Name: Assay למדוד Nucleocytoplasmic התחבורה בזמן אמת בתוך מוטורי נוירון כמו NSC-34 תאים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: למדו לכמת בזמן אמת הפרעות בהובלה גרעינית-ציטופלזמית בתאי NSC-34 מוטוריים. השיטה מאפשרת זיהוי שינויים עדינים בקצב ייבוא גרעיני ומסייעת במחקר מחלות נוירודגנרטיביות כמו ALS.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לכל חברי מעבדת AI על הערותיהם והצעותיהם המועילות. ברצוננו להודות פרופ &#39;מארק היפ (מקס פלנק המכון לביוכימיה) עבור מתן לנו את המעבורת- GFP וקטור. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הישראלית למדע (ISF # 124/14), הקרן הדו-לאומית למדע (BSF # 2013325), FP7 מארי קורי (קרייג # 333794) והמכון הלאומי לפסיכוביולוגיה בישראל NIPI # b133-14 / 15).

1. הכנת קו סלולרי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירי כ -1,000,000 תאי עצב בעמוד השדרה של תאי עצב נוירובלסטומה (NSC-34 תאים) שאוחסנו במיכל חנקן נוזלי. השתמש 37 ° C אינקובטור מים עד התאים מופשר לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני טרי, חם (בינוני DMEM המכיל 10% בסרום שור עוברית (FBS), 1% L- גלוטמין, 1% אנטיביוטיקה עט עט). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאים מופשר (SL16R) ב XG 500 במשך 5 דקות, ויצרו תא גלולה. מחק את המדיום ולהוסיף 1 מ&quot;ל של המדיום החדש עבור resuspension התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התאים resuspended בבקבוק 15 מ&quot;ל ולהוסיף תוספת 5 מ&quot;ל של המדיום. דגירה התאים לילה חממה סטרילית עם 5% CO 2 ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקביל, במקום coverslips 8 uncoated (כיסוי זכוכית: 12 מ&quot;מ, 0.13-0.17 מ&quot;מ עובי) בתוך 60 מ&quot;מ צלחת תרבות לעקר באמצעות אתנול 70% וחשיפה 30 דקות של אור UV עד יבש. מוסיפים את המדיום לכל צלחת ומפזרים כדי לשטוף את אתנול שיורית.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חיץ טריפסין (2.5 גרם של טריפסין ו 0.2 גרם של EDTA ב 1 L של תמיסת מלח מאוזן של הנקס) לתאים לאחר שהם מגיעים כ -90% מפגש (בערך 6 מיליון תאים לכל בקבוק) כדי לאפשר תאים חסיד לנתק. הערה: NSC-34 תאים רגישים רק דורשים 15 ים של הדגירה חיץ טריפסין 1 דקות נוספות של הדגירה ללא טריפסין לפני דיסוציאציה באמצעות המדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט התאים על 60 מנות תרבות מ&quot;מ כבר המכיל את coverslips עם 3 מ&quot;ל של מדיום, כ 350,000 לכל מנה. להשאיר אותם בחממה במשך 24 שעות כדי לאפשר מצורף התא על coverslips. </li></ol> 2. Transfection Cell הערה: לאחר כ 24 שעות, תאים NSC-34 יגיעו המפגש 40% (כ 800,000 תאים) ויהיה מוכן transfection. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני DMEM טהור (300 μL של מדיום DMEM עבור כל צלחת 60 מ&quot;מ תרבות) באמבט microcentrifuge סטריליEs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיקרוגרם של כל פלסמיד נדרש transfection לכל צינור microcentrifuge המכיל DMEM. הערה: המעבורת- GFP פלסמיד היא חובה בכל transfections התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף transfection מגיב לכל צינורות microcentrifuge המכילים פלסמידים הנדרשים שלהם. הנה, להוסיף 4 μL של מגיב transfection מסחרי עבור כל 2 מיקרוגרם של ה- DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס צינורות microcentrifuge המכיל DMEM, פלסמידים, ואת מגיב transfection ו דגירה אותם בטמפרטורת החדר למשך 25 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים כל צינור microcentrifuge לצלחת תרבות ומערבבים את המנה בעדינות כדי ליצור פתרון הומוגני. מניחים את צלחת בחזרה בחממה במשך 48 שעות. הערה: מאז המעבורת- GFP צריך לבוא לידי ביטוי בכל התאים, המעבורת- GFP יעילות transfection