ניתוח של C-KIT ליגנד האמרגן באמצעות Immunoprecipitation הכרומטין
27 ביוני 2017
אינטראקציות DNA חלבון חיוניים עבור תהליכים ביולוגיים מרובים. במהלך הערכה של פונקציות הסלולר, ניתוח של אינטראקציות DNA חלבונים הוא הכרחי להבנת הרגולציה הגנטית. Chromatin immunoprecipitation (שבב) הוא כלי רב עוצמה לנתח אינטראקציות כאלה in vivo.
המטרה הכוללת של הליך חיסון כרומטין זה היא להעריך את הקישור המושרה על ידי TGF beta 1 של גורם השעתוק SMAD2 לאלמנטים מחייבים SMAD במקדם ערכת C. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה התאית כגון שעתוק גנים המושרה על ידי ציטוקינים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שיש לה פוטנציאל להדגים קשירה ישירה של גורמי שעתוק וחלבונים מווסתים אחרים לשעתוק לאתרי קשירת ה-DNA שלהם in vivo.
גדל את התאים בין 70 ל -80% מפגש על לוחות תרבית רקמה של עשרה סנטימטרים. לעורר את התאים לפי מטרות הניסוי. הסר את מדיום תרבית הרקמות והוסף חמישה מיליליטר תמיסת קיבוע.
לאחר מכן, דגרו על התאים למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר על משטח טלטול. הסר את תמיסת הקיבוע ושטוף את התאים פעמיים עם 10 מיליליטר קר כקרח אחד X PBS. הסר את ה-X PBS האחד והוסף חמישה מיליליטר של תמיסת עצירת גליצין.
לאחר דגירה של התאים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר על משטח טלטול, הסר את תמיסת הגליצין להפסיק לתקן ושטוף את התאים פעמיים עם 10 מיליליטר קר כקרח אחד X PBS. לאחר הסרת ה- PBS, הוסף שני מיליליטר של תמיסת גירוד תאים וקצור את התאים באמצעות מגרד תאים. לאחר מכן, העבירו את התאים שנקטפו לצינור חרוטי על קרח.
צנטריפוגה של הדגימות למשך 10 דקות ב-600 פעמים G, וארבע מעלות צלזיוס. הסר את הסופרנטנט, השהה מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מאגר ליזה של תאי X אחד, ודגר על קרח למשך 30 דקות. לאחר שהגלולה מושעה מחדש במאגר הליזיס של התאים, העבירו את תרחיף התאים להומוגניזטור Dounce קר כקרח, ו-Dounce למשך 10 פעימות באמצעות עלי מסוג B לשיבוש התאים.
לאחר מכן, העבירו את תרחיף התא לצינור מיקרו-צנטריפוגה, וצנטריפוגה את הדגימה למשך 10 דקות ב-2, 400 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-350 מיקרוליטר של מאגר עיכול גרעינים. לאחר הדגירה של הדגימות במשך חמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, הוסיפו נוקלאז מיקרוקוקלי וערבבו במערבולת.
דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש עד 20 דקות, וערבבו את הדגימות כל שתי דקות בהיפוך. הזמן בריכוז מסוים, אם אתה נמצא בין קווי תאים, זה עשוי לדרוש אופטימיזציה במקרה של גזירה אנזימטית לא אופטימלית. הליך גזירה חלופי באמצעות סוניקר זמין מסחרית ניתן למצוא בפרוטוקול הטקסט.
לאחר הדגירה עם המיקרוקוק נוקלאז, הוסיפו שבעה מיקרוליטרים של EDTA קר כקרח 0.5 מולארי כדי לעצור את התגובה. צנטריפוגה את הדגימות עם ה-DNA הגזוז למשך 10 דקות ב-16, 200 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס. העבירו את ה-DNA הגזוז המכיל סופרנטנט לצינור מיקרו-צנטריפוגה טרי.
Aliquot 50 מיקרוליטר לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה נפרד, כדי לאשר את הגזירה המוצלחת של ה-DNA כמתואר בפרוטוקול הטקסט. השתמש בנפח הנותר מיד למשקעים חיסוניים או אחסן אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס. שלב 10 עד 25 מיקרוגרם של הכרומטין המקושר הגזוז עם 25 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים של חלבון G בדרגת כרומטין.
לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטר של מאגר דילול חיסוני, ומיקרוליטר אחד של קוקטייל מעכב פרוטאז. לאחר ארבע שעות של דגירה, הוסף 1 עד 10 מיקרוגרם של נוגדן לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. ולהוסיף מים מזוקקים לנפח סופי של 100 מיקרוליטר.
דגרו את הדגימות על מסובב מקצה לקצה למשך ארבע עד 12 שעות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, הנח את הצינורות על מעמד מגנטי. לאחר שהחרוזים המגנטיים מצטברים לצד הצינור, הסר בזהירות והשליך את הסופרנטנט.
שוטפים את החרוזים שלוש פעמים עם 800 מיקרוליטר של מאגר כביסה אחד. לכל שטיפה מערבבים את החרוזים על ידי היפוך הצינור מספר פעמים. לאחר מכן, הנח את הצינור על המעמד המגנטי והסר בזהירות את מאגר הכביסה ברגע שהחרוזים המגנטיים מצטברים בצד הצינור.
לאחר מכן, שטפו את החרוזים פעם אחת עם 800 מיקרוליטר של מאגר כביסה שניים באותו הליך. לאחר השטיפות, השעו מחדש את החרוזים ב-50 מיקרוליטר של מאגר פליטה ודגרו את הדגימות על מסובב מקצה לקצה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנט לצינור טרי בעזרת המעמד המגנטי.
הוסף שישה מיקרוליטרים של נתרן כלורי מולארי כדי להפוך את הקישור הצולב ואחריו שני מיקרוליטרים של פרוטאינאז K. לאחר ערבוב הדגימות, דגרו אותן במשך שעתיים בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס. בשלב זה, ניתן לנתח את הדגימות ישירות עבור אתרי קשירת חלבון כמתואר בפרוטוקול הטקסט, או שניתן לאחסן אותן במינוס 20 מעלות צלזיוס. כדי לאשר את הקישור המושרה על ידי TGF beta 1 של SMAD2 למקדם SCF, בוצעה בדיקת כרומטין אימונו-משקעים.
הטיפול ב-TGF beta 1 הביא לקשירת SMAD2 למקדם SCF בקווי סרטן הכבד האנושיים, HepG2 ו-Hep3B. בהיעדר גירוי TGF beta 1, לא נצפתה קשירת SMAD. כבקרה חיובית, עבור הפעלת SMAD המושרה על ידי TGF beta 1, בוצעה משקעים חיסוניים של כרומטין עבור PAI-1.
מקדם PAI-1 הוא יעד ידוע של TGF beta ו-SMAD. הספציפיות של המשקעים החיסוניים SMAD2 אושרה באמצעות שימוש בנוגדני IgG לא ספציפיים. לא נצפתה קשירת SMAD2 ל-SBE לאחר משקעים חיסוניים עם IgG.
כדי לאשר את הקישור המושרה על ידי TGF Beta 1 של STAT3 לגן TGF beta ligand, בוצעו בדיקות אימונו-משקעים של כרומטין באמצעות תאי HepG2 ו-Hep3B שטופלו ב-TGF beta 1. הטיפול ב-TGF beta 1 הביא לקשירת STAT3 לאתר הקישור המשוער השני של STAT3 של גן הבטא TGF, אך לא לראשון. בדוגמה זו, הקישור החיובי של STAT3 ל-STB-2 משמש כבקרה חיובית פנימית.
בדומה לניסוי אחר של כרומטין, קשירת STAT3 ל-ST-2 לא נראתה לאחר משקעים חיסוניים באמצעות IgG. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך יום או יומיים בהתאם לנוגדנים אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לעקוב אחר הנחיות הבטיחות במעבדה ולהיות מדויקים ביותר בכל שלב בפרוטוקול.
