOn XPR3612, ו-IBIS MX967 הרחיבו את מספר האינטראקציות שנמדדו במחזור כריכה יחיד ל-16, 36 ו-96 בהתאמה, המייצגים שיפורים משמעותיים בתפוקה לעומת פלטפורמת Biacore המסורתית. למרות שפלטפורמות החיישנים הביולוגיות השונות הללו מספקות כולן נתונים קינטיים חיוניים לאפיון אינטראקציות נוגדנים-אנטיגן, הן נבדלות זו מזו בהגדרת הניסוי ובנהלים התפעוליים עקב שינויים בתצורות האינסטרומנטליות. לדוגמה, בפלטפורמת מערך ההדמיה SPR של IBIS MX96, שלב הקיבוע של ליגנד המולטיפלקס מבוצע במצב לא מקוון במכשיר הדפסה חיצוני נפרד מהגלאי7,13; לעומת זאת, שלוש פלטפורמות החיישנים הביולוגיות האחרות משתמשות במערך "הכל-באחד", שבו הוספת הרכיב על פני השטח של החיישן, בין אם זה מגיב ההפעלה, הליגנד או האנליט, נרשמת בזמן אמת ובאמצעות פקודות מתוכנתות מראש בסדר עוקב. ב-Octet RED384, מאפיין ייחודי של פלטפורמה מבוססת אינטרפרומטריית BioLayer (BLI) זו הוא הזמינות של חיישנים ביולוגיים של סיבים אופטיים מצופים מראש עבור <שימוש מיידי ב-"טבילה וקריאה" class='xref'>14, ומבטל את הצורך בהכנת משטח ליגנד ושלבי אתחול/מיזוג הנדרשים לעתים קרובות עבור שבבי החיישנים בפלטפורמות מבוססות SPR. העיצוב נטול הנוזלים של מכשיר זה גם מפשט את המכניקה ומונע חששות סתימה וזיהום בעת התמודדות עם דגימות גולמיות. עם העיצוב הנוזלי החדשני של 6 x 6 ב-ProteOn XPR36, ניתן ליישם גישה קינטית "חד-פעמית" על ידי החלפת ערוצי הזרימה בין כיוונים אופקיים ואנכיים ליצירת 36 נקודות אינטראקציה15. במקום להעריך קינטיקה מחייבת ריכוז ליגנד או אנליט אחד בכל פעם, כפי שנעשה בפלטפורמת Biacore T100 המסורתית של זרימה טורית, גישה זו מציעה את היכולת לנטר עד 36 אינטראקציות שונות בו זמנית במחזור כריכה יחיד. 
למרות ההבדלים ביניהן, ארבע פלטפורמות החיישנים הביולוגיים הללו נמצאות כולן בשימוש נרחב על ידי מעבדות רבות ברחבי העולם. עבור משתמשים חדשים עם ניסיון מעשי מועט בחיישנים ביולוגיים, ההחלטה באיזה מכשיר להשתמש יכולה להיות משימה מאתגרת בהתחשב בהבדלים בתכנון האינסטרומנטלי. כדי לקבוע את המכשיר המתאים ביותר למטרות המחקר שלהם, יש לקחת בחשבון באופן קולקטיבי גורמים כגון איכות הנתונים, עקביות הביצועים, התפוקה, קלות התפעול וצריכת החומרים. בעוד שמספר מחקרי בנצ'מרק חקרו את השונות של קבועי קצב קינטי שהתקבלו ממספר מעבדות וביו-חיישנים5,16, מחקר השוואה ראש בראש שפורסם לאחרונה מתייחס עוד יותר לגורמים השיטתיים המשפיעים על אמינות הנתונים מנקודת מבט של ביצועים אינסטרומנטליים17,18. הפרוטוקולים המופיעים בסרטון זה מתמקדים בפירוט במערך הניסוי ובנהלים, ומלווים במאמר המחקר שכותרתו "השוואה בין פלטפורמות חיישנים ביולוגיים בהערכת קינטיקה של קשירת נוגדנים-אנטיגנים בעלי זיקה גבוהה"17. פרוטוקולים אלה נועדו לא רק לעזור למשתמשי חיישנים ביולוגיים חדשים ליישם מכשירים אלה למטרות המחקר שלהם, אלא גם לספק תובנות נוספות למשתמשי חיישנים ביולוגיים נוכחיים לגבי אתגרים טכניים ושיקולים בעיצובים ניסיוניים להערכת אינטראקציות נוגדנים-אנטיגן בעלות זיקה גבוהה.