ניתן בחינה חלקית נבדק מראש באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לאחר transfection לילה. בדיקה מלאה של חלבונים שאינם פלואורסצנטי לידי ביטוי יכול להתבצע באמצעות analys immunoblotJ </li></ol> 3. מיקרוסקופיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את coverslips המכילים transfected NSC-34 תאים לבעלים coverslip ולשטוף בעדינות עם מלוחים שנאגרו מלוחים (PBS) כדי להסיר את התאים המתים מנותקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי תיקון התא מתאים באמצעות מסנן פלואורסצנטי ירוק עם מיקרוסקופ הפוך. הערה: תיקון תא מתאים מוגדר שדה מיקרוסקופ של נוף מראה מספר גדול של תאים (20-30 תאים בשדה) שבו גרעינים מוגדרים בבירור בתאים. גרעיני תאים בתוך תיקון התא מזוהים לראשונה על ידי העין מסומנים ידנית על ידי תוכנת הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μL של מעכב exportin 1 Leptomycin B (LMB) המכיל 10 ng / mL LMB ב PBS כדי coverslips ידי טפטוף המאגר על coverslips תחת המיקרוסקופ. הערה: נקודת זמן זו נקבעת כאפס מרווח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את עוצמת הניאון של גרעינים מסומנים במרווחים של 3 במשך כ 400-500 s. </li><li&gt; בדוק בין 3 ל 5 כיסוי לכסות עבור כל קבוצת transfection בכל ניסוי בודדים. </li></ol> 4. ניתוח הערה: מאז תאים שונים להביע רמות שונות של מעבורת ניאון- GFP, חשוב לנרמל את עוצמת הניאון הגרעיני של כל תא כדי עוצמת ניאון הראשונית שלה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנרמל את עוצמת הניאון של הגרעינים המסומנים על ידי חלוקת מרווח פלורסנט 3-s של כל גרעין עם הממוצע של שישה אינטרוולים הראשונים של גרעין זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הנורמליזציה של כל גרעין, לייצר עקומת עוצמת ניאון המייצג את השינוי גרעיני הקרינה כפונקציה של זמן עבור כל תיקון התא. כדי לעשות זאת, לחשב את הממוצע של כל התאים בכל תיקון תאים (בהיקף של כ 20-30 תאים בכל תיקון). הערה: עקומת עוצמת ניאון גרעיני דומה עקומת הרוויה Michaelis-Menten, אשר נצפה טוב יותר בתוך ti מוגברתלי תקופות. זאת בשל ירידה בכמויות cytosolic של המעבורת- GFP עם הזמן עקב התחבורה הגרעינית. ירידה זו סטטיסטית מורידה את ההסתברות של המעבורת- GFP להובלה לגרעין, ובכך להגיע הרוויה הקרינה הגרעינית. המדרון נגזר מן השיעור ההתחלתי ליניארי של עקומת התשואות קצב הכניסה V מקסימום לתוך הגרעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את המדרונות V מקסימום של כל תיקון התא, נגזר שלושה עד חמישה ניסויים עצמאיים, באמצעות תוכנת גרפים לייצר מדרון אחד המייצג כל קבוצה ניסיונית. בצע כימות באמצעות ניתוח סטטיסטי חד כיווני ANOVA. </li></ol> 5. אימות חלבון ואלידציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 60 מנות תרבות מ&quot;מ המכילים תאים שיורית (לא נעשה שימוש בניסוי לעיל) מכל קבוצה ניסיונית על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשליך את המדיום לשטוף את התאים פעמיים עם PBS לדלל ולשטוף את המדיום שנותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפל בתאים עם 200-400ΜL של חיץ תמוגה המכיל PBS, 0.5% Triton, ו פרוטאז מעכב קוקטייל Tablet (PI). לגרד באמצעות מגרד תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את התאים במאגר תמוגה בצינור microcentrifuge ו homogenize עם homogenizer בסל&quot;ד 4,000 דקות 1 מתחת לקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאים homogenized ב 2,500 xg במשך 10 דקות. איסוף supernatant, לכמת את ריכוז החלבון באמצעות assay Bradford, ולאחסן עד לשימוש ב -20 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף בין 30 ו - 70 מיקרוגרם של חלבון הכולל (תלוי בחלבון) לטעון אותו לתוך ג&#39;ל SDS-PAGE לבדיקת ביטוי חלבון באמצעות assay immunoblot. </li></ol>

