Name: ניתוח של C-KIT ליגנד האמרגן באמצעות Immunoprecipitation הכרומטין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: למדו את שיטת ChIP לזיהוי קשרי חלבון-DNA בתאי סרטן כבד אנושיים. הפרוטוקול מדגים קשירת SMAD2 ו-STAT3 לרצפי DNA בקדמים של גנים בתגובה ל-TGF-β1.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת טקסס MD אנדרסון סרטן המרכז, יוסטון, TX (startup קרנות, BB).

1. הכנת פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות הבאים טריים עבור כל ניסוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת פתרון קיבעון , להכין פורמלדהיד 37% ולאחסן אותו RT. לדלל אותו 1x פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) לריכוז סופי של 1.42%. זהירות: פורמלדהיד מסווג כגורם מגרה, קורוזיבי, מוטגני, טרטוגני ומסרטן. לא לבלוע. אין לנשום גז / אדי / אדים / ספריי. במקרה של אוורור לא מספיק, ללבוש ציוד נשימה מתאים. הימנע ממגע עם העור והעיניים. יש להרחיק מפני חומרים בלתי תואמים, כגון חומרים מחמצנים, צמצום סוכנים, חומצות, אלקליות ולחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור פתרון גליצין לתקן לתקן, להכין 0.125 M גליצין בפתרון 1x PBS ולאחסן אותו RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הפתרון שריטות התא, להכין פתרון PBS 1x ב dH 2 O ולאחסן אותו על הקרח. ממש לפני השימוש, להוסיף מעכב proteinase phenylmethylsulfonyl פלואוריד (PMSF) tOa הריכוז הסופי של 0.5 מ&quot;מ. זהירות: PMSF מסווגת כקורוזיבית ורעילה; ללבוש בגדים מגן ולהשתמש בו באזור מאוורר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ישירות לפני השימוש במאגר תמוגה התא (20 מ&quot;מ טריס HCl, pH 8.0, 85 מ&quot;מ KCl, ו 0.5% NP40), להוסיף 1X Protease קוקטייל inhibitor (PIC, פתרון מניות 100X ב dimethyl sulfoxide (DMSO): 104 מ&quot;מ 4- ( 2-aminoethyl) benzenesulfonyl פלואוריד הידרוכלוריד (AEBSF), 80 מיקרומטר aprotinin, 4 מ&quot;מ מ&quot;מטין, 1.4 מ&quot;מ E-64, 2 מ&quot;מ leupeptin, ו 1.5 מ&quot;מ pepstatin A) ו 0.5 מ&quot;מ PMSF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ישירות לפני השימוש במאגר תמוגה גרעיני (50 מ&quot;מ טריס- Cl, pH 8.0, 10 מ&quot;מ ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA), ו 1% SDS), להוסיף 1X PIC ו 0.5 מ&quot;מ PMSF. </li></ol></li></ol> 2. תא קיבוע וגז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל את התאים מפגש 70-80% על 10 ס&quot;מ צלחות תרבות רקמה. לעורר את התאים לכל מטרות הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיום תרבות רקמה, להוסיף 5 מ&quot;ל של פתרון קיבוע, ו דגירההתאים למשך 10 דקות ב RT על פלטפורמה רועדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון קיבוע לשטוף את התאים פעמיים עם 10 מ&quot;ל של 1X קר כקרח PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את 1x PBS, להוסיף 5 מ&quot;ל של פתרון גליצין לתקן לתקן, דגירה התאים במשך 5 דקות ב RT על פלטפורמת רועד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון גליצין לתקן לתקן ולשטוף את התאים פעמיים עם 10 מ&quot;ל של 1X קר כקרח PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את 1x PBS, להוסיף 2 מ&quot;ל של פתרון שריטות התא, ומסיק את התאים באמצעות מגרד תא. מעבירים את התאים שנקטפו צינור חרוטי על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות למשך 10 דקות ב 600 xg ו 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant, resuspend גלולה ב 1 מ&quot;ל של חיץ תמוגה תא 1X, ו דגירה על קרח במשך 30 דקות. לחלופין, הצמד להקפיא את גלולה בחנקן נוזלי ולאחסן אותו ב -80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר גלולה resuspended במאגר תמוגה התא, להעביר את ההשעיה התא כדי homogenizer dounce קר dounce ו dounce עבור 10 משיכות באמצעות ב &#39;סוג ב&#39;E לשיבוש תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה תא לצינור microcentrifuge ו צנטריפוגה דגימות במשך 10 דקות ב 2,400 xg ו 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק supernatant, resuspend גלולה μL 350 של חיץ עיכול גרעינים, דגירה דגימות 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף micrococcal nuclease (1 U / μL) ומערבבים על ידי vortexing. דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5-20 דקות; מערבבים את הדגימות כל 2 דקות על ידי היפוך. הערה: זמן ריכוז האנזים נבדלים בין שורות תאים עשויים לדרוש אופטימיזציה במקרים של גז אנזימטית תת אופטימלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, להשיג גז הכרומטין ידי sonication באמצעות sonicators זמין מסחרית. הערה: תנאי סוניקציה ידרשו אופטימיזציה. דוגמה פרוטוקול אופטימיזציה מסופק להלן באמצעות נפח מדגם של 300 μL כוח עיבוד מדגם של 25%. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שלב 2.10, להשליך supernatant ו resuspend nגלולה uclear ב 1.0 מ&quot;ל של חיץ גז מסחרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 300 μL של גלולה גרעינית resuspended לשלושה צינורות microcentrifuge 1.7 מ&quot;ל. מניחים אותם על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזירה 3 aliquots של הכרומטין קבוע על 25% כוח באמצעות 3 תנאים שונים כדי לקבוע את תנאי sonication אופטימלי: 5 פעימות של 20 שניות כל אחד, עם 30 שניות מנוחה על הקרח בין כל הדופק. 10 פעימות של 20 שניות כל אחד, עם 30 שניות מנוחה על הקרח בין כל הדופק. 20 פעימות של 20 שניות כל אחד, עם 30 שניות מנוחה על הקרח בין כל הדופק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך עם שלב 2.15, כמפורט להלן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הדגירה עם nuclease microococcal, להוסיף 7 μL של קר כקרח 0.5 M EDTA להפסיק את התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות עם ה- DNA המלוטש במשך 10 דקות ב XG 16,200 ו 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ה- DNA מכוסה המכיל supernatant לצינור microcentrifuge טרי. Aliquot 50 μL לתוך צינור microcentrifuge נפרד כדי לאשר את suגזיזת הדנ&quot;א (סעיף 3). השתמש נפח הנותרים מיד immunoprecipitation (סעיף 4) או לאחסן אותו ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol> 3. אישור יעילות הגז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 150 μL של nuclease ללא D 2 O ו 10 μL של 5 Na NaCl אל 50 μL aliquot של הכרומטין מלוטש משלב 2.16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות על 65 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות כדי להפוך את crosslinks. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μL של RNase (10 מיקרוגרם / μL) ו דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μL של proteinase K (0.5 מיקרוגרם / μL) ו דגירה דגימות ב 42 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטיהור של ה- DNA, לבצע פנול / כלורופורם מיצוי 12 . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מים nuclease ללא לנפח סופי של 200 μL. הוסף 200 μL של פנול: כלורופורם: אלכוהול isoamyl (25: 24: 1) למדגם ו מערבולת במשך 20 s. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה בחדר החדרPerature עבור 5 דקות ב 16,000 x גרם. בזהירות להסיר את השלב מימית העליון ולהעביר אותו צינור טרי. הקפד לא לשאת על כל פנול במהלך pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.1 כרכים של 3 M סודיום אצטט (NH 4 OAc), pH 5.2, ומערבבים על ידי לחיצה על הצינור מספר פעמים עם אצבע. הוסף 2.5 כרכים של אתנול קר כקרח 100% ומערבבים על ידי vortexing עבור 5 s. דגירה המדגם O / N ב -20 מעלות צלזיוס, או לפחות 1 שעות ב -80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה המדגם במשך 30 דקות ב 4 ° C ו 16,000 XG כדי גלולה cDNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בזהירות את supernatant מבלי לשבש את גלולה. הוסף 1 מ&quot;ל של RT, אתנול 70% ו להפוך את הצינור מספר פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה המדגם במשך 2 דקות ב 4 ° C ו 16,000 x גרם. הסר בזהירות את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש את גלולה עבור 5-10 דקות ב RT. Resuspend גלולה ב 30 μL של DH 2 O. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש aliquot 5 ו 10 μL של ה- DNA מטוהרים עבור ג&#39;ל אלקטרופורזה עם TAE 1%Agarose ג&#39;ל. הערה: מוצלח תוצאות הכרומטין גז בתבנית DNA 200-1,500 BP. אם הגז אינו מצליח, לקבוע את התנאים הגז אופטימלי עבור תאים ספציפיים על ידי שינוי זמן הדגירה של צעד הגז (צעד 2.12) ל 5, 10, ו 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במדגם הנותר כדי לנתח את ריכוז ה- DNA של המדגם. הפוך - לחשב את ריכוז ה- DNA במדגם הכרומטין שרוף (שלב 2.16); להשתמש בכמויות DNA זהה עבור כל קבוצת טיפול עבור immunoprecipitation (סעיף 4). </li></ol> 4. Immunoprecipitation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב 10-25 מיקרוגרם של הכרומטין crosslinked גזוז (צעד 2.16) עם 25 μL של חלבון שבב כיתה G חרוזים מגנטיים, 10 μL של חיץ דילול immunoprecipitation (פתרון המניה: 0.01% SDS, 1.1% Triton X-100, 16.7 מ&quot;מ Tris-HCl, pH 8.0, 1.2 מ&quot;מ EDTA, ו 167 mM NaCl), ו 1 μL של PIC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 4 שעות הדגירה, מוסיפים 1-10 מיקרוגרם של נוגדנים (ריכוז נוגדןאטיון ישתנה בהתאם לזיקה של הנוגדן; זה צריך בתחילה לשמש כל המלצות היצרן אופטימיזציה אופטימיזציה אם יש צורך) כדי צינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל ולהוסיף dH 2 O לנפח סופי של 100 μL. הערה: במקום השיטה המתוארת לעיל immunoprecipitation, שיטת immunoprecipiation עקיף ניתן להשתמש על ידי שילוב הראשון של הכרומטין עם הנוגדנים ולאחר מכן הוספת חלבון G חרוזים מגנטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות על רוטורטור מקצה לקצה עבור 4-12 שעות ב 4 ° C. </li></ol> 5. אלוטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינורות על מעמד מגנטי. לאחר חרוזים מגנטיים צובר בצד של הצינור, להסיר בזהירות להשליך supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את החרוזים שלוש פעמים עם 800 μL של חיץ לשטוף 1 (0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 מ&quot;מ EDTA pH 8, 20 מ&quot;מ טריס HCl, pH 8, ו 150 מ&quot;מ NaCl); לערבב על ידי הפיכת הצינור מספר פעמים. מניחים את הצינור על המעמד המגנטי אNd להסיר בזהירות להשליך את חיץ לשטוף פעם אחת חרוזים מגנטיים בצד של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את החרוזים פעם אחת עם 800 μL של חיץ לשטוף 2 (0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 מ&quot;מ EDTA, pH 8, 20 מ&quot;מ טריס HCl pH 8, ו 500 מ&quot;מ NaCl); לערבב על ידי הפיכת הצינור מספר פעמים. מניחים את הצינור על המעמד המגנטי להסיר בזהירות להשליך את חיץ לשטוף פעם אחת חרוזים מגנטיים בצד בצד של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את החרוזים μL 50 של חיץ elution (1% SDS ו 100 מ&quot;מ NaHCO 3 ) ו דגירה הדגימות על רוטורטור מקצה לקצה במשך 15 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינורות על מעמד מגנטי, ופעם חרוזים מגנטיים לאסוף בצד הצינור, להעביר את supernatant לצינור טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 6 μL של 5 Na NaCl, כדי להפוך את crosslinking, ו 2 μL של proteinase K (0.5 מיקרוגרם / μL). לאחר ערבוב דגימות, דגירה דגימות עבור 2 שעות ב 65 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטיהור ה- DNA, לבצע pheNol / כלורופורם מיצוי 12 (שלב 3.5) ולאחר מכן resuspend גלולה ב 30 μL של DH 2 O. הערה: דגימות ניתן לנתח ישירות עבור אתרי מחייב חלבון (סעיף 5) או ניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. </li></ol> 6. אתר מחייב ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע ניתוח עבור אתרים מחייב ספציפי בתוך רצף חומצה גרעין ידוע באמצעות PCR או qRT-PCR. עבור עיצוב פריימר, בצע PCR קונבנציונאלי או qRT-PCR פרוטוקולים. עיצוב primers לסנתז amplicon 150-400 bp כי גשרים האתר מחייב חלבון עניין ( איור 1 ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את ה- PCR באמצעות ארבע תבניות DNA שונות כדי להבטיח ספציפיות: i) DNA מתוך שבב immunoprecipitated עם הנוגדן של עניין, ii) DNA מ CHIP immunoprecipitated עם נוגדן IgG ספציפי, iii) קלט DNA, ו IV) H 2 O שליטה שלילית עבור PCR לשלול זיהום. במקרה של גירוי מסלול, בחר תבנית החמישית באמצעות קבוצה שונה של primers ספציפיים לאתר מחייב ידוע של החלבון immunoprecipitated. הערה: במקרה של C-KIT ליגנד האמרגן ניתוח, להשתמש PCR קונבנציונלי להפגין TGF-β-Induced SMAD מחייב ב SBE בתוך C-KIT ליגנד באזור האמרגן. כבקרה חיובית, לבצע PCR על plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) כיעד ידוע של TGF-β-Induced SMAD מחייב. </li></ol>

