Name: הידרוליזה של תנאי Ni-שיף-Base מורכבים באמצעות מתאים שמירת חומצה-רָפִיף קבוצות הגנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: למד שיטה לבידוד חומצות אמינו לא טבעיות מקומפלקס ניקל שיף-בס ולהגנה עליהן ב-Fmoc תחת תנאי pH עדינים. השיטה שומרת על קבוצות הגנה רגישות לחומצה ומתאימה לסינתזת פפטידים בשלב מוצק.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

במימון Slippery Rock האוניברסיטה. ברצוננו להודות ט בורון III (אוניברסיטת סלע חלקלק) ו ג הייני (אוניברסיטת פנסילבניה) על התובנות שלהם.

1. הידרוליזה של קומפלקס Ni-שיף-Base <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 1 מילימול של המתחם Ni-PBP-שיף-בסיס ב 40 מ&quot;ל של N, -dimethylformamide N (DMF) עם בוחש בה 250 מ&quot;ל עגול הבקבוק התחתון בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 60 מ&quot;ל של 0.2 פתרון EDTA מימית M, 4.5 pH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בר ומערבבים מגנטי ומערבבים צלחת, ומערבבים הפתרון המשולב לילה. כמתחם שיף-בסיס הוא הידרוליזה, הצבע יהיה לעבור ממדיניות מוניטרית אדום עמוק ללבן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלמת התגובה כפי שצוין על ידי בהעדר כל צבע אדום, להעביר את התגובה משפך 250 מ&quot;ל separatory. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 50 מ&quot;ל dichloromethane, מכסה את המשפך separatory, ומערבבים. מסננים את לשטוף אורגני לתוך מבחנה פסולת. חזור על תהליך זה שלוש פעמים כדי להסיר PBP וכל מורכבים Ni-PBP-שיף-בסיס שיורית. אסוף את השכבה המימית שנותרה בבקבוק תחתי עגול 250 מיליליטר. </li></ol> 2. הגנה Fmoc של Hydrolyzed חומצת אמינו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li&gt; התאם את השכבה המימית המבודדת משלב 1.5 לעיל ל- pH 7 באמצעות סודיום ביקרבונט מוצק. בדוק מעת לעת pH באמצעות רצועות מבחן ה- pH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 168 מ&quot;ג סודיום ביקרבונט (2.00 מילימול, 2 equiv) לפתרון ומערבבים בעזרת בר ומערבבים מגנטי ומערבבים צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 337 אסתר Fmoc N -hydroxysuccinimide מ&quot;ג (1.00 מילימול, 1 equiv) בסכום מינימלי של dioxane (בערך 4 או 5 מ&quot;ל) ב בקבוקון 10 מ&quot;ל. העבר פתרון זה בתמיסה מימית ומערבבים במשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המאפשר תגובה לעורר לילה, להפוך לחומצה הפתרון שהתקבל ל- pH 2 עם 1 חומצה הידרוכלורית M. בדוק מעת לעת pH באמצעות רצועות מבחן ה- pH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את התגובה משפך 250 מ&quot;ל separatory ולהוסיף 50 אתיל אצטט מ&quot;ל. כיסוי או משפך separatory, לערבב היטב, ולאסוף את השכבה האורגנית בבקבוק מ&quot;ל Erlenmeyer 250. חזור על תהליך זה פעמיים נוספות, שילוב תמציות אורגניות. יבש את תמציות אורגניות בשילוב עם בערך 3 גרם של מגנזיום sulfate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכז את התמציות אורגניות בשילוב באמצעות מאייד סיבובי כדי להרשות חומצת אמינו Fmoc המוגנת הגולמית. </li></ol>