<ol><li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlberts%2C+B+%22Molecular+biology+of+the+cell%22">Molecular biology of the cell</a>. , 4th edn, Garland Science. (2002).</li>
<li>Freitas, N., Cunha, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+signals+for+the+nuclear+import+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genomics%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and signals for the nuclear import of proteins.</a> Curr Genomics. 10, 550-557 (2009).</li>
<li>Kalderon, D., Roberts, B. L., Richardson, W. D., Smith, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short+amino+acid+sequence+able+to+specify+nuclear+location%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A short amino acid sequence able to specify nuclear location.</a> Cell. 39, 499-509 (1984).</li>
<li>la Cour, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+prediction+of+leucine-rich+nuclear+export+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng+Des+Sel%22%5BJournal%5D)">Analysis and prediction of leucine-rich nuclear export signals.</a> Protein Eng Des Sel. 17, 527-536 (2004).</li>
<li>Boeynaems, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+screen+connects+nuclear+transport+genes+to+DPR+pathology+in+c9ALS%2FFTD%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD.</a> Sci Rep. 6, 20877(2016).</li>
<li>Freibaum, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GGGGCC+repeat+expansion+in+C9orf72+compromises+nucleocytoplasmic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport.</a> Nature. 525, 129-133 (2015).</li>
<li>Jovicic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifiers+of+C9orf72+dipeptide+repeat+toxicity+connect+nucleocytoplasmic+transport+defects+to+FTD%2FALS%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS.</a> Nat Neurosci. 18, 1226-1229 (2015).</li>
<li>Kwon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly-dipeptides+encoded+by+the+C9orf72+repeats+bind+nucleoli%2C+impede+RNA+biogenesis%2C+and+kill+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeats bind nucleoli, impede RNA biogenesis, and kill cells.</a> Science. 345, 1139-1145 (2014).</li>
<li>Rossi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+accumulation+of+mRNAs+underlies+G4C2-repeat-induced+translational+repression+in+a+cellular+model+of+C9orf72+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Nuclear accumulation of mRNAs underlies G4C2-repeat-induced translational repression in a cellular model of C9orf72 ALS.</a> J Cell Sci. 128, 1787-1799 (2015).</li>
<li>Shi, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+PRn+poly-dipeptides+encoded+by+the+C9orf72+repeat+expansion+block+nuclear+import+and+export%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Toxic PRn poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeat expansion block nuclear import and export.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).</li>
<li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C9orf72+repeat+expansion+disrupts+nucleocytoplasmic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport.</a> Nature. 525, 56-61 (2015).</li>
<li>Zhang, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C9ORF72+poly%28GA%29+aggregates+sequester+and+impair+HR23+and+nucleocytoplasmic+transport+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">C9ORF72 poly(GA) aggregates sequester and impair HR23 and nucleocytoplasmic transport proteins.</a> Nat Neurosci. 19, 668-677 (2016).</li>
<li>Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Charcot+to+Lou+Gehrig%3A+deciphering+selective+motor+neuron+death+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS.</a> Nat Rev Neurosci. 2, 806-819 (2001).</li>
<li>DeJesus-Hernandez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+GGGGCC+hexanucleotide+repeat+in+noncoding+region+of+C9ORF72+causes+chromosome+9p-linked+FTD+and+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS.</a> Neuron. 72, 245-256 (2011).</li>
<li>Renton, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hexanucleotide+repeat+expansion+in+C9ORF72+is+the+cause+of+chromosome+9p21-linked+ALS-FTD%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD.</a> Neuron. 72, 257-268 (2011).</li>
<li>Boeve, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+frontotemporal+dementia+and%2For+amyotrophic+lateral+sclerosis+associated+with+the+GGGGCC+repeat+expansion+in+C9ORF72%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Characterization of frontotemporal dementia and/or amyotrophic lateral sclerosis associated with the GGGGCC repeat expansion in C9ORF72.</a> Brain. 135, 765-783 (2012).</li>
<li>Haeusler, A. R., Donnelly, C. J., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expanding+biology+of+the+C9orf72+nucleotide+repeat+expansion+in+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The expanding biology of the C9orf72 nucleotide repeat expansion in neurodegenerative disease.</a> Nat Rev Neurosci. 17, 383-395 (2016).</li>
<li>Woerner, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+protein+aggregates+interfere+with+nucleocytoplasmic+transport+of+protein+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic protein aggregates interfere with nucleocytoplasmic transport of protein and RNA.</a> Science. 351, 173-176 (2016).</li>
<li>Tao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleolar+stress+and+impaired+stress+granule+formation+contribute+to+C9orf72+RAN+translation-induced+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Nucleolar stress and impaired stress granule formation contribute to C9orf72 RAN translation-induced cytotoxicity.</a> Hum Mol Genet. 24, 2426-2441 (2015).</li>
<li>Wen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+proline-arginine+RAN+dipeptides+linked+to+C9ORF72-ALS%2FFTD+form+toxic+nuclear+aggregates+that+initiate+in+vitro+and+in+vivo+neuronal+death%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death.</a> Neuron. 84, 1213-1225 (2014).</li>
</ol>