<table><tbody><tr><td>מערכת Biacore T100</td> GE <td>Healthcare</td><td>28975001</td><td>מערכת T100 שודרגה לשבב חיישן T200</td></tr><tr><td>CM5&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100012</td><td></td></tr><tr><td>BIAevaluation&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>גרסה 4.1</td></tr><tr><td>Biacore T100 תוכנת בקרה</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>תוכנת הבקרה T100 שודרגה לערכת צימוד אמין T200</td></tr><tr><td></td><td>GE Healthcare</td><td>BR100050&nbsp;</td><td>הוא מכיל: 750 מ"ג 1-אתיל-3-(3-דימתיל-אמינופרופיל) קרבודימיד הידרוכלוריד (EDC), 115 מ"ג N-הידרוקסיסוקסימיד (NHS), 10.5 מ"ל 1.0 מ"ל אתנולמין-הידרוכלוריד pH 8.5&nbsp;</td></tr><tr><td>מאגר HBS-EP+ 10 פעמים;</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100669</td><td>פתרון מלאי מרוכז&nbsp;</td></tr><tr><td>בקבוקוני פלסטיק, 7 מ"מ</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100212&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מכסי גומי, סוג 3</td> GE <td>Healthcare</td><td>BR100502</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקונים וכובעים מפלסטיק, 11 מ"מ</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100214&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ProteOn XPR36 מערכת מערך אינטראקציה עם חלבונים</td><td>Bio-Rad</td><td>1760100</td><td></td></tr><tr><td>ProteOn Manager תוכנה&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1760200</td><td>גרסה 3.1.0.6</td></tr><tr><td>שבב חיישן GLM</td> ערכת צימוד <td>אמין Bio-Rad</td><td>1765012</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td>1762410</td><td>הוא כולל EDAC (EDC), סולפו-NHS, אתנולאמין HCl&nbsp;</td></tr><tr><td>ערכת התחדשות ומיזוג ומאגרים</td><td>Bio-Rad</td><td>1762210</td><td>הוא כולל 1 מכל מאגר גליצין (pH 1.5, 2.0, 2.5, 3.0), ו-NaOH, SDS, HCl, חומצה זרחתית, NaCl; 50 מ"ל כל תמיסה&nbsp;</td></tr><tr><td>2 ליטר PBS/Tween/EDTA מאגר</td><td>Bio-Rad</td><td>1762730</td><td>הוא כולל תמיסת מלח חוצצת הוספט (PBS), pH 7.4, 0.005% Tween 20, 3 מ"מ EDTA&nbsp;</td></tr><tr><td>Octet RED384 System</td><td>Fort&eacute; </td><td></td><td></td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח נתונים</td> ביולוגית <td>Fort&eacute; </td><td></td><td>גרסת ביו 9.0.0.4</td></tr><tr><td>טבילה וקריאה של חיישנים ביולוגיים נגד hIgG Fc לכידת (AHC)</td><td>Fort&eacute; ביו</td><td>18-5060</td><td>מגש אחד של 96 חיישנים ביולוגיים&nbsp;</td></tr><tr><td>384 צלחת תחתונה מוטה היטב&nbsp;</td><td>Fort&eacute; Bio</td><td>18-5080</td><td></td></tr><tr><td>מתקן חיישנים ביולוגיים</td><td>Fort&eacute; Bio</td><td>18-5016</td><td></td></tr><tr><td>Kinetics Buffer 10x</td><td>Fort&eacute; ביו</td><td>18-1092</td><td>ריכוז פי 10. מכיל ProClin 300.&nbsp;</td></tr><tr><td>IBIS MX96 SPRi System</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfluidics Continuous Flow Microspotter (CFM) מדפסת</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td>גרסה 2.0</td></tr><tr><td>שבב SensEye COOH-G</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td>1-09-04-004</td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח נתונים</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td>גרסה 6.19.3.17</td></tr><tr><td>תוכנת</td> <td>ניתוח נתונים SPRintWasatch Microfluidics</td><td></td><td>גרסה 6.15.2.1</td></tr><tr><td>מקרצף 2</td><td>תוכנת</td><td></td> BioLogic <td>גרסה 2</td></tr><tr><td>פירס חלבון רקומביננטי A/G</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21186</td><td></td></tr></tbody></table>

קביעת קינטיקה מחייב אנטיגן נוגדן גבוהה זיקה באמצעות ארבע פלטפורמות biosensor

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

לייבל ללא חיישנים אופטיים הם כלים רבי עוצמה גילוי סמים לאפיון של אינטראקציות biomolecular. במחקר זה, אנו מתארים את השימוש ארבע פלטפורמות biosensor בשימוש שיגרתי במעבדה שלנו להעריך את הזיקה ואת קינטיקה המחייבות של עשרה נוגדנים חד שבטיים בעלי אפיניות (מבז) נגד סוג Kexin סבטיליזין convertase האנושי proprotein 9 (PCSK9). בעוד הן Biacore T100 ו ProteOn XPR36 נגזרים תהודת Plasmon Surface והמבוססת (SPR) טכנולוגיה, יש לשעבר ארבעה תאי זרימה המחוברים באמצעות תצורת זרימת סדרתי, ואילו המתנות האחרונות 36 נקודות תגובה במקביל באמצעות שתי וערב מאולתר 6 x 6 תצורת ערוץ microfluidic. איביס MX96 גם פועל על בסיס טכנולוגיית חיישן SPR, עם תכונת הדמיה נוספת המספקת איתור באורינטציה המרחבית. טכניקה לגילוי זה בשילוב עם Microspotter הזרימה הרציף (CFM) מרחיבה את התפוקה באופן משמעותית על ידי דוארnabling הדפסת מערך מולטיפלקס וזיהוי של 96 ספורט תגובה זמנית. לעומת זאת, אוקטט RED384 מבוסס על Interferometry BioLayer (BLI) העיקרון אופטי, עם בדיקות סיבים אופטיים מתנהגות כמו biosensor לזהות תבנית התאבכות משנה על מחייב אינטראקציות על פני שטח הקצה. בניגוד פלטפורמות מבוססות SPR, מערכת BLI אינו מסתמך על fluidics זרימה רציפה; במקום, עצות החיישן לאסוף קריאות בזמן שהם שקועים פתרונות אנליטי של microplate 384-היטב במהלך תסיסה מסלולית. כל אחד פלטפורמות biosensor הללו יש יתרונות וחסרונות משלה. כדי לספק השוואה ישירה של היכולת המכשירים הללו כדי לספק נתונים הקינטית איכות, בפרוטוקולים המתוארים להמחיש ניסויים להשתמש באותו פורמט assay ואת ריאגנטים איכותיים באותו לאפיין קינטיקה-אנטיגן נוגדן שמתאים 1 הפשוט: מודל האינטראקציה המולקולרי 1 .