<ol><li>Wang, J., Shi, T., Deng, G., Jiang, H., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Enantio-+and+Diastereoselective+Mannich+Reactions+of+Chiral+Ni%28II%29+Glycinates+with+amino+sulfones.+Efficient+asymmetric+synthesis+of+aromatic+%CE%B1%2C%CE%B2-diamino+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Highly Enantio- and Diastereoselective Mannich Reactions of Chiral Ni(II) Glycinates with amino sulfones. Efficient asymmetric synthesis of aromatic α,β-diamino acids.</a> J. Org. Chem. 73 (21), 8563-8570 (2011).</li>
<li>Wang, J., Lin, D., Zhou, S., Ding, X., Soloshonok, V. A., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+synthesis+of+sterically+and+electronically+demanding+linear+%CF%89%2C-trifluoromethyl+containing+amino+acids+via+alkylation+of+chiral+equivalents+of+nucleophilic+glycine+and+alanine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Asymmetric synthesis of sterically and electronically demanding linear ω,-trifluoromethyl containing amino acids via alkylation of chiral equivalents of nucleophilic glycine and alanine.</a> J. Org. Chem. 76 (2), 684-687 (2011).</li>
<li>Wang, J., Zhou, S., Lin, D., Ding, X., Jiang, H., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+diastereo-+and+enantioselective+synthesis+of+syn-%CE%B2%2C-substituted+tryptophans+via+asymmetric+Michael+addition+of+a+chiral+equivalent+of+nucleophilic+glycine+and+sulfonylindoles%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Highly diastereo- and enantioselective synthesis of syn-β,-substituted tryptophans via asymmetric Michael addition of a chiral equivalent of nucleophilic glycine and sulfonylindoles.</a> Chem. Commun. 47 (29), 8355-8357 (2011).</li>
<li>Belokon, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+catalytic+synthesis+of+%CE%B1%2C-amino+acids+under+phase-transfer+conditions+with+a+novel+catalyst%2Fsubstrate+pair%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Highly efficient catalytic synthesis of α,-amino acids under phase-transfer conditions with a novel catalyst/substrate pair.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 40 (10), 1948-1951 (2001).</li>
<li>Zhou, S., Wang, J., Lin, D., Zhao, F., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enantioselective+synthesis+of+2-substituted-tetrahydroisoquinolin-1-yl+glycine+derivatives+via+oxidative+cross-dehydrogenative+coupling+of+tertiary+amines+and+chiral+nickel%28II%29+glycinate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Enantioselective synthesis of 2-substituted-tetrahydroisoquinolin-1-yl glycine derivatives via oxidative cross-dehydrogenative coupling of tertiary amines and chiral nickel(II) glycinate.</a> J. Org. Chem. 78 (22), 11204-11212 (2013).</li>
<li>Belokon, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+%CE%B1%2C-amino+acids+via+asymmetric+phase+transfer-catalyzed+alkylation+of+achiral+nickel%28II%29+complexes+of+glycine-derived+Schiff+bases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Synthesis of α,-amino acids via asymmetric phase transfer-catalyzed alkylation of achiral nickel(II) complexes of glycine-derived Schiff bases.</a> J. Am. Chem. Soc. 125 (42), 12860-12871 (2003).</li>
<li>Ueki, H., Ellis, T. K., Martin, C. H., Soloshonok, V. A. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/ejoc.200200688/abstract">Efficient large-scale synthesis of picolinic acid-derived nickel(II) complexes of glycine.</a> Eur. J. Org. Chem. 2003 (10), 1954-1957 (2003).</li>
<li>Dener, J. M., Fantauzzi, P. P., Kshirsagar, T. A., Kelly, D. E., Wolfe, A. B. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/op010204f">Large-scale syntheses of Fmoc-protected non-proteogenic amino acids: useful building blocks for combinatorial libraries.</a> Org. Process Res. Dev. 5 (4), 445-449 (2001).</li>
<li>Cruz, L. J., Beteta, N. G., Ewenson, A., Albericio, F. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/op049917z">&#34;One-pot&#34;, preparation of N-carbamate protected amino acids via the azide.</a> Org Process Res. Dev. 8 (6), 920-924 (2004).</li>
<li>Hart, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHart%2C+JR+%22Ullmann%27s+Encyclopedia+of+Industrial+Chemistry%22">Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry</a>. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. (2000).</li>
<li>Adamson, J. G., Blaskovich, M. A., Groenevelt, H., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jo00010a050">Simple and convenient synthesis of tert-butyl ethers of Fmoc-serine, Fmoc-threonine, and Fmoc-tyrosine.</a> J. Org. Chem. 56 (10), 3447-3449 (1991).</li>
<li>Seyfried, M. S., Lauber, B. S., Luedtke, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple-turnover+isotopic+labeling+of+Fmoc-+and+Boc-protected+amino+acids+with+oxygen+isotopes%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Lett%22%5BJournal%5D)">Multiple-turnover isotopic labeling of Fmoc- and Boc-protected amino acids with oxygen isotopes.</a> Org. Lett. 12 (1), 104-106 (2010).</li>
<li>Bonke, G., Vedel, L., Witt, M., Jaroszewski, J. W., Olsen, C. A., Franzyk, H. <a target="_blank" href="https://www.thieme-connect.de/DOI/DOI?10.1055/s-2008-1067171">Dimeric building blocks for solid-phase synthesis of α,-peptide-β,-peptoid chimeras.</a> Synthesis. 2008 (15), 2381-2390 (2008).</li>
</ol>