למחברים אין מה לגלות.

פרוטוקול זה מדגים assay חדש רגיש וכמותי חדש להעריך שינויים דקה התחבורה nucleocytoplasmic. באמצעות מערכת זו, ניתן לבחון ולמדוד התחבורה nucleocytoplasmic ואת תפקוד לקוי שלה בזמן אמת, לא רק פגמים גדולים המביאים לשינויים דרמטיים בחלוקה חלבון. Assay זה לא רק יש יתרון רגישות, אבל זה גם דורש הכנה קטנה, הוא זול, והוא מבחין קל מאוד מעורבות נמוכה. כדי לבחון את היעילות של מערכת זו, C9orf72 חלבונים, פולי (GR) ו פולי (PR) DPR...

קומפלקס הגרעין הגרעיני (NPC) שולט ביבוא וביצוא של מולקולות גדולות אל תוך גרעין התא וממנו. בניגוד מולקולות קטנות, אשר יכול להיכנס לגרעין ללא תקנה 1 , הובלה של מולקולות גדולות נשלטת מאוד על ידי NPC. מולקולות גדולות אלה, כגון חלבונים ורנ&quot;א, מקושרות לגורמי תובלה, כולל יבואנים ויצואנים, לייבוא ​​ולייצוא מהגרעין 2 . כדי לייבא, חלבונים חייבים להכיל מוטיב פפטיד קטן, הנקרא בדרך כלל אות לוקליזציה גרעינית (NLS), אשר מחויב על ידי importins 2 . רצפים אלה של חומצות אמינו לשמש תג והם מגוונים בהרכב 3 , 4 . חלבונים ניתן לייצא מן הגרעין כדי הציטופלסמה בשל הקשר שלהם עם exportinS, אשר נקשרים רצף האות, נקרא בדרך כלל אות הייצוא הגרעיני (NES) 2 . הן importins ו exportins מסוגלים להעביר את המטען שלהם עקב הרגולציה של קטן ראס הקשורים חלבון גרעיני GTPase (רן) 2 . רן הוכח להתקיים במצבים קונפורמטיביים שונים, תלוי אם הוא קשור ל- GTP או לתוצר. כאשר מחויב ל- GTP, רן יכול להיקשר לייבוא ​​או לייצוא. עם החובה ל- RanGTP, היבואנים משחררים את מטענם, ואילו היצואנים חייבים לחייב את רנג-טאפ כדי ליצור קומפלקס עם מטען היצוא שלהם. מצב נוקליאוטיד הדומיננטי מחייב של רן תלוי במיקום שלה בגרעין (RanGTP) או הציטופלסמה (RanGDP). לאחרונה, מספר מחקרים הראו קשר בין ליקויים בנתיב nucleocytoplasmic לבין טרשת לרוחב amyotrophic (ALS) ו דמנציה frontotemporal (FTD) 5 , 6 </sup&gt; , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . ALS היא מחלה נוירודגנרטיבית פרוגרסיבית וקטלנית המשפיעה על שני נוירונים מוטוריים עליונים