<ol><li>Brenowitz, M., Senear, D. F., Shea, M. A., Ackers, G. K. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0076687986300119">Quantitative DNase footprint titration: a method for studying protein-DNA interactions.</a> Methods Enzymol. 130, 132-181 (1986).</li>
<li>Garner, M. M., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gel+electrophoresis+method+for+quantifying+the+binding+of+proteins+to+specific+DNA+regions%3A+application+to+components+of+the+Escherichia+coli+lactose+operon+regulatory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system.</a> Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).</li>
<li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+protein-DNA+interactions+in+vivo%3A+distribution+of+RNA+polymerase+on+specific+bacterial+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 81 (14), 4275-4279 (1984).</li>
<li>Gilmour, D. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC366919/">Lis J.T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster.</a> Mol Cell Biol. 5 (8), 2009-2018 (1985).</li>
<li>Mundade, R., Ozer, H. G., Wei, H., Prabhu, L., Lu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+ChIP-seq+in+the+discovery+of+transcription+factor+binding+sites%2C+differential+gene+regulation+mechanism%2C+epigenetic+marks+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond.</a> Cell Cycle. 13 (18), 2847-2852 (2014).</li>
<li>Mukhopadhyay, A., Deplancke, B., Walhout, A. J., Tissenbaum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29+coupled+to+detection+by+quantitative+real-time+PCR+to+study+transcription+factor+binding+to+DNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation (ChIP) coupled to detection by quantitative real-time PCR to study transcription factor binding to DNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Protoc. 3 (4), 698-709 (2008).</li>
<li>Weinmann, A. S., Bartley, S. M., Zhang, T., Zhang, M. Q., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+chromatin+immunoprecipitation+to+clone+novel+E2F+target+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of chromatin immunoprecipitation to clone novel E2F target promoters.</a> Mol Cell Biol. 21 (20), 6820-6832 (2001).</li>
<li>Weinmann, A. S., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+unknown+target+genes+of+human+transcription+factors+using+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Identification of unknown target genes of human transcription factors using chromatin immunoprecipitation.</a> Methods. 26 (1), 37-47 (2002).</li>
<li>Weinmann, A. S., Yan, P. S., Oberley, M. J., Huang, T. H., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+human+transcription+factor+targets+by+coupling+chromatin+immunoprecipitation+and+CpG+island+microarray+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22GenesDev%22%5BJournal%5D)">Isolating human transcription factor targets by coupling chromatin immunoprecipitation and CpG island microarray analysis.</a> GenesDev. 16 (2), 235-244 (2002).</li>
<li>Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smad+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Smad transcription factors.</a> Genes Dev. 19 (23), 2783-2810 (2005).</li>
<li>Rojas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Positive+TGF-beta%2Fc-KIT+Feedback+Loop+Drives+Tumor+Progression+in+Advanced+Primary+Liver+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">A Positive TGF-beta/c-KIT Feedback Loop Drives Tumor Progression in Advanced Primary Liver Cancer.</a> Neoplasia. 18 (6), 371-386 (2016).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+nucleic+acids+by+extraction+with+phenol%3Achloroform%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Purification of nucleic acids by extraction with phenol:chloroform.</a> CSH Protoc. 2006 (1), (2006).</li>
<li>Dennler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+binding+of+Smad3+and+Smad4+to+critical+TGF+beta-inducible+elements+in+the+promoter+of+human+plasminogen+activator+inhibitor-type+1+gene%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene.</a> EMBO J. 17 (11), 3091-3100 (1998).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+Smad+MH1+domain+bound+to+DNA%3A+insights+on+DNA+binding+in+TGF-beta+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a Smad MH1 domain bound to DNA: insights on DNA binding in TGF-beta signaling.</a> Cell. 94 (5), 585-594 (1998).</li>
<li>Seidel, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spacing+of+palindromic+half+sites+as+a+determinant+of+selective+STAT+%28signal+transducers+and+activators+of+transcription%29+DNA+binding+and+transcriptional+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Spacing of palindromic half sites as a determinant of selective STAT (signal transducers and activators of transcription) DNA binding and transcriptional activity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 92 (7), 3041-3045 (1995).</li>
<li>Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+the+fast+chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method.</a> Nat Protoc. 1 (1), 179-185 (2006).</li>
<li>Tian, B., Yang, J., Brasier, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+cross-linking+for+analysis+of+protein-chromatin+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-step cross-linking for analysis of protein-chromatin interactions.</a> Methods Mol Biol. 809, 105-120 (2012).</li>
<li>O'Neill, L. P., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1046202303000902">Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP.</a> Methods. 31 (1), 76-82 (2003).</li>
<li>Horz, W., Altenburger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+specific+cleavage+of+DNA+by+micrococcal+nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Sequence specific cleavage of DNA by micrococcal nuclease.</a> Nucleic Acids Res. 9 (12), 2643-2658 (1981).</li>
<li>Chung, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+micrococcal+nuclease+digestion+on+nucleosome+positioning+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The effect of micrococcal nuclease digestion on nucleosome positioning data.</a> PLoS One. 5 (12), 15754(2010).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