איור 1 מציג את תמונת מערך נוגדנים מן CFM ואת רמות מב זוהו ע&quot;י שתי שיטות הקיבוע, ואיור 2 מראה את sensorgrams מחייב המקביל שנוצר MX96 מן-מחזור הרב הקינטית מדידות הקינטית חד המחזור על מערכים מב אלה . זמן האמת מחייב עקומות מצוידות kinetically ממשטחים נוגדנים מצופים מרובים שנוצרו פלטפורמות biosensor הארבע מוצג איורי 3 - 6. איור 7 מציג ההשוואה בין שיעורי הקינטית הסופיים והקבועים מחייב איזון שהתקבלו מהניתוח הגלובלי של עקומות המחייבות אלה. עמותת הפרט (k א), דיסוציאציה (K ד), ועל שיווי המשקל (K D) הקבועים מחייב מוצגים בטבלת 1. כדי להדגים את ההשתנות של מערכי נתונים שנוצרו בתוך אותו המכשיר, <stרונג&gt; איור 8 מציג חלקות של k, k ד, ו K D בצפיפויות משטח מב שונים, ואיור 9 עוד משווה את הפעילויות מחייבות המחושבות של המשטחים מב ברחבי פלטפורמות biosensor. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig1.jpg" /> איור 1. Multiplex ליגנד מערכים של אמין מצמידים (א) ו- FC-בשבי (B) משטחי נוגדני הדפסת CFM ב MX96 IBIS. תמונות של המערכים המודפסים מוצגות לוחות השמאל, שבו השטחים האפורים מוקפים ריבועים אדומים מצביעים על הנוכחות של נוגדנים. Interspots הכהה הממוקם בין כתמי נוגדן הפעילים משמש חיסור הפניה. כל עמודה מכילה נוגדן מודפס על ריכוזי טיטרציה שמופיעות למטה ולצד שמאל של התמונה. הסכומים של הנוגדנים מודפסים לכמת על ידי חישוב difference במשמרות בתפזורת בין המקומות הפעילים ועיון מוצג הלוחות התקינים. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig2.jpg" /> השוואת איור 2. בזמן אמת כריכה Sensorgrams מן מולטי-מחזור (א) ו- Single-מחזור (B) ניסויים קינטי ב MX96 IBIS. הזריקות הרציפות של PCSK9 האדם להגדיל ריכוזים ברחבי 10 x 8 מערכי נוגדן מצוינות מעל כל קטע sensorgram מקביל. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig3.jpg" /> <stרונג&gt; איור 3. כריכה Sensorgrams של נוגדנים שנתפסו אינטראקציה עם PCSK9 אנוש 1: 1 בשכבות Fit דגם קינטי ב Biacore T100. האינטראקציות מוערכות מעל גבוהה (לוחות עליונים), בינוני (לוחות ביניים), ובצפיפות נמוך (לוחות למטה) משטחים בצפיפות. הקווים השחורים החלקים המעולפים מייצגים את ההתאמה הקינטית של אותות התגובה מחייבים בריכוזי PCSK9 אדם שונים (קווים צבעוניים) עד 1: מודל אינטראקציה 1. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig4.jpg" /> איור 4. כריכה Sensorgrams של נוגדנים שנתפסו אינטראקציה עם PCSK9 אנוש 1: 1 קינטי דגם Fit שכבות של ProteOn XPR36. האינטראקציות מוערכות מעל גבוהה (לוחות עליונים), Medium- (לוחות הביניים), ובצפיפות נמוכה (לוחות למטה) משטחים בצפיפות. הקווים השחורים החלקים המעולפים מייצגים את ההתאמה הקינטית של אותות התגובה מחייבים בריכוזי PCSK9 אדם שונים (קווים צבעוניים) עד 1: מודל אינטראקציה 1. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig5.jpg" /> איור 5. כריכה Sensorgrams של נוגדנים שנתפסו אינטראקציה עם PCSK9 אנוש 1: 1 קינטי דגם Fit שכבות של שמיניית RED384. האינטראקציות מוערכות מעל גבוהה (לוחות עליונים), בינוני (לוחות ביניים), ובצפיפות נמוך (לוחות למטה) משטחים בצפיפות. הקווים האדומים המעולפים מייצגים את ההתאמה הקינטית של אותות התגובה מחייבים בריכוזי PCSK9 אדם שונים (קווים צבעוניים) עד 1:<html> מודל האינטראקציה 1. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig6.jpg" /> איור 6. כריכה Sensorgrams של האמין מצמידים (א) ו- FC-בשבי (B) נוגדנים אינטראקציה עם PCSK9 אנוש 1: 1 קינטי דגם Fit שכבות של MX96 IBIS. הפרופילים המחייבים מאורגנים כמו 10 x 8 לוחות באים במפת צלחת מערך באיור 1. הקווים השחורים מייצגים את האותות בתגובה המחייבים רשמו בריכוזי PCSK9 אדם שונים, ואת הקווים האדומים המעולפים לייצג את העקומות המצוידות. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> איור 7&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55,659 / 55659fig7.jpg&quot; /&gt; איור 7. השוואת איגוד k א (א), ד יא דיסוציאציה (B), ואת שיווי משקל K D (C) קבועים עקידת שנוצר על ידי פלטפורמות biosensor ארבע. הפרמטרים הקינטית נגזרים ניתוח הגלובלי של העקומות מחייבות איורים 3 - 6. המכשירים מיוצגים כלהלן: Biacore T100 (כחול), ProteOn XPR36 (ירוק), אוקטט RED384 (אדום), IBIS MX96, אמין מצמידים (סגול), ו IBIS MX96, FC-בשבי (כתום). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="הספרה 8" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig8.jpg" /> השוואת איור 8. של העקביות של קבועי קצב קינטי במהלך צפיפות Surface נוגדן מרובה BIAC<html> עפרות T100 (א), ProteOn XPR36 (B), אוקטט RED384 (C), IBIS MX96, מצמידים-אמין (D), ואת IBIS MX96, FC-בשבי (E). הפרמטרים הקינטית k A (לוחות-משנה עליון), k ד (לוחות-משנה באמצע), ו- K D (לוחות-תת קרקעיים) נגזרים מניתוח הקבוצה ב צפיפות משטח נוגדן פרט. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 9" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig9.jpg" /> איור 9. פעילויות עקידת משטחי הנוגדן וסטיות תקן שלהם (ברי שגיאה) בפלטפורמות biosensor ארבע. הערכים מחושבים באמצעות משוואות המתוארות במאמרי המחקר 17.large.jpg&quot; target = &#39;_ blank&#39;&gt; אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td> k a </td><td> k d </td><td> K D </td></tr><tr><td> (M -1 s -1) </td><td> (ים -1) </td><td> (ננומטר) </td></tr><tr><td> מב 1 </td><td> 11.7 (7.8) x 10 5 </td><td> 4.89 (4.18) x 10 -5 </td><td> 0.052 (0.05) </td></tr><tr><td> מב 2 </td><td> 1.53 (0.28) x 10 5 </td><td> 1.30 (1.54) x 10 -5 </td><td> 0.092 (0.12) </td></tr><tr><td> מב 3 </td><td> 11.4 (8.3) x 10 5 </td><td> 27.6 (11.0) x 10 -5 </td><td> 0.333 (0.20) </td></tr><tr><td> מב 4 </td><td> 3.61 (1.6) x 10 5 </td><td> 20.1 (12.3) x 10 -5 </td><td> 0.659 (0.54) </td></tr><tr><td> מב 5 </td><td> 0.59 (0.21) x 10 5 </td><td> 3.46 (2.50) x 10 -5 </td><td> 0.663 (0.46) </td></tr><tr><td> מב 6 </td><td> 1.19 (0.78) x 10 5 </td><td> 7.21 (3.83) x 10 -5 </td><td> 0.894 (0.64) </td></tr><tr><td> מב 7 </td><td> 1.29 (0.53) x 10 5 </td><td> 16.4 (5.63) x 10 -5 </td><td> 1.57 (1.02) </td></tr><tr><td> מב 8 </td><td> 4.02 (2.23) x 10 5 </td><td> 22.8 (10.7) x 10 -5 </td><td> 0.768 (0.68) </td></tr><tr><td> מב 9 </td><td> 4.20 (2.13) x 10 5 </td><td> 6.67 (4.3) x 10 -5 </td><td> 0.197 (0.16) </td></tr><tr><td> מב 10 </td><td> 1.20 (0.49) x 10 5 </td><td> 12.5 (7.64) x 10 -5 </td><td> 1.27 (0.80) </td></tr></tbody></table> טבלת 1: Kinetic מחירים ואוזן כריכה קבוע של 10 מבז מתקבל על ידי התאמת גלובל של Curves כריכה מתוך ארבעה biosensor מכשירים ל 1: מודל האינטראקציה 1.

