הידרוליזה של תנאי Ni-שיף-Base מורכבים באמצעות מתאים שמירת חומצה-רָפִיף קבוצות הגנה
6 באפריל 2017
כאן, אנו מציגים הידרוליזה יעיל והגנה Fmoc הבאות של חומצת אמינו מבודדת מתסביך Ni-שיף-בסיס. תנאים הידרוליזה שהוצגו כאן מתאימים לשימוש כאשר השמירה של קבוצות הגנה חומצה-רָפִיף בצד שרשרת נדרשת. טכניקה זו עשויה להיות להתאמה למגוון של מצעי חומצות אמינו לא טבעיים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא בידוד נוח של חומצות אמינו לא טבעיות מקומפלקס של בסיס שיפט עם ניקל, וביצוע הגנה של חומצות אמינו אלו באמצעות Fmoc לאחר מכן. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הכימיה האורגנית, כגון דרכים לייצול קל יותר של חומצות אמינו לא טבעיות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת בידוד של חומצות אמינו בעלות קבוצות מגן של שרשרת צד רגישות לחומצה מקומפלקס של בסיס שיפט עם ניקל.
אנשים שאינם מכירים את השיטה זו יתקשו בביצועה, מכיוון שהמסיסות של קומפלקס הניקל בממסים אורגניים היא מוגבלת. DMF הוא הממס המתאים ביותר כיוון שהוא יכול להמיס את הקומפלקס והוא ניתן לערבוב עם מים. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה בעקבות תובנה שקיבלנו מהפרופסור לקמימיה אנאורגנית שלנו, Dr.Boron, בנוגע לניקל ולסוכני קילוצולציה של מתכות.
כדי להתחיל בהליך זה, הוסף 40 milliliters של DMF לבקבוק תחתית עגולה בנפח 250 milliliters. המס מילימול אחד של קומפלקס בסיס שיפט PBB של ניקל ב-DMF תוך כדי ערבוב בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסף 60 milliliters של תמיסת EDTA מימי 0.2 molar ב-pH 4.5.
בעזרת מגנט Stir bar ופלטת ערבוב, ערבבו את התמיסה למשך לילה. לאחר השלמת התגובה, העבירו את התמיסה למשפך הפרדה של 250 milliliter. הוסיפו 50 milliliters של DCM.
לאחר מכן, סגרו את המשפך המפריד וערבבו. רשמו את השטיפה האורגנית לכלי איסוף פסולת. חזרו על תהליך הוספת ה-DCM, הערבוב והסרת השטיפה האורגנית שלוש פעמים.
לאחר מכן, אספו את השכבה המימית שנותרה לבקבוק תחתית עגולה בנפח 250 milliliter. ראשית, השתמשו בנתרן ביקרבונט מוצק כדי לכוונן את ה-pH של השכבה המימית המבודדת ל-pH שבע. לאחר מכן, הוסיפו 168 milligrams נתרן ביקרבונט.
ערבבו את התמיסה באמצעות מקלו מגנט ופלטת ערבוב. חיוני לכוון את ה-pH ל-7 לפני הוספת שתי מולקולות שוות (equivalents) של sodium bicarbonate. הדבר חשוב מכיוון שהתמיסה צריכה להיות בסיסית קלות כדי להקל על הגנת ה-Fmoc.
במבחנה בנפח 10 מיליליטר המיסו 337 מיליגרם של Fmoc ו-hydroxysuccinimide ester וחמישה מיליליטר של dioxane. העבירו תערובת זו לתמיסה המימית וערבבו למשך לילה. למחרת, השתמשו בחומצה כלורית בריכוז one molar כדי להחמיץ את התמיסה עד ל-pH שתיים.
לאחר העברה זו, העבירו את התגובה למשפך הפרדה של 250 milliliters. הוסיפו 50 milliliters של FO-acetate. חשוב שה-pH לא יירד מתחת לשניים ושהשלב יושלם במהירות.
אי-ביצוע שלב זה עלול להוביל לאובדן של קבוצות מגן של שרשראות הצד. סגרו את המשפך המפריד וערבבו היטב. לאחר מכן, אספו את השכבה האורגנית לבקבוק ארלנמאייר בנפח 250 milliliter.
חזור על תהליך הוספת ethyl acetate, הערבוב ואיסוף השכבה האורגנית פעמיים נוספות, ואיחד את התמציות האורגניות. לאחר מכן, ייבש את התמציות האורגניות המאוחדות באמצעות כ-3 גרם של magnesium sulfate. בעזרת rotary evaporator, רכז את התמציות האורגניות המאוחדות כדי לקבל את חומצת האמינו מוגנת Fmoc הגולמית.
במחקר זה, שלד של חומצת אמינו מבודל מקומפלקס בסיס שיפט של ניקל תחת תנאי pH מתונים, ולאחר מכן עובר הגנה באמצעות Fmoc בשני שלבים קריטיים. בשלב הראשון, תמיסת DMF ומים המכילה EDTA נערבבת כדי להקל על שחרור חומצת האמינו מהקומפלקס. לאחר בידוד ומיצוי של חומצת האמינו שהשתחררה, היא נחשפת לתנאי הגנה של Fmoc, מה שמוביל לקבלת חומצת אמינו מוגנת Fmoc.