ותחתונים (MNs) 13 וכתוצאה מכך שיתוק ובסופו של דבר למוות, בתוך 2-5 שנים בממוצע. רוב המקרים של ALS מסווגים כ- SPS, ללא כל קשר גנטי לכאורה, אך 10% הם בירושה באופן דומיננטי (ALS משפחתי, FALS). לאחרונה, hexanucleotide הרחבות חוזרות (HREs) של כרומוזום 9 פתוח מסגרת הקריאה 72 (C9orf72) הגן זוהו 14 , 15 כגורם גנטי של ALS ו FTD. מוטציות אלה מהווים 30-40% מהמקרים של FALS 16 , ומחקרים שונים טענוכי הם גורמים לרעילות על ידי המשפיעים על התחבורה nucleocytoplasmic 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . מחקרים אלה הראו בעיקר את התוצאות הסופיות ואת הביטויים של HRS על התחבורה nucleocytoplasmic, אבל הם לא מראים הפרעה nucleocytoplasmic בזמן אמת. כתוצאה מכך, רק מחסור חמור nucleocytoplasmic התחבורה הוערך 11 , 17 , 18 . פרוטוקול זה מתאר חדש וישAssay רגיש להעריך להעריך לכמת nucleocytoplasmic תפקוד לקוי בזמן אמת. שיעור היבוא של NLS-NES-GFP חלבון (מעבורת-GFP) ניתן לכמת בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. זה נעשה באמצעות מעכב exportin, כפי שתואר קודם לכן 18 , ובכך מאפשר המעבורת- GFP רק כדי להזין את הגרעין. באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט תוכנה לכימות שינויי פלורסנט בזמן אמת, ניתן לכמת שינויים הדרגתיים בעוצמת הקרינה של המעבורת- GFP, הממוקם בגרעין. כתוצאה מכך, עקומת הרוויה Michaelis-Menten כמו של ציר הקרינה אל הזמן, המייצג את כמות המעבורת הגרעינית- GFP בכל זמן נתון, ניתן לבצע. באמצעות שיעור ליניארי הראשוני של הקימורים, ניתן ליצור מדרון, אשר מייצג את שיעור הכניסה לגרעין לפני הרוויה הקרינה. כדי לאמת את assay, לתרגםD C9orf72 dipeptide חוזר, פולי (GR) ו פולי (יחסי ציבור), אשר דווחו בעבר כדי לשבש את התחבורה nucleocytoplasmic, שימשו 5 , 7 , 8 , 10 , 12 . באמצעות assay זה, ירידה של 50% בשיעור היבוא הגרעיני נצפתה בהשוואה לשליטה. באמצעות מערכת זו, שינויים דקה התחבורה nucleocytoplasmic ניתן לבדוק. יתר על כן, היכולת של גורמים שונים כדי להציל פגם תחבורה nucleocytoplasmic ניתן לקבוע.