אנו מתארים כאן פרוטוקולים לשקילה-אנטיגן הנוגדן מחייבת זיקת קינטיקה באמצעות פלטפורמות biosensor ארבע נפוצות.

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

מטרת מחקר ביוסנסור זה היא להשוות את היכולת של ארבע פלטפורמות ביוסנסור הנמצאות בשימוש שגרתי לספק נתונים קינטיים איכותיים, ולספק תובנות בנוגע לאתגרים טכניים ושיקולים בתכנון ניסויי להערכת אינטראקציות בעלות זיקה גבוהה בין נוגדנים לאנטיגנים. מחקר זה עונה על שאלות מפתח בתחום גילוי התרופות לבחירת פלטפורמות ביוסנסור ופורמטים של בדיקות המאפשרים את התוצאות המהימנות ביותר בעת הערכת מועמדים לנוגדנים טיפוליים. היתרון המרכזי של מחקר זה הוא שהוא מספק השוואה ישירה ומקיפה של פלטפורמות הביוסנסור השונות, בכל הנוגע לעקביות הנתונים, האיכות והיעילות התפעולית.הדגמה בווידאו של ארבעת הפרוטוקולים היא קריטית, שכן היא מסייעת למשתמשים חדשים עם מעט ניסיון מעשי ללמוד כיצד להגדיר ניסויים במכשירים אלו. למדידות קינטיות ב-Biacore T100, לחצו על File, ardından Open New Method, ופתחו את קובץ השיטה. עברו על הפרמטרים בשיטה.בסוגי המחזורים (Cycle Types), הגדירו את זמן המגע ל-220 שניות עבור לכידה 1 במסלול זרימה 2, 110 שניות עבור לכידה 2 במסלול זרימה 3, ו-55 שניות עבור לכידה 3 במסלול זרימה 4. קצב הזרימה הוא 10 µL לדקה עבור כל מחזורי הלכידה. בחרו ב-Sample 1 וסמנו את תמיסת הדגימה (sample solution) כמשתנה.לאחר מכן, הגדירו את זמן המגע ל-600 שניות, ואת זמן הדיסוציאציה ל-2,700 שניות בנתיבי זרימה 1, 2, 3, 4. קצב הזרימה מוגדר ל-30 microliters per minute. לאחר מכן, בחרו ב-Regeneration 1, הזינו glycine HCl pH 1.5 בשדה התמיסה, והגדירו את זמן המגע ל-20 שניות בנתיבי זרימה 1, 2, 3, 4.בסעיף Variable Settings, הזן ריכוזי טיטרציה בשנייה (twofold) של 100 nanomolar עד 6.25 nanomolar עבור מחזורים 1-3, 50 nanomolar עד 3.12 nanomolar עבור מחזורים 4-8, ו-5 nanomolar עד 0.323 nanomolar עבור מחזורים 9-10. ב-Setup Run, בחר את נתיבי זרימת הגילוי 2-1, 3-1, 4-1, ולאחר מכן לחץ על next. סמן את prime before run ולחץ שוב על next.בחר את מדף הדגימות והריאגנטים 1 והגדר את המיקום עבור הריאגנטים. טפטף את הריאגנטים למבחנות הדגימה הבודדות בהתאם והכנס את המדף למכשיר. לחץ על Eject Rack כדי לפתוח את דלת תא מגש הדגימות ולאחר מכן הכנס את מדף הדגימות למכשיר.לאחר מכן לחצו על Start והזינו שם לניסוי שישמור לצורך התחלת ההרצה. עבור המדידות הקינטיות ב-ProteOn XPR36, התחילו את האימוביליזציה על ידי בחירה ב-Protocols ולאחר מכן ב-Samples. הגדירו את EDC/Sulfo-NHS כ-activator בבארות H1-H6, את protein A/G כ-ligand ב-G1-G6, את ethanolamine כ-deactivator ב-F1-F6, את glycine כ-regenerator ב-E1-E6, את PBS-T-EDTA כ-blank ב-D1-D6, דגימת נוגדן מונוקלונלי X כ-ligand ב-C1-C6, ואת human PCSK9 כ-analyte בבארות B1-B6.בחר ב-Steps ולאחר מכן לחץ פעמיים על Immobilization בעורך הפרוטוקול. השלבים כוללים שלוש הזרקות אופקיות עוקבות של EDC/Sulfo-NHS, protein A/G, ואתנולאמין בריכוז של 1 M. לכל הזרקה יש להיות קצב זרימה של 30 µL לדקה וזמן מגע של 300 שניות.בשלב הבא, לחצו על Regenerate. מזריקו שלושה פולסים של glycine למשך 18 שניות בכל פעם, בקצב של 100 microliters per minute, הן בכיוון האופקי והן בכיוון האנכי. לאחר מכן, מזריקו שני פולסים של PBS-T-EDTA למשך 60 שניות בכל פעם, בקצב של 25 microliters per minute, גם הם בשני הכיוונים.