החוקרים אין לחשוף.

הפרוטוקול המתואר לעיל הנו שימושי ביכולתה להקל על הבידוד של עמוד שדרת חומצת אמינו מתסביך Ni-שייף-בסיס בתנאי pH קלים והגנה עוקבת Fmoc של חומצת אמינו מבודדת זו דרך שני שלבים קריטיים. השלב הראשון כולל ערבוב פתרון DMF / מים המכיל EDTA כדי להקל שחרור חומצת אמינו מהמתחם. תוצרי לוואי מורכבים שיורים או אורגניים ניתן להסיר בקלות עם חילוץ. השלב השני של פרוטוקול זה כרוך הגנת Fmoc של חומצות אמינו הנמצאות את השכבה המימית לאחר בידוד על ידי מיצוי בשלב הראשון. הוכחנו את היכולת לשנות נוהל זה במגוון...

חומצות אמינו לא טבעיות שרשרות צד נושאת (של UAA) כי שונות מאלו של עשרים חומצות אמינו נמצאו באופן טבעי בטבע מצאו שירות בתוך טווח רחב של יישומים. סינתזה של UAA של אלה, עם זאת, יכול להיות קשה תלוי במבנה-שרשראות הצד ואת סטראוכימיה של עמוד השדרה חומצת אמינו. הפעלת הקשר CH של גליצין בהקשר של מתחם שיף-בסיס ניקל נעשה שימוש כדי לייצר מגוון של נגזרים חומצת אמינו כולל α, חומצות-diamino β 1 ונושאת של UAA fluorinated 2 או בצד שרשראות heterocyclic. 3 לאחר תוספת של שרשרות צד לא טבעיות, פונקציונלי UAA של כלל מוסרים מהמתחם שייף-הבסיס ידי ריפלוקס חומצה הידרוכלורית 4 ובהמשך המבודד באמצעות כרומטוגרפיה-חילוף יונים. אמנם בדרך כלל יעיל, פרוטוקול זה מייצרחומצות המינים שעשויות להיות מתאים לשימוש סינתזת פפטיד מוצק שלב (SPPS). אופי SPPS מחייב נוכחות של הגנה על קבוצות שרשרת בצד חומצה-רָפִיף ואת אופי חומצי מאוד של תנאי הפירוק טיפוסי Ni-שיף-בסיס מונע בידוד של UAA של עם קבוצות הגנה אלה ללא פגע. למיטב ידיעתנו, רק אחד שיטת פירוק אלטרנטיבה דווחה: שימוש בחומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ו הידרזין בטמפרטורות גבוהות, 5 תנאים עצמם לא יכולים להיות מתאימים כמה שרשרת בצד הגנה על קבוצות כגון phthalimides. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55677/55677fig1.jpg" /> איור 1: סינתזה של Ni-PBP-גלאי מ Ni 2+, PBP, ו גליצין (גלאי). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55677/55677fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> </<html> a&gt; בזאת, אנו מדווחים על שיטה הידרוליזה של קומפלקס Ni-שיף-בסיס, Ni-PBP-גלאי (איור 1). מורכבות זו, נגזרת Ni 2+, גליצין, וחומצה קרבוקסילית-פירידין-2 (2-בנזואיל-פניל) -amide (PBP), 6 הודגמה להיות פלטפורמה שימושית עבור סינתזה של מגוון UAA של והוא בקלות נגיש באמצעות מסלול סינטטי שני שלבים. סינתזה 7 של מורכבות זו היא-precedented ספרות בתשואה גבוהה. 6 התוצאות שלנו מפורטות להלן להדגים את תחולת התנאים הידרוליזה ניצול EDTA ב במתינות חומצי לתנאי pH ניטראליים המתאים לשימוש עם הגנה על קבוצות השרשרת בצד החומצה-יציבה בעמידתו של UAA. בעקבות הידרוליזה, הפתרון מימי וכתוצאה אפשר לבודד נתון מייד לתנאי הגנת Fmoc תקן להרשות חומצת אמינו-מוגנת Fmoc (איור 2). o: לשמור-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55677/55677fig2.jpg" /> איור 2: הידרוליזה Fmoc-הגנה של חומצת אמינו מבודדת מן Ni-PBP-גלאי. תנאי תגובה: i. EDTA (12 equiv), pH 4.5; ii. אתיל אצטט לשטוף וכוונון ל- pH 7; iii. Fmoc-אוס (1 equiv), NaHCO 3 (2 equiv). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55677/55677fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