את התקדמות תגובת ההידרוליזה עוקבים באמצעות ניטור שינוי הצבע של התמיסה מאדום ללבן. תגובות הכוללות פחות משמונה שוות ערך של EDTA מראות מעבר מסוים בצבע אך הן תמיד אינן שלמות. לעומת זאת, תגובות ללא EDTA אינן מראות שינוי בצבע כלל.
לפיכך, נדרשים לפחות שמונה מולים של EDTA כדי להביא את התגובה להשלמה. לאחר מכן מוערך ה-pH האפקטיבי על תגובת ההידרוליזה. הידרוליזה מוצלחת נצפית בתנאי pH הנעים בין 4.5 ל-7.5 בטמפרטורת החדר עם ערבוב למשך לילה.
דבר זה מדגים את הגמישות של הידרוליזת EDTA. לאחר מכן, היתכנותה של תנאי הידרוליזה אלו נבחנת באמצעות סדרה של חומצות אמינו עם קבוצות הגנה שונות בשרשרת הצד. בכל מקרה, קבוצות ההגנה של שרשרת הצד נשמרו במלואן, כפי שהוכח באמצעות NMR של פרוטונים.
ברגע שהטכניקה נלמדת, ניתן לבצע אותה תוך 48 שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להקפיד על רמת ה-pH המפורטת לאורך התהליך. בעקבות פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון הידרוליזה של חומצות אמינו אחרות בעלות קבוצות הגנה בשרשרת הצד הרגישות לחומצה, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון מידת התועלת של טכניקה זו על מגוון סובסטראטים.
לאחר פיתוחה, תסלול טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הסינתזה האורגנית לחקור סינתזה של חומצות אמינו לא טבעיות בעלות קבוצות מגן לשרשראות צד רגישות לחומצה. לאחר צפייה בסרטון זה, עליכם להגיע להבנה טובה של אופן בידולם של חומצות אמינו מקומפלקס shift base של ניקל PPB, תוך שימוש בתנאי תגובה עם טווחי pH מתונים. זכרו כי עבודה עם ממסים אורגניים, ובמיוחד DMF, עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון שימוש בציוד מיגון אישי בעת ביצוע הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה יעילה לבידוד חומצות אמינו לא טבעיות מקומפלקס בסיס שיף של ניקל, ולאחר מכן להגנתן באמצעות קבוצת Fmoc. הפרוטוקול תוכנן במיוחד כדי לשמר קבוצות הגנה של שרשראות צד הרגישות לחומצה, מה שהופך את חומצות האמינו המתקבלות למתאימות לשימוש בסינתזת פפטידים במוצק. השיטה עושה שימוש בתנאי הידרוליזה עדינים והיא ניתנת להתאמה למגוון רחב של סובסטרטים של חומצות אמינו לא טבעיות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- כימיה אורגנית
- סינתזת פפטידים
- כימיה של חומצות אמינו לא טבעיות
רקע
- חומצות אמינו לא טבעיות משמשות יותר ויותר ברצפי פפטידים סינתטיים לצורכי מחקר ויישומים טיפוליים.
- שיטות הידרוליזה מסורתיות לבידוד חומצות אמינו אלו מקומפלקסים של בסיס שיף עם ניקל דורשות לעיתים קרובות תנאים חומציים חזקים.
- הידרוליזה חומצית עלולה להסיר קבוצות מגן רגישות לחומצה מהשרשראות הצדדיות, מה שמגביל את התועלת של חומצות האמינו המתקבלות בסינתזת פפטידים.
- קיים צורך בפרוטוקולי הידרוליזה עדינים יותר המשמרים קבוצות מגן אלו.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה נוחה ויעילה לבידוד חומצות אמינו לא טבעיות מקומפלקסים של בסיס שיף עם ניקל.
- הבטחת שימור של קבוצות מגן של שרשראות צד רגישות לחומצה במהלך ההידרוליזה.
- הדגמת הגנה עוקבת ב-Fmoc של חומצות האמינו המבודדות תחת תנאים מתונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- המסה של קומפלקס בסיס שיף של ניקל ב-DMF, ממס המתאים הן לשלבים אורגניים והן לשלבים מימיים.
- הידרוליזה באמצעות EDTA מימי ב-pH 4.5–7.5 עם ערבוב למשך לילה כדי לשחרר את חומצת האמינו מהקומפלקס.
- מיצוי וכיוון ה-pH לניטרלי (pH 7) באמצעות נתרן ביקרבונט.
- הגנה באמצעות Fmoc על ידי הוספת Fmoc-hydroxysuccinimide ester ב-dioxane, ולאחריה ערבוב למשך לילה.
- החמצה ל-pH 2 ומיצוי באמצעות ethyl acetate כדי לבודד את חומצת האמינו המוגנת ב-Fmoc.
- ייבוש וריכוז של התמציות האורגניות לקבלת המוצר הסופי.