לאחר מכן, לחצו על Ligand והזריקו נוגדן מונוקלונלי 1 ונוגדן מונוקלונלי 2 בכיוון אנכי, בקצב זרימה של 25 microliters per minute ובזמן מגע של 160 seconds. לאחר הלחיצה על Analyte, הזריקו חמישה ריכוזים של PCSK9 אנושי בבופר ריק דרך שישה ערוצים אופקיים בו-זמנית. השתמשו בקצב של 40 microliters per minute למשך 600 seconds של זמן אסוציאציה, ולאחריהם 700 seconds של זמן דיסוציאציה.לאחר מכן, לחצו על Regenerate והזרימו שני פולסים של 18 שניות של glycine בקצב של 100 microliters per minute הן בכיוון האופקי והן בכיוון האנכי. בשלב הבא, הכינו את הדגימות והריאגנטים בפלטה אחת של 96 בארות בהתאם למיקומי הריאגנטים שהוגדרו. העבירו את הפלטה למכשיר, לחצו על לשונית ה-Run, בחרו את הפרוטוקול ולחצו על Start.מוצגת הזרקה מקבילה באמצעות שש מחטים בזמן הקלטה של נתונים ניסיוניים חיים. עבור מדידות קינטיקה ב-Octet RED384, הגדירו את שיטת הניסוי על ידי לחיצה ראשית על Experiment, לאחר מכן על New Experiment Wizard, फिर New Kinetics Experiment, ולבסוף על Basic Kinetics בתוכנה לרכישת נתונים. לאחר מכן לחצו על Modify Plates ושנו את 96 Wells ל-384 Wells הן ב-Plate 1 והן ב-Plate 2.הגדירו את סוגי הדגימות ואת מיקומיהן בלוח כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. עברו להגדרת הבדיקה (assay definition) כדי להגדיר את מערך הניסוי. מערך הניסוי מוגדר כזמן בסיס (baseline) של 30 שניות, זמן רגנרציה של 30 שניות, זמן שיווי משקל של 18 שניות, טעינה עם זמן של 200 שניות, זמן אסוציאציה של 500 שניות וזמן דיסוציאציה של 1,800 שניות.מהירות הנעורה נקבעה ל-1,000 RPM. כדי להוסיף שלבים לרשימת שלבי הבדיקה, יש ללחוץ תחילה על שלב, ולאחר מכן על הבארים הנמצאים בלוח הדגימה או בלוח הריאגנטים. ראשית, הזינו את הוראות רגנרציית השיווי (equilibration regeneration) כדי להכין את חיישני לכידת anti-human Fc באמצעות שלושה מחזורים של טבילות למשך 15 שניות ב-glycine לסירוגין עם טבילות למשך 15 שניות ב-1XKB.לאחר מכן, הזינו את הוראות הטעינה כדי ללכוד את דגימות הנוגדנים המונוקלונליים על חיישני לכידת anti-human Fc למשך 200 שניות. לאחר מכן, הזינו את הוראות קו הבסיס כדי לקבוע את אות האינטרפרומטריה של השכבה הביולוגית (bio-layer interferometry) למשך 60 שניות לפני שלב האסוציאציה. הזינו את שלב האסוציאציה כדי לטבול את החיישנים בבארים המכילות ריכוזים משתנים של human PCSK9 למשך תקופת אסוציאציה של 500 שניות.הזינו את שלב הדיסוציאציה (dissociation) כדי לטבול את החיישנים הקשורים ל-PCSK9 לתוך בארות חדשות של 1XKB למשך תקופת דיסוציאציה של 1,800 שניות. לבסוף, עבור שלב הרגנרציה (regeneration), טבלו את החיישנים הקשורים לנוגדן חד-שבטי ל-PCSK9 לתוך בארות של глиcine עם שני פולסים של 18 שניות בין כל מחזור קישור. עברו ל-Review Experiments, דפדפו בין השלבים, ולאחר מכן לחצו על הכפתור הפתוח הירוק כדי לפתוח את תא הדגימות.העבירו את פלטות הדגימות אל המכשיר. נווטו ל-Run Experiments, הזינו זמן השהייה של 60 שניות, ונערו את פלטת הדגימות בזמן ההמתנה. הגדירו את טמפרטורת הפלטה ל-25 degrees Celsius, הזינו שם להרצת הניסוי, ולאחר מכן לחצו על Go. איסוף נתונים בזמן אמת מוצג כאן.עבור מדידות קינטיות רב-מחזוריות ב-IBIS-MX96, התקינו את שבב החיישן במיקרו-ספוטר לזרימה רציפה. פתחו את תוכנת ה-CFM2.0, לאחר מכן לחצו על Load Settings ואז על 96 Amine Couple. הניחו את שתי פלטות הדגימות והריאגנטים בתוך מדפסת ה-CFM.כדי ליצור את מערך הנוגדנים, לחצו על Run כדי להפעיל את המדפסת ולהעביר את ה-EDC/Sulfo-NHS מהחצי העליון של לוח הריאגנטים אל החיישן באמצעות 48 מיקרו-ערוצים, ולהזרים אותם על פני שטח החיישן למשך חמש דקות. העבירו את דגימות הנוגדנים המונוקלונליים מהחצי העליון של לוח המקור אל החיישן, והזרימו אותם על פני השטחים הפעילים למשך 10 דקות. לאחר מכן, העבירו באפר קיבוע (immobilization buffer) משפופרת קונית של 50 milliliter על פני שטח הנוגדנים למשך חמש דקות.