<table><tbody><tr><td>Ni-PBP-Gly</td><td></td><td></td><td>מסונתז מהפרוטוקול שפורסם</td></tr><tr><td>DMF</td><td>Fisher</td><td>D119-4</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S311-100</td><td></td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>Acros</td><td>AC610050040</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>Fisher</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-OSu</td><td>Chem-Impex</td><td>"00147"</td><td></td></tr><tr><td>דיוקסאן</td><td>פישר</td><td>D111-500</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>פישר</td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>אתיל</td><td>אצטט אקרוס</td><td>AC610060040</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי</td><td>פישר</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>ZEOPrep 60ECO סיליקה ג'ל</td><td>ZEOChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>הקסאנס</td><td>פישר</td><td>3200250.650.443</td><td></td></tr><tr><td>רצועות</td><td></td><td></td> בדיקת pH עמוד <td></td>כרומטוגרפיה</tr><tr><td>מאייד</td><td></td><td></td><td></td>סיבובי</tr><tr><td>250 מ"ל משפך</td><td></td><td></td><td></td>הפרדה</tr><tr><td>250 מ"ל צלחת</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ערבוב</td><td></td><td></td><td></td></tr> בקבוק תחתון עגול <tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הידרוליזה של תנאי ni-שיף-base מורכבים באמצעות מתאים שמירת חומצה-רָפִיף קבוצות הגנה

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

חומצות אמינו לא טבעיות, חומצות אמינו המכילות פונקציות שרשרת צד לא נראות לרוב בטבע, נמצאות יותר ויותר רצפים פפטיד סינטטיים. סינתזה של כמה חומצות אמינו לא טבעיות כוללת בדרך כלל את השימוש מבשר מורכב שייף-בסיס התייצב ידי קטיון ניקל. ניתן להתקין בצד שרשראות טבעי על עמוד השדרה חומצת אמינו הנמצאת במתחם שיף-בסיס זה. חומצת האמינו טבעי וכתוצאה מכך יכול להיות מבודד אז הידרוליזה באמצעות מורכבות זו של בסיס שיף, בדרך כלל על ידי העסקת ריפלוקס בתמיסה חומצית מאוד. תנאים חומציים ביותר אלה עשויים להסיר שרשרת הצד רָפִיף-חומצה הגנה על קבוצות הכרחי חומצות אמינו לא טבעיות כדי לשמש סינתזה פפטיד מוצק שלב מיקרוגל בסיוע. בעבודה זו, אנו מציגים הידרוליזה יעיל והגנה Fmoc הבאות של חומצת אמינו מבודדת מתסביך בסיס Ni-שיף. תנאים הידרוליזה שהוצגו בעבודה זו מתאימים שמירה של ים חומצה-רָפִיףIDE-שרשרת הגנה על קבוצות ועשויות להיות להתאמה למגוון של מצעי חומצות אמינו לא טבעיים.

החוקרים שיערו כי הסרת Ni 2+ מהמתחם Ni-PBP-גלאי עלולה לאפשר הידרוליזה מימית יעיל של בסיס שיף ללא צורך בתנאים קשים pH. כמו EDTA הוא סוכן chelating זול היטב למד, 10 שיערנו כי תוספת של EDTA לפתרון של Ni-PBP-גלאי יקל קלאציה של יוני Ni 2+, ובכך לקדם הידרוליזה של המתחם. כדי לבחון את התיאוריה שלנו כי EDTA לבד י...