בדוח זה, אנו מדגימים את TGF-β1 המושרה מחייב של SMAD2 ל SBE בתוך C-KIT ליגנד האמרגן ואת TGF-β1 המושרה מחייב STAT3 לרצף ההכרה שלה בתוך הגן TGF-β1 ליגנד. אנו מראים ציטוקינים- Induced מחייב של שני גורמים שעתוק באמצעות immunoprecipitation הכרומטין. הכרומטין immunoprecipitation הוא כלי רב עוצמה כדי להדגים את הכריכה הישירה של חלבון של עניין ל- DNA, לאפיין את הגירויים המפעילים חלבון מחייב ל- DNA, ולאפיין את רצף ה- DNA שב...

בגרעין של eukaryotes, DNA אינטראקציה עם חלבונים היסטון חלבונים nonhistone והוא מרוכז לתוך הכרומטין. בהקשר הביולוגי הפיזיולוגי, הפאתופיסיולוגי והתא, תפקודים תאיים נשלטים באופן מרחבי ומבוקר באופן זמני על ידי ביטוי גנים מתואם הכרומטין. אינטראקציות DNA- חלבון יש תפקיד חיוני ויסות של תהליכים תאיים, כגון שכפול דנ&quot;א, רקומבינציה, ותיקון, כמו גם ביטוי חלבון. לכן, ניתוח של אינטראקציות DNA חלבונים הוא כלי הכרחי בהערכת ביטוי גנים ותפקוד התא. קיימות מספר טכניקות כדי להעריך אינטראקציות DNA חלבונים במבחנה , כגון אלקטרופורזה (ג&#39;ל) ניידות משמרת Assay (EMSA) ו DNase אני footprinting 1 , 2 . עם זאת, טכניקות אלה לא לנתח את האינטראקציה DNA- חלבון בתוך הכרומטין הקשר הסלולר. שבב iטכניקה אשר לוכדת חלבונים קשורה לאתרים ספציפיים שלהם DNA מחייב ובכך מאפשר זיהוי של אינטראקציות DNA חלבונים בהקשר הכרומטין. הטכניקה פותחה במקור על ידי גימור וליס להערכת RNA פולימראז II מחייב גנים ספציפיים Escherichia coli ו תסיסנית melanogaster 3 , 4 . זה נעשה על ידי קיבוע של קומפלקסים DNA- חלבון, ואחריו ביצוע מיצוי הכרומטין וגזיזת DNA לתוך ~ 200 זוג בסיס (bp) שברי. לאחר מכן, חלבון ה- DNA קשור של עניין הוא מבודד על ידי immunoprecipitation. לאחר היפוך של ה- DNA חלבון crosslink, ה- DNA הוא מטוהרים ונותחו. מספר שיטות ניתן להשתמש לניתוח של אתרי מחייב חלבון תלויים ברצף חומצה גרעין של האתר מחייב חלבון בתוך הגן היעד 5 . במקרים שבהם רצף הדנ&quot;א ידוע, תקן PolYmerase תגובות שרשרת (PCR) ניתן ליישם, באמצעות זוגות פריימר ספציפיים צמודים לאתר מחייב ידוע. כמותי Real-Time PCR (qRT-PCR) יכול לשמש גם 6 . במקרים בהם הרצף אינו ידוע, ניתן לשלב את ה- CHIP עם מיקרוא-דנ&quot;א (שבב על שבב), רצף דנ&quot;א (שבב- seq), או טכניקות שיבוט 7 , 8 , 9 . מסלול TGF-β יש עוצמה דיכוי פונקציות מדכא והוא מסלול מפתח בידול תאים. זה מופעל באמצעות מחייב של ליגנד TGF-β1 לקולטן קולטן קוגנטי שלה, וכתוצאה מכך serine-fosphorylation של גורמי שעתוק SMAD2 / 3. בעקבות הקשר שלהם עם המתווך המשותף, SMAD4, מתרגם ה- SMAD אל הגרעין ונקשר ל- SBE בתוך אזור היזם של גני המטרה, שם הוא מווסת את הגנים השולטים במחזור התא, אפופטוזיס, ותא שונהעַל. תגובת ההעתקה לגירוי TGF-β היא סוג התא והקשר הספציפי 10 . לאחרונה, תיארנו לולאה משוב חיובי בין TGF-β לבין מסלול C-KIT 11 . במודל זה, TGF-β1 מופעל SMAD2 נקשר C-KIT ליגנד האמרגן ומעורר הביטוי שלה הפרשת. לאחר מכן, C-KIT ליגנד מפעיל את קולטן C-KIT באופן אוטומטי ו- para-crinic אופנה. C-KIT הפעלת קולטן תוצאות STAT3 Tyr 705- זרחון דרך JAK1 / 2. בעקבות STAT3- הפעלה טרנסלוקציה גרעינית, STAT3 נקשר לגן ליגנד TGF-β1 ו מסדיר את הביטוי שלה. כאן, אנו מדגימים את התפקיד המהותי של ניתוח שבב עבור זיהוי של SMAD2 מחייב את C-KIT קולטן ליגנד האמרגן ו עבור זיהוי של אותות מתמר (ו) Activator (של) שעתוק 3 (STAT3 מחייב את TGF-β1- גֵן).