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת הידרוליזה מלאה של קומפלקס הניקל כאשר נעשה שימוש בלפחות שמונה שו Equivalents של EDTA.
- ההידרוליזה יעילה בטווח pH של 4.5 עד 7.5, מה שמעניק גמישות ותנאים מתונים.
- קבוצות המגן של שרשראות הצד נשמרות במלואן, כפי שאושר בניתוח proton NMR.
- הפרוטוקול ניתן להתאמה למגוון סובסטראטים של חומצות אמינו בעלות קבוצות מגן שונות.
- ניתן להשלים את התהליך כולו בתוך כ-48 שעות לאחר רכישת המיומנות.
מסקנות
- טכניקה זו מאפשרת בידוד והגנה של חומצות אמינו לא טבעיות באמצעות Fmoc, עם קבוצות מגן של שרשראות צד רגישות לחומצה, תחת תנאים מתונים.
- השיטה יעילה, גמישה וניתנת ליישום נרחב על סובסטראטים שונים של חומצות אמינו.
- היא מקלה על סינתזה של חומצות אמינו לא טבעיות המתאימות לסינתזת פפטידים במוצק ומקדמת את המחקר בכימיה אורגנית ובכימיה של פפטידים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שימור של קבוצות מגן רגישות לחומצה במהלך בידוד חומצות אמינו הוא קריטי לאפשר תהליכי עבודה סינתטיים של פפטידים בהמשך במו"פ פרמצבטי. פרוטוקול הידרוליזה זה מאפשר את הכנתן של חומצות אמינו לא טבעיות התואמות סינתזה של פפטידים במוצק (solid-phase peptide synthesis), ובכך תומך בגיוון מהיר של מולקולות מובילות (lead diversification) ובבחינת קשרי מבנה-פעילות. השיטה פותרת צוואר בקבוק מרכזי בסינתזה של אבני בניין פפטידיות מורכבות עבור תוכניות בשלבי גילוי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר סינתזה של חומצות אמינו לא טבעיות במבנים מגוונים לצורך בדיקת מטרות ביולוגיות.
- תומך בהורדת סיכונים מכניסטיים על ידי מתן אפשרות לשילוב של פונקציונליות רגישה בשרשרת הצד.
- מקל על יצירה מהירה של וריאנטים של פפטידים למחקרי מעורבות מטרה (target engagement).
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- מספק חומצות אמינו מוגנות עם קבוצות מגן רגישות לחומצה המתאימות לפלטפורמות אוטומטיות של סינתזת פפטידים במוצק (solid-phase peptide synthesis).
- מבטיח שחזור וסטנדרטיזציה של ספריות פפטידים על ידי שימור קבוצות המגן.
- מאפשר הכנה ניתנת להרחבה (scalable) של אבני בניין עבור מסעות סריקה בספיקת תפוקה גבוהה (high-throughput screening).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מאפשר סינתזה של פפטידים עם מודיפיקציות רלוונטיות למחלה לצורך הערכה של מודלים פרה-קליניים.
- תומך ברציפות משלב הגילוי המוקדם ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי שמירה על השלמות הכימית של המועמדים הפפטידיים.
- מפחית את הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים עקב אובדן פונקציונליות קריטית של שרשראות צד.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
פרוטוקול הידרוליזה וההגנה זה משתלב בממשק שבין סינתזה כימית להפקת פפטידים מובילים, ומגשרי בין שלבי הגילוי המוקדמים למחקר פרה-קליני.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת השערות באמצעות אנלוגים מותאמים אישית של חומצות אמינו וגששים של מסלולים ביולוגיים.
- סריקה: מספקת חומצות אמינו מוגנות המוכנות לשילוב בספריות סריקה.
- אנליזה: מספקת שימור כמותי של קבוצות מגינות, המאושר באמצעות NMR, לצורך השוואה אמינה בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: שומרת על שלמות שרשראות הצד עבור מחקרים ביולוגיים ופרמקולוגיים בהמשך התהליך.
- שימוש חוזר ארגוני: פרוטוקול גמיש התומך במגוון של סובסטראטים של חומצות אמינו, ובכך משפר את תועלת הפלטפורמה במגוון תוכניות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי במחקרי מבנה-תפקוד של פפטידים ובתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של הכנת חומצות אמינו, המשפרת את השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability).
- ערך אסטרטגי: מאיץ החלטות go/no-go על ידי מתן אפשרות לסינתזה מהירה של מועמדים פפטידיים מגוונים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכון על ידי צמצום צווארי בקבוק סינתטיים באופטימיזציה של מובילים (lead optimization).
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בסינתזה אורגנית ובמסלולי עבודה של כימיית פפטידים.
- דורש גישה למכשור תואם DMF ולכלים אנליטיים כגון NMR.
- מחייב בקרה קפדנית על ה-pH וסטנדרטיזציה בין צוותים להשגת תוצאות הניתנות לשחזור.
- ניתן להתאמה לסובסטרטים שונים של חומצות אמינו עם קבוצות מגן שונות.
- מוגבל על ידי אילוצי מסיסות והצורך בטיפול זהיר בממיסים מסוכנים.