חברו את שבב החיישן המודפס למכשיר. בתוכנת הבקרה, לחצו על File, Open measurement, Existing measurement, ובחרו את קובץ השיטה. העבירו את שבב החיישן המודפס אל תוך המכשיר.בתפריט הכללי, בחרו ב-G-System Prime תחת Full system script. לאחר מכן, בחרו ב-G-Quench כדי לבטל את פעילותם של משטחי הנוגדנים המונוקלונליים על ידי הזרקה של 150 µL של ethanolamine בריכוז 1 M. ב-Analysis Cycle, בחרו ב-A-AP Standard Run תחת IBIS Scripts.הגדירו 1.0 דקות למדד הבסיס (baseline), 10.0 דקות לאסוציאציה, ו-90 שלבים לדיסוציאציה במהירות של eight microliters per second. בתוך המחזורים, הזרמימו ריכוז אחד בכל פעם של human PCSK9, לאחר חמש הזרקות של בופר. בצעו רגנרציה למשטחי הנוגדנים המונוקלונליים באמצעות glycine בין כל מחזור קישור.מוצגות סנסורגרמות קישור מוקלטות בחפיפות התאמה למודל קינטי של יחס אחד-לאחד עבור הנוגדנים המקישרים ל-PCSK9 אנושי בארבעה מכשירים. פרופילי הקישור של הנוגדנים בצפיפויות שונות דומים בין המכשירים. למרות שקבועי הקצב הקשורים לכל אחד מהנוגדנים השתנו בין המכשירים, סדר הדירוג שלהם נשאר ברובו זהה.נבדקה השחזוריות והעקביות של זיקות בקצבים קינטיים על פני מספר משטחי נוגדנים. כפי שמוצג כאן, נצפתה ליניאריות חזקה עבור כל קבועי הקצב שהופקו באמצעות Biacore T100 ו-ProteOn XPR36. עם זאת, קבועי הקצב שהופקו על ידי Octet RED384 היו פחות ליניאריים עקב תנודתיות בחלק מקצבי הניתוק (off rates).ייתכן שהדבר נגרם מהתאיידות של הדגימות לאורך זמן במיקרו-פלטה. קבועי הקצב שהתקבלו באמצעות ה-IBIS-MX96 היו פחות ליניאריים עקב תנודות בהומוגניות הפני השטח. פעילויות קישור הנוגדנים הקשורות למרבית המערכות היו עקביות, בעוד שפעילות נמוכה פי עשרה בערך נצפתה בשיטה המקושרת לאמין מה-IBIS-MX96.ייתכן שהדבר נבע מנטרול הנוגדן, או מיצירת אוריינטציות של הנוגדן שלא אפשרו קישור יעיל לאנטיגן. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להקים ניסויים בכל אחת מארבע פלטפורמות הביו-סנסורים, וכיצד לבחור את טכנולוגיית הביו-סנסור המתאימה למטרת המחקר שלכם. מחקר ההשוואה הישירה שלנו מראה שלכל פלטפורמת ביו-סנסור ישנם יתרונות וחסרונות משלה.על אף מגבלות שיטתיות פנימיות מסוימות במכשור, נמצא מתאם גבוה בין המכשירים הללו עבור סדר הגודל הישיר של קבועי קצב הקישור (association) והניתוק (dissociation). לצורך דירוג מועמדים, בהנחה שמספר הדגימות וכמות החומרים אינם מהווים גורמים מגבילים, ניתן להשתמש בכל אחד מהמכשירים הללו, מכיוון שהם מסוגלים להבדיל בין הנוגדנים באופן דומה, ללא קשר למכשיר שנבחר. קיימת פשרה (trade-off) בין אמינות הנתונים לבין תפוקת הדגימות.Biacore T100, ולאחריו ProteOn XPR36R, הציגו את איכות הנתונים והעקביות הטובות ביותר. לעומת זאת, Octet RED384 ו-IBIS-MX96 מראים גמישות ותפוקה גבוהות, אך עם פשרות בדיוק הנתונים ובעקביותם. עבור מחקרים הדורשים זיהוי רגיש ואמין, Biacore T100 או ProteOn XPR36 הם המתאימים ביותר.עבור מחקרים שבהם המהירות היא גורם קריטי ומעורב מספר רב של דגימות, מומלץ להשתמש ב-Octet Red384 או ב-IBIS-MX96. מכשירים בעלי זרימה רציפה של נוזלים מספקים נתונים באיכות גבוהה להפרדה של אינטראקציות עם קצבי דיסוציאציה איטיים. המגבלה העיקרית של מכשיר ה-BRI fluid ex-a-fray היא התאיידות דגימות לאורך זמן במיקרופלטה, דבר שעלול להוביל לסחיפה כלפי מעלה ולפגוע בדיוק הנתונים.