<table><tbody><tr><td>תאי HepG2</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>תאי Hep3B</td><td>ATCC</td><td>HB-8064</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&beta; 1</td><td>מו"פ D Systems</td><td>101-B1</td><td>בשימוש בריכוז של 10 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>נוגדנים Anti-SMAD2</td><td>טכנולוגיית איתות תאים</td><td>5339</td><td>כמות בשימוש/IP: 3 ומיקרו; g</td></tr><tr><td>אנטי-STAT3</td><td>נוגדן טכנולוגיית איתות תאים</td><td>4904</td><td>כמות בשימוש/IP: 3 ומיקרו; g</td></tr><tr><td>ChIP-IT חלבון G חרוזים מגנטיים</td><td>מוטיב פעיל</td><td>53033</td><td></td></tr><tr><td>מעכב פרוטאז קוקטייל</td><td>מוטיב פעיל</td><td>37490</td><td></td></tr><tr><td>Micrococcal Nuclease</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>10011</td><td></td></tr><tr><td>PCR קדימה פריימר: PAI-1</td><td></td><td></td><td>רצף: 5'-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3'</td></tr><tr><td>פריימר הפוך PCR: PAI-1</td><td></td><td></td><td>רצף: 5'-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3'</td></tr><tr><td>פריימר קדימה PCR: רצף SCF</td><td></td><td></td><td>: 5'-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3' &nbsp;</td></tr><tr><td>פריימר הפוך PCR: רצף SCF</td><td></td><td></td><td>: 5'-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3'</td></tr><tr><td>פריימר קדימה PCR: TGF-ובטא; 1 (STB-1)</td><td></td><td></td> <td>רצף: 5'-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3' &nbsp;</td></tr><tr><td>פריימר הפוך PCR: TGF-ובטא; 1 (STB-1)</td><td></td><td></td><td>רצף: 5'-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3' &nbsp;</td></tr><tr><td>פריימר קדימה PCR: TGF-ובטא; 1 (STB-2)</td><td></td><td></td> <td>רצף: 5'-GTACTGGGGGGAGCGGCATC-3' &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>פריימר הפוך PCR: TGF-ובטא; 1 (STB-2)</td><td></td><td></td> <td>רצף: 5'-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3' &nbsp; &nbsp;</td></tr></tbody></table>

ניתוח של c-kit ליגנד האמרגן באמצעות immunoprecipitation הכרומטין

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

תהליכים תאיים מרובים, כולל שכפול דנ&quot;א ותיקונם, recombination DNA, ביטוי גנים, דורשים אינטראקציות בין חלבונים ו- DNA. לכן, אינטראקציות דנ&quot;א חלבונים מסדירים פונקציות פיזיולוגיות, פתופיזיולוגיות וביולוגיות מרובות, כגון התמיינות תאים, התפשטות תאים, בקרת מחזור התא, יציבות כרומוזום, רגולציה של גנים אפיגנטיים ושינוי בתאים. בתאים אאוקריוטיים, ה- DNA מקיים אינטראקציה עם חלבונים היסטוניים ולא היסטוניים ומתעבה לכרומטין. כמה כלים טכניים ניתן להשתמש כדי לנתח אינטראקציות DNA חלבונים, כגון אלקטרופורזה (ג&#39;ל) ניידות Shift Assay (EMSA) ו DNase אני footprinting. עם זאת, טכניקות אלה לנתח את האינטראקציה DNA- חלבון במבחנה , לא בהקשר הסלולר. Chromatin immunoprecipitation (שבב) היא טכניקה לוכדת חלבונים באתרים ספציפיים שלהם DNA מחייב, ובכך מאפשר זיהוי של אינטראקציה DNA חלבוןS בהקשר הכרומטין שלהם. זה נעשה על ידי קיבוע של אינטראקציה DNA- חלבון, ואחריו immunoprecipitation של חלבון של עניין. לאחר מכן, האתר הגנומי שהחלבונים מאופיינים בו מאופיין. כאן, אנו מתארים ולדון צ&#39;יפ ולהפגין את הערך האנליטי שלה לזיהוי של שינוי גורם הצמיחה- β (TGF-β), מחייב המושרה של גורם שעתוק SMAD2 ל SMAD מחייב אלמנטים (SBE) בתוך אזור האמרגן של טירוזין, קינאז חלבון קיט (c-KIT) קולטן ליגנד תא גזע גורם (SCF).