כאן, אנו מציגים הידרוליזה יעיל והגנה Fmoc הבאות של חומצת אמינו מבודדת מתסביך Ni-שיף-בסיס. תנאים הידרוליזה שהוצגו כאן מתאימים לשימוש כאשר השמירה של קבוצות הגנה חומצה-רָפִיף בצד שרשרת נדרשת. טכניקה זו עשויה להיות להתאמה למגוון של מצעי חומצות אמינו לא טבעיים.

הידרוליזה של תנאי Ni-שיף-Base מורכבים באמצעות מתאים שמירת חומצה-רָפִיף קבוצות הגנה

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא בידוד נוח של חומצות אמינו לא טבעיות מקומפלקס של בסיס שיפט עם ניקל, וביצוע הגנה של חומצות אמינו אלו באמצעות Fmoc לאחר מכן. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הכימיה האורגנית, כגון דרכים לייצול קל יותר של חומצות אמינו לא טבעיות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת בידוד של חומצות אמינו בעלות קבוצות מגן של שרשרת צד רגישות לחומצה מקומפלקס של בסיס שיפט עם ניקל.אנשים שאינם מכירים את השיטה זו יתקשו בביצועה, מכיוון שהמסיסות של קומפלקס הניקל בממסים אורגניים היא מוגבלת. DMF הוא הממס המתאים ביותר כיוון שהוא יכול להמיס את הקומפלקס והוא ניתן לערבוב עם מים. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה בעקבות תובנה שקיבלנו מהפרופסור לקמימיה אנאורגנית שלנו, Dr.Boron, בנוגע לניקל ולסוכני קילוצולציה של מתכות.כדי להתחיל בהליך זה, הוסף 40 milliliters של DMF לבקבוק תחתית עגולה בנפח 250 milliliters. המס מילימול אחד של קומפלקס בסיס שיפט PBB של ניקל ב-DMF תוך כדי ערבוב בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסף 60 milliliters של תמיסת EDTA מימי 0.2 molar ב-pH 4.5.בעזרת מגנט Stir bar ופלטת ערבוב, ערבבו את התמיסה למשך לילה. לאחר השלמת התגובה, העבירו את התמיסה למשפך הפרדה של 250 milliliter. הוסיפו 50 milliliters של DCM.לאחר מכן, סגרו את המשפך המפריד וערבבו. רשמו את השטיפה האורגנית לכלי איסוף פסולת. חזרו על תהליך הוספת ה-DCM, הערבוב והסרת השטיפה האורגנית שלוש פעמים.לאחר מכן, אספו את השכבה המימית שנותרה לבקבוק תחתית עגולה בנפח 250 milliliter. ראשית, השתמשו בנתרן ביקרבונט מוצק כדי לכוונן את ה-pH של השכבה המימית המבודדת ל-pH שבע. לאחר מכן, הוסיפו 168 milligrams נתרן ביקרבונט.ערבבו את התמיסה באמצעות מקלו מגנט ופלטת ערבוב. חיוני לכוון את ה-pH ל-7 לפני הוספת שתי מולקולות שוות (equivalents) של sodium bicarbonate. הדבר חשוב מכיוון שהתמיסה צריכה להיות בסיסית קלות כדי להקל על הגנת ה-Fmoc.במבחנה בנפח 10 מיליליטר המיסו 337 מיליגרם של Fmoc ו-hydroxysuccinimide ester וחמישה מיליליטר של dioxane. העבירו תערובת זו לתמיסה המימית וערבבו למשך לילה. למחרת, השתמשו בחומצה כלורית בריכוז one molar כדי להחמיץ את התמיסה עד ל-pH שתיים.