determination-high-affinity-antibody-antigen-binding-kinetics-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

סרטון זה מדגים בדיקת ביוסנסור מוליך כדי לחקור את האינטראקציה של נוגדן עם אנטיגן מטרה משותק על שבב מתמר. הביוסנסור מהונדס כך שיהיה לו חלבון כימרי דו-תפקודי – אנזים β-לקטמאז עם אתר קטליטי פונקציונלי המאוחה לננון לצורך קשירה לאנטיגן המטרה המשותק. עם הקשירה, ההידרוליזה הקטליטית של מצע אנטיביוטי על ידי האנזים β-לקטמאז מייצרת אות חשמלי - המאשר את האינטראקציה בין אנטיגן לנוגדן.

בדיקת ביוסנסור מוליך מבוססת β-לקטמאז לאינטראקציות חלבון-חלבון

הפרוטוקולים כאן לתאר מבחני הקינטית של חלבונים אינטראקציות עם Interferometry Bio-השכבה. ה-ATP synthase F-הסוג, שהוא מעורב בחילוף חומרים של אנרגיה בתאים, יכול להיות מעוכב על ידי מקטע ε בחיידקים. יש לנו להתאים Interferometry Bio-שכבה כדי לחקור אינטראקציות של קומפלקס קטליטי עם התחום בטרמינל C-המעכב של ε.

Interferometry Bio-שכבה למדידת קינטיקה של חלבונים אינטראקציות והשפעות יגנד allosteric

בעבודה זו, אנו מדווחים על שיטה חדשה ללמוד אינטראקציות חלבון-חלבון באמצעות ביוסנסור conductimetric מבוסס על טכנולוגיית β לקטמאז היברידית. שיטה זו מתבססת על שחרורו של פרוטונים על הידרוליזה של β-lactams.

השימוש β-lactamase מבוססי ביוסנסור Conductimetric Assay לזהות אינטראקציות למערכות ביולוגיות

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לתאר את התפתחות ואימות מולקולה בודדת מערך דיגיטלי אליסה assay, אשר מאפשרת הזיהוי לאולטרה רגישות כל סוגי IFN-α בדגימות אנושי.

פיתוח ובדיקת של מולקולה בודדת העדינה מערך דיגיטלי מקושרים-אנזים Immunosorbent Assay עבור אינטרפרון אנושי-α

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לנטר את הרכבה ופירוק של הרעלן גחלת באמצעות biolayer אינטרפרומטריה (בלי). בעקבות הרכבה/פירוק על פני ביוסנסור, משתחררים את מתחמי חלבון גדולה מפני השטח עבור פריט חזותי וזיהוי של רכיבי מתחמי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני ו ספקטרומטר מסה, בהתאמה.

ניתוח דינאמי חלבון מתחמי נאסף בנושא ושוחרר מן Biolayer אינטרפרומטריה ביוסנסור באמצעות ספקטרומטר מסה ואלקטרון

אנו מתארים גישה של מולקולה אחת למדידות זיקה לאנטיגן-נוגדנים באמצעות פוטומטריה המונית (MP). הפרוטוקול מבוסס MP הוא מהיר, מדויק, משתמש בכמות קטנה מאוד של חומר, ואינו דורש שינוי חלבון.

נחישות מהירה של זיקה נוגדנים אנטיגן על ידי פוטומטריה המונית

מחקר זה נועד להציג אסטרטגיה לזיהוי אינטראקציות תרופתיות פפטיד. האסטרטגיה כוללת ביופאנינג של פפטידים קצרים לזיהוי תרופות המבוססים על מיקרו-איזון של גביש קוורץ (QCM), ואחריו ניתוח ביואינפורמטיקה להערכת כמותיות של המידע המתקבל להכרה בסמים וביאור של אתרי איגוד התרופות בחלבונים.

ביו-panning מבוסס Biosensor ואסטרטגיית ניתוח ביואינפורמטיקה לאימות גלובלי של אינטראקציות עם חלבונים תרופתיים

ביוסנסינג של אפקט שדה (FEB) היא טכניקה נטולת תוויות לאיתור אינטראקציות ביומולקולריות. הוא מודד את הזרם החשמלי דרך הביו-סנסור של הגרפן שאליו משותקות מטרות הקשירה. טכנולוגיית FEB שימשה להערכת אינטראקציות ביומולקולריות בין Hsp90 ל-Cdc37 וזוהתה אינטראקציה חזקה בין שני החלבונים.

חקר האינטראקציה הביומולקולרית בין המלווה המולקולרי Hsp90 לבין חלבון הלקוח שלו Kinase Cdc37 באמצעות טכנולוגיית ביוסנסינג בעלת אפקט שדה

מאמר זה מתאר פרוטוקול לחקר אינטראקציות דנ"א-חלבון באמצעות מערכת אינטרפרומטריה ביו-שכבתית מבוססת סטרפטווידין (BLI). הוא מתאר את השלבים והשיקולים החיוניים לשימוש בקינטיקה מחייבת בסיסית או מתקדמת כדי לקבוע את זיקת קשירת שיווי המשקל (KD) של האינטראקציה.

ניתוח אינטראקציות DNA-חלבון עם אינטרפרומטריה ביו-שכבתית מבוססת סטרפטווידין

MicroScale Thermophoresis (MST) היא טכנולוגיה רגישה לאפיון אינטראקציות aptamer-מטרה. כתב יד זה מתאר פרוטוקול MST לאפיון אינטראקציות בין אפטמר למולקולות קטנות.

מיפוי אתר הקישור של Aptamer על ATP שימוש microscale Thermophoresis

למדו לבצע מדידות קינטיקה של אינטראקציות נוגדן-אנטיגן באמצעות ארבע פלטפורמות ביוסנסור שונות. הפרוטוקולים המוצגים מסייעים לחוקרים לבחור את הפלטפורמה המתאימה ביותר לפיתוח תרופות.

קביעת קינטיקה מחייב אנטיגן נוגדן גבוהה זיקה באמצעות ארבע פלטפורמות biosensor

גלה סרטונים נוספים