הכריכה של ליגנד TGF-β1 לתרכובת הקולטן המובהקת שלו גורמת לזריחת הזרחן של גורמי שעתוק SMAD2 / 3, ולאחר מכן הקשר שלהם למתווך הפשוט, SMAD4. המתקן SMAD translocates לגרעין. TGF-β יכול להסדיר שעתוק גנים, בין אם ישירות דרך SMAD מחייב SBEs בתוך אזורים רגולטוריים של גנים היעד, או בעקיפין דרך ביטוי SMAD- מוסדר של activators תעתיק או מדחסים כי לאחר מכן לווסת את הביטוי של הגן של עניין 10 . כדי לבדוק אם C-KIT ליגנד SCF הוא מוסדר transcri...

אינטראקציות DNA חלבון חיוניים עבור תהליכים ביולוגיים מרובים. במהלך הערכה של פונקציות הסלולר, ניתוח של אינטראקציות DNA חלבונים הוא הכרחי להבנת הרגולציה הגנטית. Chromatin immunoprecipitation (שבב) הוא כלי רב עוצמה לנתח אינטראקציות כאלה in vivo.

ניתוח של C-KIT ליגנד האמרגן באמצעות Immunoprecipitation הכרומטין

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

המטרה הכללית של פרוצדורת השקיעה החסונית של כרומטין (chromatin immunoprecipitation) זו היא להעריך את הקישור של גורם השחלוף SMAD2 לאלמנטים המקשרים ל-SMAD בקידום (promoter) של C kit, כפי שמושרה על ידי TGF beta 1. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה התאית, כגון שחלוף גנים המושרה על ידי ציטוקינים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא הפוטנציאל להדגים קישור ישיר של גורמי שחלוף וחלבונים רגולטוריים אחרים של השחלוף לאתרי הקישור שלהם ב-DNA in vivo.גדלו את התאים עד להגעה ל-70 עד 80% התמסרות (confluence) בצלחות תרבית רקמה של עשרה סנטימטרים. גרו את התאים בהתאם למטרות הניסוי. הסירו את מצע תרבית הרקמה, והוסיפו חמישה מיליליטר של תמיסת קיבוע.לאחר מכן, דגרו את התאים למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר על פלטפורמת ניעור. הסירו את תמיסת הקיבוע, ושטפו את התאים פעמיים עם 10 milliliters של 1X PBS קר מאוד. הסירו את ה-1X PBS והוסיפו חמישה milliliters של תמיסת glycine stop fix.לאחר דגירה של התאים למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר על פלטפורמה רוגזת, הסר את תמיסת העצירה והקיבוע של הגליצין ושטוף את התאים פעמיים עם 10 milliliters של 1X PBS קר בקרח. לאחר הסרת ה-PBS, הוסף שני milliliters של תמיסה לגרידת תאים ואסוף את התאים באמצעות גורד תאים. לאחר מכן, העבר את התאים שנאספו למבחנה קונית על קרח.סבב את הדגימות בצנטריפוגה

analysis-c-kit-ligand-promoter-using-chromatin

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

כאן אנו מציגים immunoprecipitation הכרומטין (שבב) נוהל לניתוח הגנום כולו מיקום isoforms חלבונים שונים בתחום היסטון מחייב. אנו מיישמים אותו לניתוח שבב Seq לזהות מטרות demethylase היסטון KDM5A/JARID1A/RBP2.

הגנום כולו ניתוח באמצעות שבב זיהוי איזופורם ספציפי מטרות ג&#39;ין

סרטון זה מתאר פרוטוקול לבדיקת משקעים חיסוניים של כרומטין (ChIP), שהיא טכניקה קלאסית להדגמת אינטראקציות חלבון-דנ"א. טכניקה זו משמשת לזיהוי גני מטרה בתאי לוקמיה לימפוציטית כרונית בבני אדם.