יש לנקוט באמצעי זהירות כגון בדיקת MSDS ולבישת ציוד מגן כגון כפפות, חלוק לבן ומשקפי בטיחות בעת ביצוע הליך זה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנתח את קשירת החלבון לרצפי קשירת ה-DNA הספציפיים. בעקבות פרוטוקול זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו בדיקות מקדם על מנת לאשר את הרלוונטיות התפקודית של קשירת DNA חלבון המודגמת על ידי משקעים חיסוניים של כרומטין.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מדגים את טכניקת השקיעה החיסונית של כרומטין (ChIP) להערכת קישור של גורמי שעתוק, ובמיוחד SMAD2 ו-STAT3, לאלמנטים הקושרים להם של ה-DNA בתוך מקדמי גנים בקווי תאים של סרטן הכבד האנושי, בתגובה ל-TGF-β1. שיטת ה-ChIP מאפשרת זיהוי של אינטראקציות חלבון-DNA in vivo, ובכך מספקת תובנות לגבי מנגנוני בקרה של גנים בהקשר של כרומטין.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה מולקולרית
- ביולוגיה של התא
- בקרת גנים
רקע
- אינטראקציות חלבון-DNA הן בסיסיות לתהליכים כגון שכפול DNA, תיקון, רקומבינציה וביטוי גנים.
- אינטראקציות אלו מווסתות דיפרנציאציה של תאים, פרוליפרציה, מחזור התא, יציבות כרומוזומלית ובקרה אפיגנטית של גנים.
- בדיקות מסורתיות כגון EMSA ו-DNase I footprinting מנתחות אינטראקציות חלבון-DNA in vitro, ללא ההקשר של הכרומטין.
- שיטת ChIP מאפשרת לחקור אינטראקציות חלבון-DNA בתוך כרומטין בתאים חיים.
מטרת המחקר
- להדגים את פרוטוקול ה-ChIP לזיהוי קישור של SMAD2 לאלמנטים קושרים של SMAD בפרומוטור של c-KIT, המודע על ידי TGF-β1.
- להעריך את הספציפיות והרלוונטיות התפקודית של קישור גורמי שעתוק בקווי תאי סרטן כבד אנושיים (HepG2 ו-Hep3B).
- לספק זרימת עבודה מפורטת וניתנת לשחזור עבור חוקרים הלומדים אינטראקציות בין חלבון ל-DNA in vivo.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- גידול תאים עד להגעה ל-70–80% confluence וגירוי באמצעות TGF-β1.
- קיבוע של קומפלקסי חלבון-DNA באמצעות פורמלדהיד, ולאחריו ביטול הפעילות (quenching) באמצעות גליצין.
- ליזיס של התאים, מיצוי גרעיני וקיטוע כרומטין באמצעות micrococcal nuclease (עם אפשרות לסוניקציה).
- אימונופרסיפיטציה של כרומטין מקושר באמצעות נוגדים ספציפיים וחרוזי מגנט של protein G.
- שטיפה רצפית, אלוציה, היפוך של הקישור (reversal of cross-links) ועיכול באמצעות proteinase K.
- ניתוח של ה-DNA שעבר אימונופרסיפיטציה כדי לאשש את קישור גורמי השחלוף למקשרי הגנה (promoters) של גנים מטרה.
תוצאות עיקריות
- טיפול ב-TGF-β1 השרא קישור של SMAD2 למקדם של SCF בתאי HepG2 ו-Hep3B.
- לא נצפה קישור של SMAD2 ללא גרייה של TGF-β1 או בעת שימוש בנוגדני IgG לא ספציפיים.
- ניסוי ChIP למקדם של PAI-1 שימש כבקרה חיובית להפעלה של SMAD המושרה על ידי TGF-β1.
- קישור של STAT3 לאתר הקישור השני של STAT3 בגן ה-TGF-β נצפה לאחר טיפול ב-TGF-β1, אך לא לאתר הראשון; הספציפיות אושרה באמצעות בקרות IgG.
מסקנות
- ChIP היא שיטה חסונה לגילוי אינטראקציות בין חלבונים ל-DNA ב-in vivo בתוך כרומטין.
- הפרוטוקול מאפשר לחקור טרנסקריפציה של גנים המושרה על ידי ציטוקינים ואת סגוליות הקשירה של גורמי שעתוק.