<table><tbody><tr><td>קו תאים היברידי דמוי נוירון מוטורי עכבר (NSC-34)</td><td>tebu-bio</td><td>CLU140-A</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 4.5 גרם/ליטר L-גלוקוז</td><td>תעשיות ביולוגיות</td><td>01-055-1A</td><td></td></tr><tr>FBS <td>תעשיות ביולוגיות</td><td>בדרגה אירופאית</td><td>04-007-1A</td><td></td></tr><tr><td>SL 16R צנטריפוגה</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>75004030</td><td></td></tr><tr><td>תרמו פורמה סדרה ii מעטפת מים CO2 אינקובטור</td><td>Thermo Scientific</td><td>3111</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית 12 מ"מ קוטר, עובי 0.13-0.17 מ"מ</td><td>בר נאור בע"מ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TurboFect Transfection Reagent</td><td>Thermo Scientific</td><td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R0531">R0531</a></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 100 מיקרוסקופ הפוך</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>הדמיה Workbench 2</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leptomycin B</td><td>Sigma</td><td>L2913</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>תעשיות ביולוגיות</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>הומוגנייזר מנוע/בקרה/צ'אק/מהדק 90 מעלות</td><td>Glas-Col</td><td>099C K5424CE</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה MicroCL 17R, קירור</td><td>תרמו מדעי</td><td>75002455</td><td></td></tr></tbody></table>

assay למדוד nucleocytoplasmic התחבורה בזמן אמת בתוך מוטורי נוירון כמו nsc-34 תאים

Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

התחבורה Nucleocytoplasmic מתייחס יבוא ויצוא של מולקולות גדולות מן הגרעין התא. לאחרונה, מספר מחקרים הראו קשר בין טרשת לרוחב האמיטרופית (ALS) לבין ליקויים במסלול nucleocytoplasmic. ALS היא מחלה נוירודגנרטיבית המשפיעה על נוירונים מוטוריים וכתוצאה מכך שיתוק ובסופו של דבר למוות, בתוך 2-5 שנים בממוצע. רוב המקרים של ALS הם ספורדיים, ללא כל קישור גנטי לכאורה, אבל 10% יורשים באופן דומיננטי. לאחרונה, hexanucleotide הרחבות חוזרות (HREs) ב chromosome 9 פתוח מסגרת הקריאה 72 (C9orf72) הגן זוהו כגורם גנטי של ALS ו דמנציה פרונטוטמפוראל (FTD). חשוב לציין, קבוצות שונות הציעו לאחרונה כי מוטציות אלה משפיעות על התחבורה nucleocytoplasmic. מחקרים אלה הראו בעיקר את התוצאה הסופית ואת הביטויים שנגרמו על ידי HRS על התחבורה nucleocytoplasmic, אבל הם לא מראים תפקוד התחבורה הגרעינית בזמן אמת. כתוצאה מכך, רק מחסור חמור nucleocytoplasmic התחבורה ניתן לקבוע, בעיקר בשל overexpression גבוה או הכנסת חלבון אקסוגני. פרוטוקול זה מתאר assay חדש ורגיש מאוד להעריך לכמת תפקוד לקוי nucleocytoplasmic בזמן אמת. שיעור היבוא של NLS-NES-GFP חלבון (מעבורת-GFP) ניתן לכמת בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. זה מבוצע באמצעות מעכב exportin, ובכך מאפשר המעבורת GFP רק כדי להזין את הגרעין. כדי לאמת את assay, C9orf72 HRE מתורגם חוזר dipeptide, פולי (GR) ו פולי (PR), אשר הוכחו בעבר לשבש את התחבורה nucleocytoplasmic, שימשו. באמצעות assay המתואר, ירידה של 50% בשיעור היבוא הגרעיני נצפתה בהשוואה לשליטה. באמצעות מערכת זו, שינויים זעירים בתחבורה nucleocytoplasmic ניתן לבחון את היכולת של גורמים שונים כדי להציל (אפילו באופן חלקי) nucleocytoplasmic trפגם ansport ניתן לקבוע.