בדיקת משקעים חיסוניים של כרומטין: טכניקה לחקר אינטראקציות חלבון-דנ"א בתאים

אנו מתארים שיטה חזקה לimmunoprecipitation הכרומטין באמצעות תאי T ראשוניים. השיטה מבוססת על גישות סטנדרטיות, אך משתמשת בקבוצה מסוימת של תנאים וריאגנטים המשפרים את היעילות למוגבלים בכמויות של תאים. חשוב מכך, תיאור מפורט של שלב ניתוח הנתונים מוצג.

הכרומטין immunoprecipitation יעיל באמצעות כמויות מגבילות של ביומסה

שילוב של immunoprecipitation הכרומטין ורצף אולטרה תפוקה גבוהה (שבב ואילך) יכול לזהות ולמפות DNA חלבונים אינטראקציות בקו רקמה או תא נתון. התווה הוא איך ליצור תבנית באיכות גבוהה עבור סידור שבב שלאחר מכן, תוך שימוש בניסיון עם TCF7L2 גורם השעתוק לדוגמא ירושלים.

דור של תבנית הכרומטין immunoprecipitation איכות גבוהה עבור ה-DNA רצף תפוקה גבוהה (שבב ואילך)

על ידי שילוב של ילידים וcrosslinking immunoprecipitation הכרומטין עם רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה, גישת ChroP מאפשרת לנתח את ארכיטקטורת proteomic המורכבת של שינויי היסטון, וריאנטים וחלבונים שאינם histonic synergizing בתחומי הכרומטין תפקודי מובהקים.

גישת ChroP משלבת שבב וספקטרומטריית המסה לנתח נופי proteomic לוקוס ספציפיים של הכרומטין

עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול לכרומטין immunoprecipitation (שבב) באמצעות קו עכבר T- התא הבוגר. פרוטוקול זה מתאים לחקור את ההפצה של סימני היסטון ספציפיים באתרי מקדם ספציפי או גנום רחב.

הכרומטין Immunoprecipitation (שבב) ב עכבר T-cell שורות

פרוטוקול זה מתאר שימוש קומבינטורית של שבב-seq, 4sU-seq, הכולל RNA-seq ריבוזום פרופיל עבור שורות תאים ותאים הראשי. הוא מאפשר מעקב אחר שינויים בגורם שעתוק כריכה, תמלול דה נובו , עיבוד RNA, מחזור, תרגום לאורך זמן, ומציג את השתלשלות האירועים הכוללת בתאים מופעל ו/או המשתנה במהירות.

ניתוח בזמן אמת של גורם שעתוק כריכה, תמלול, תרגום, מחזור ולהציג אירועים גלובליים במהלך ההפעלה הסלולרית

רכיבים רגולטוריות דנ א, כגון מוצרי טיפוח טבעיים, לשלוט ביטוי גנים פיזית שעת היעד ג'ין היזמים, לרוב באמצעות אינטראקציות כרומוזומלית ארוכי טווח הנמשכים מרחקים גדולים גנומית. יזם ללכוד Hi-C (PCHi-C) מזהה אינטראקציות משמעותיות בין היזמים ואזורים הדיסטלי, המאפשר את ההקצאה של פוטנציאל רגולטוריות רצפי הגנים היעד שלהם.

יזם לכידת שלום-c: ברזולוציה גבוהה, הגנום כולו פרופיל של אינטראקציות יזם

לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL) הוא הלוקמיה הנפוץ ביותר בעולם המערבי. גורמי שעתוק NFAT הן הרגולטורים חשוב של פיתוח והפעלה סוגי תאים רבים. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול לשימוש של כרומטין immunoprecipitation (ChIP) בתאי CLL אדם לזיהוי גנים היעד הרומן של NFAT2.

כרומטין Immunoprecipitation Assay לזיהוי NFAT2 הרומן גנים היעד בלוקמיה לימפוציטית כרונית

פרוטוקול זה מתמקד בהכנת כרומטין מרקמות קפואות והוא מתאים ל- Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) ואחריו ניתוח PCR כמותי (X-ChIP-qPCR) או גישות ריצוף מהדור הבא (X-ChIP-seq).

מיצוי כרומטין מרקמת כבד כימרית קפואה לניתוח משקעים חיסוניים של כרומטין

למדו את שיטת ChIP לזיהוי קשרי חלבון-DNA בתאי סרטן כבד אנושיים. הפרוטוקול מדגים קשירת SMAD2 ו-STAT3 לרצפי DNA בקדמים של גנים בתגובה ל-TGF-β1.

ניתוח של C-KIT ליגנד האמרגן באמצעות Immunoprecipitation הכרומטין

גלה סרטונים נוספים