- שליטה בטכניקה זו מאפשרת ביצוע בדיקות תפקודיות נוספות, כגון מחקרי פעילות פרומוטור, כדי לתקף רלוונטיות ביולוגית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסגרת ניהולית
שיקוע חיסוני של כרומטין (ChIP) מאפשר מיפוי ישיר, in vivo, של קישור גורמי שעתוק למקומי קידום (promoters) של גנים, ובכך מספק תובנה מכניסטית קריטית לאימות מטרות בשלבים מוקדמים של הגילוי. באמצעות לכידת אינטראקציות בין חלבונים לדנ"א המושרות על ידי ציטוקינים בתוך הכרומטין, שיטת ה-ChIP תומכת בביטחון ניבוי בבדיקת מסלולים גנומיים פונקציונליים. יכולת זו חיונית להפחתת סיכונים של מטרות ולסיוע בקבלת החלטות על תעדוף תיקי פיתוח במו"פ ביו-פרמצבטי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר הערכה ישירה של קישור גורמי שעתוק למקדמים (promoters) הרלוונטיים למחלה בתאים חיים.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי אישור של בקרה גנטית מושראת על ידי ציטוקינים ברמת הכרומטין.
- מספק ראיות תפקודיות למעורבות המטרה (target engagement) ולמודולציה של מסלולים.
- מסייע בתעדוף מטרות בהתבסס על אינטראקציות רגולטוריות in vivo.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מקימה מערכות ביולוגיות מתו validates עבור בדיקות תפקודיות וזרימות עבודה של סריקה בשלבים הבאים.
- מספקת תוצאות כמותיות וניתנות לשחזור של אירועי קישור בין חלבון ל-DNA.
- מאפשרת סטנדרטיזציה של הבדיקה ויכולת שחזור בין מעבדות עבור מחקרי גורמי שעתוק.
- מכינה פלטפורמות להערכה אמינה של השפעות תרכובות על בקרה גנטית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאים ממצאים מכניסטיים לוויסות גנים הרלוונטי למחלה במודלים פרה-קליניים.
- תומך ברצף מהשלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני על ידי קישור הפעלת מסלולים לתוצאות גנומיות פונקציונליות.
- מספק בסיס להחלטות קידום מותאמות סיכון המבוססות על ראיות ישירות למודולציה של המטרה.
- משפר את הערך החזוי לפיתוח ביומרקרים תרגומיים כאשר הדבר נתמך על ידי בדיקות המשך.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד (Pipeline)
שיטת ה-ChIP משתלבת ברצף העבודה מהגילוי ועד לשלב הפרה-קליני על ידי אספקת תיקוף מכניסטי של קישור גורמי שעתוק ובקרה גנטית בתגובה להפעלת מסלול.
- ביולוגיה של גילוי: מאששת אינטראקציות בין חלבון ל-DNA המבוססות על היפותזה ומבהירה מסלולי בקרה.
- סריקה: מספקת נתוני קישור כמותיים לצורך כיול של השפעות תרכובות או ציטוקינים על גיוס גורמי שעתוק.
- אנליטיקה: מייצרת פלטים ספציפיים הניתנים לניתוח סטטיסטי להשוואה בין תנאי ניסוי לבקרה.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין ממצאים מכניסטיים למודלים פרה-קליניים על ידי תיקוף של ויסות גנים במערכות הרלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה זרימת עבודה סטנדרטית וניתנת להתאמה עבור מטרות, סוגי תאים ומסלולי בקרה מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף המטרה.
- ערך תפעולי: מספק בדיקות אינטראקציה בין חלבון ל-DNA סטנדרטיות, הניתנות לשחזור ובעלות יכולת התרחבות.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go ואת הקצאת ההון על ידי אספקת ראיות ישירות למעורבות המטרה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכונים וקידום של תוכניות גילוי המבוססות על נתונים גנומיים תפקודיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביולוגיה מולקולרית ובטכניקות לטיפול בכרומטין.
- מחייב גישה לנוגדנים מאושרים, למערכות חרוזיים מגנטיים ולתשתית אנליטית כמותית.
- מצריך סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים לצורך הדירות והשוואת נתונים.
- עשוי לדרוש התאמה של תנאי שבירת הכרומטין והשיקוע החסוני (immunoprecipitation) עבור סוגי תאים או מטרות שונות.
- תלוי בסגוליות ובאיכות הנוגדן לצורך פרשנות מהימנה של התוצאות.