באמצעות הנוהל המוצג כאן, נוירון כמו מנוע NSC-34 תאים היו transfected עם NLS-NES-GFP (מעבורת- GFP) חלבון. חלבון זה, אשר NLS ו- NES רצפים האות ( איור 1 ), יכול מעבורת בין הגרעין לבין הציטופלזמה. Generic GFP יכול להיכנס או לצאת הגרעין בהעדר כל תג לוקליזציה רק ​​על ידי דיפוזיה ולכן מופץ באופן שווה בין הגרעין לבין הציטופלזמה ( איור 2 א ). לעומת זאת, המעבורת- GFP חלבון נמצא בעיקר בציטופלסמה בשל האות NES ו- NLS המשפיעים ע...

פרוטוקול זה מתאר שיטה רגיש למדוד את קצב ההעברה nucleocytoplasmic בתוך נוירון כמו NSC-34 תאים תאים על ידי כימות השינוי בזמן אמת ביבוא גרעיני של חלבון NLS-NES-GFP.

Assay למדוד Nucleocytoplasmic התחבורה בזמן אמת בתוך מוטורי נוירון כמו NSC-34 תאים

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

המטרה הכוללת של בדיקה זו היא לזהות שינויים זעירים בקצב התובלה הנוקלאו-ציטופלזמית של תאים בזמן אמת, בהיעדרם או בנוכחותם של מולקולות בעלות פוטנציאל לדיכוי קצב התובלה. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח לגבי מחלות נוירו-גנטיות ספציפיות כגון ALS, אשר הוצע כי הן משפיעות לרעה על התובלה הנוקלאו-ציטופלזמית. חלק מהיתרונות של טכניקה זו הם רגישות גבוהה ויכולת כימות, וכן היא מאפשרת ניתוח בזמן אמת של שינויים זעירים בקצב התובלה הנוקלאו-ציטופלזמית.את הפרוצדורה ידגים טום שאני, סטודנט לתואר מתקדם מהמעבדה שלי. התחילו בהפשרה של כ-10⁶ תאי נוירובלומה של חוליה של עכבר מאחסון בחנקן נוזלי בתוך אמבט מים בטמפרטורה של 37 °C. כאשר התאים מופשרים לחלוטין, אספו אותם באמצעות סרכזגה, וסספנדו מחדש את המשקע ב-1 mL של מצע טרי.לאחר מכן, העבירו את התאים לבקבוק (flask) של 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של מצע גידול תאים לדגירה למשך לילה ב-37 °C וב-5% carbon dioxide. כאשר התאים מגיעים ל-90% confluency, הניחו שמונה כיסויי זכוכית (cover slips) ללא ציפוי בצלחות תרבית נפרדות של 60 מילימטר ועקרו את כיסויי הזכוכית באמצעות 70% ethanol. ייבשו את כיסויי הזכוכית תחת אור UV למשך 30 דקות.כאשר הזכוכית יבשה, שטפו את לביבות הכיסוי במצע טרי כדי להסיר את שאריות האתנול. כאשר לביבות הכיסוי מוכנות, בצעו דיסוציאציה לתאי הנוירובלסטומ

assay-to-measure-nucleocytoplasmic-transport-real-time-within-motor

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מיקרוסקופיה מולקולה בודדת approch סיפק תובנות הרומן לתוך התחבורה גרעיני.

מולקולה בודדת הדמיה התחבורה גרעיני

פרוטוקול זה מתאר את מיצוי החלבונים מתאי סרטן עצביים. התאים נשטפים בחיץ ועוברים שיבוש אנזימטי ומכני. הסופרנאטנט העשיר בחלבון המופק נאסף לאחר צנטריפוגה.

מיצוי חלבונים מתאי עצב

הובלה תוך-תאית של מטענים, כגון שלפוחיות או אברונים, מתבצעת על ידי חלבונים מוטוריים מולקולריים העוקבים אחר מיקרו-צינורות מקוטבים. פרוטוקול זה מתאר את המתאם בין כיווניות ההובלה של חלקיקי מטען בודדים הנעים בתוך נוירונים, לכמות היחסית והסוג של חלבונים מוטוריים קשורים.