לאחר העברה זו, העבירו את התגובה למשפך הפרדה של 250 milliliters. הוסיפו 50 milliliters של FO-acetate. חשוב שה-pH לא יירד מתחת לשניים ושהשלב יושלם במהירות.אי-ביצוע שלב זה עלול להוביל לאובדן של קבוצות מגן של שרשראות הצד. סגרו את המשפך המפריד וערבבו היטב. לאחר מכן, אספו את השכבה האורגנית לבקבוק ארלנמאייר בנפח 250 milliliter.חזור על תהליך הוספת ethyl acetate, הערבוב ואיסוף השכבה האורגנית פעמיים נוספות, ואיחד את התמציות האורגניות. לאחר מכן, ייבש את התמציות האורגניות המאוחדות באמצעות כ-3 גרם של magnesium sulfate. בעזרת rotary evaporator, רכז את התמציות האורגניות המאוחדות כדי לקבל את חומצת האמינו מוגנת Fmoc הגולמית.במחקר זה, שלד של חומצת אמינו מבודל מקומפלקס בסיס שיפט של ניקל תחת תנאי pH מתונים, ולאחר מכן עובר הגנה באמצעות Fmoc בשני שלבים קריטיים. בשלב הראשון, תמיסת DMF ומים המכילה EDTA נערבבת כדי להקל על שחרור חומצת האמינו מהקומפלקס. לאחר בידוד ומיצוי של חומצת האמינו שהשתחררה, היא נחשפת לתנאי הגנה של Fmoc, מה שמוביל לקבלת חומצת אמינו מוגנת Fmoc.את התקדמות תגובת ההידרוליזה עוקבים באמצעות ניטור שינוי הצבע של התמיסה מאדום ללבן. תגובות הכוללות פחות משמונה שוות ערך של EDTA מראות מעבר מסוים בצבע אך הן תמיד אינן שלמות. לעומת זאת, תגובות ללא EDTA אינן מראות שינוי בצבע כלל.לפיכך, נדרשים לפחות שמונה מולים של EDTA כדי להביא את התגובה להשלמה. לאחר מכן מוערך ה-pH האפקטיבי על תגובת ההידרוליזה. הידרוליזה מוצלחת נצפית בתנאי pH הנעים בין 4.5 ל-7.5 בטמפרטורת החדר עם ערבוב למשך לילה.דבר זה מדגים את הגמישות של הידרוליזת EDTA. לאחר מכן, היתכנותה של תנאי הידרוליזה אלו נבחנת באמצעות סדרה של חומצות אמינו עם קבוצות הגנה שונות בשרשרת הצד. בכל מקרה, קבוצות ההגנה של שרשרת הצד נשמרו במלואן, כפי שהוכח באמצעות NMR של פרוטונים.ברגע שהטכניקה נלמדת, ניתן לבצע אותה תוך 48 שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להקפיד על רמת ה-pH המפורטת לאורך התהליך. בעקבות פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון הידרוליזה של חומצות אמינו אחרות בעלות קבוצות הגנה בשרשרת הצד הרגישות לחומצה, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון מידת התועלת של טכניקה זו על מגוון סובסטראטים.לאחר פיתוחה, תסלול טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הסינתזה האורגנית לחקור סינתזה של חומצות אמינו לא טבעיות בעלות קבוצות מגן לשרשראות צד רגישות לחומצה. לאחר צפייה בסרטון זה, עליכם להגיע להבנה טובה של אופן בידולם של חומצות אמינו מקומפלקס shift base של ניקל PPB, תוך שימוש בתנאי תגובה עם טווחי pH מתונים. זכרו כי עבודה עם ממסים אורגניים, ובמיוחד DMF, עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון שימוש בציוד מיגון אישי בעת ביצוע הליך זה.