ניתוח &quot;מטען מיפוי&quot; המאפיין את ההרכב מולקולרי מוטורס על העברת axonal מטענים שימוש

החקירה של סחר קרום הוא חיוני להבנת תפקודים נוירונים. כאן, אנו מציגים שיטה לכימות תנועתיות שלפוחית ​​נוירונים. זוהי שיטה נוחה שניתן להתאים את כימות של סחר קרום במערכת העצבים.

כימות של Endosome ו Lysosome Motilities ב נוירונים תרבותיים באמצעות בדיקות פלואורסצנטי

Caenorhabditis elegans (C. elegans) הוא מודל טוב ללמוד תחבורה עצב, תאיים. . הנה, אני מתארת פרוטוקול ויוו הקלטה וניתוח התחבורה עצב, intraflagellar C. elegans.

קיבעון של Caenorhabditis elegans לנתח להובלה תאיים בנוירונים

הובלה מיטוכונדריאלי לקויה ומורפולוגיה מעורבים במחלות ניווניות שונות. הפרוטוקול המוצג משתמש מושרה המושרה תא גזע הנגזרת הנוירונים המוח כדי להעריך הובלה מיטוכונדריאלי ומורפולוגיה ב מפרסטית תורשתית. פרוטוקול זה מאפשר אפיון של סחר מיטוכונדריאלי לאורך אקסונים וניתוח של מורפולוגיה שלהם, אשר להקל על המחקר של מחלות ניווניות.

ניתוח הובלה מיטוכונדריאלי ומורפולוגיה בתאי גזע בעלי השפעה של האדם המושרה בנוירונים

אנו מתארים שיטות פוטואקטיביות פלואורסצינטיות כדי לנתח את ההובלה האקסונלית של neurofilaments באקסונים מינרטיים בודדים של עצבים היקפיים מעכברים טרנסגניים המבטאים חלבון neurofilament פוטואקטיבי.

הדמיה וניתוח של תעבורת Neurofilament בעצב שוקה עכבר excised

באמצעות עכברים פלואורסצנטיים מהונדסים, מתוארים פרוטוקולים מפורטים להערכת הובלה אקסונאלית in vivo של אנדוזומים איתות ומיטוכונדריה בתוך אקסונים מוטוריים וחושיים של העצב הסיאטי השלם בחיות חיות.

הרחבת ערכת הכלים להדמיית In Vivo של תחבורה אקסונלית

פרוטוקול זה מתאר כיצד להגדיר ולבצע ביעילות ניתוחים אוטומטיים של נתוני הדמיה של תאים חיים המתקבלים ממעקב אחר ההובלה הנוקליאוציטופלזמית באמצעות כלים אופטוגנטיים.

שימוש בכלים אופטוגנטיים של LEXY ו-LINuS וניתוח תמונות אוטומטי כדי לכמת דינמיקת הובלה נוקלאוציטופלזמית בתאים חיים

הסרטון הנוכחי מדגים שיטה אשר מנצל שילוב של electroporation ו מיקרוסקופיה confocal לבצע הדמיה לחיות על הפרט ובתאים עצבית forebrain דג הזברה מתפתח.

זמן לשגות הדמיה חיה של Related Clonally ובתאים עצבית של פיתוח דג הזברה forebrain

למדו לכמת בזמן אמת הפרעות בהובלה גרעינית-ציטופלזמית בתאי NSC-34 מוטוריים. השיטה מאפשרת זיהוי שינויים עדינים בקצב ייבוא גרעיני ומסייעת במחקר מחלות נוירודגנרטיביות כמו ALS.

Assay למדוד Nucleocytoplasmic התחבורה בזמן אמת בתוך מוטורי נוירון כמו NSC-34 תאים

גלה סרטונים נוספים