hydrolysis-ni-schiff-base-complex-using-conditions-suitable-for

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

השימוש הבטוח והנכון של ריאגנטים organolithium מתואר.

פרוטוקול תגובות בטוח Lithiation באמצעות ריאגנטים Organolithium

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להסיר aldehydes, קטונים תגובתי תערובות לפי פרוטוקול מיצוי נוזל-נוזל ישירות עם ביסולפיט רווי ב הממס miscible. פרוטוקול משולב זה הוא מהיר ולא נתיישב לביצוע. יכול להיות מחדש על ידי basification של השכבה המימית בודדו את אלדהיד או קטון.

פרידה של Aldehydes, קטונים תגובתי תערובות באמצעות פרוטוקול החילוץ ביסולפאט

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לסינתזה של דו-סוכר נוקלאוזידים מאת regioselective O- גליקוזילציה של ribonucleosides באמצעות הגנה זמנית של שלהם 2', 3'-diol moieties ניצול של אסתר boronic מחזורית. שיטה זו חל על מספר נוקלאוזידים לא מוגן כמו אדנוזין, guanosine, cytidine, uridine, 5-methyluridine 5-fluorouridine לתת נוקלאוזידים דו-סוכר המתאימים.

Regioselective O- גליקוזילציה של נוקלאוזידים via זמני 2', 3'-Diol הגנה על ידי אסתר Boronic לסינתזה של דו-סוכר נוקלאוזידים

הכנת של sns לקחיים קובלט (II) דגמי מתחמים של אלכוהול הכבד דהידרוגנאז מוצג כאן. התסביכים יכול להיות מוכן על ידי התגובה ליקודמן עם cocl2· 6h2O ולאחר מכן יכול להיות recrystallized על ידי מתן המאפשר דיאתיל אתר לפזר לאט לפתרון acetonitrile המכיל את מתחם קובלט.

הכנת SNS קובלט (II) מכלולי מודל מודלים של הכבד אלכוהול דהידרוגנאז

כאן אנו מתארים פרוטוקולים לשבש בתאי יונקים ידי כרסום מצב מוצק בטמפרטורה קריוגני, לייצר תמצית התא מן אבקת התא וכתוצאה מכך, ולבודד קומפלקסים חלבונים של עניין על ידי לכידת זיקה על חרוזים פאראמגנטיים בקנה מידה מיקרון מצמידים נוגדנים.

לכידת חלבון זיקה מורכבת מ בתאי יונקי Cryomilled

מאמר זה מתאר שיטה לחקר חילוף חומרים תאי בקהילות מורכבות של סוגי תאים מרובים, תוך שימוש בשילוב של מעקב איזוטופים יציב, מיון תאים לבידוד סוגי תאים ספציפיים וספקטרומטריית מסה.

שיטה למדידת מטבוליזם ב ממוינות תת-אוכלוסיות של קהילות Cell מורכבות באמצעות איתור איזוטופ יציב

שלפוחיות ענקיות המכילות רכיבים בגודל מיקרומטר ארוזים מאוד הן מודלים שימושיים של תאים. שיטת הצנטריפוגה של תחליב מים בשמן היא כלי פשוט ורב עוצמה להכנת שלפוחיות ענק עם חומרים עטופים.

הכנת ענק שלפוחית ​​encapsulating מיקרוסכמות על ידי צנטריפוגה של אמולסיה מים ב-שמן

שמרים שונה אחד assay היברידית שתוארו כאן היא הרחבה של שמרים קלאסיים אחד היברידית (Y1H) assay ללמוד ולאמת את האינטראקציה מורכבים חלבון ה- DNA heteromeric במערכת heterologous עבור כל מחקר גנומי פונקציונלי.

A השתנה- Hybrid מערכת אחת עבור חלבון Heteromeric מורכבות- DNA אינטראקציה מחקרים

פרוטוקול יעילה לביצוע הביוכימי ומבניים נרחב של איפיון פרוטאין מחייב המצע פחמימות של סטרפטוקוקוס pneumoniae מוצג.

אפיון הביוכימי ומבניים של SP0092 המצע-מחייב-חלבון פחמימות תחבורה

Toeprinting נועד למדוד את היכולת של במבחנה עיבד RNA ל טופס תרגום חניכה מתחמי עם הריבוזומים תחת מגוון תנאים. פרוטוקול זה מתאר שיטה עבור toeprinting בתרבית של RNA והוא יכול לשמש כדי ללמוד תרגום תלויי-קאפ והן מונחות IRES.

ניתוח Toeprinting של תרגום חניכה היווצרות מורכבות על יונקים mRNAs

למד שיטה לבידוד חומצות אמינו לא טבעיות מקומפלקס ניקל שיף-בס ולהגנה עליהן ב-Fmoc תחת תנאי pH עדינים. השיטה שומרת על קבוצות הגנה רגישות לחומצה ומתאימה לסינתזת פפטידים בשלב מוצק.

הידרוליזה של תנאי Ni-שיף-Base מורכבים באמצעות מתאים שמירת חומצה-רָפִיף קבוצות הגנה

גלה סרטונים נוספים