Name: הערכת המורכבות בהיפוקמפוס דנדריטי בעכברים בגילאים בשיטת Golgi-Cox (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: למדו את שיטת Golgi-Cox להערכת מורכבות דנדריטית בהיפוקמפוס עכברים. פרוטוקול זה מאפשר צביעה איכותית של רקמת מוח ללא נזק לדגימות, ומסייע בחקר מורפולוגיה נוירונלית וארכיטקטורה מוחית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק פיילוט תחת NIH P20 GM109005 (ARA) ועל ידי המרכז לתרגום Neuroscience IDeA תוכנית הפרס P30 GM110702.

<ol><li>Stuart, G. J., Spruston, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+integration%3A+60+years+of+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dendritic integration: 60 years of progress.</a> Nat Neurosci. 18 (12), 1713-1721 (2015).</li>
<li>Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branching+out%3A+mechanisms+of+dendritic+arborization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Branching out: mechanisms of dendritic arborization.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).</li>
<li>Kulkarni, V. A., Firestein, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dendritic+tree+and+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The dendritic tree and brain disorders.</a> Mol Cell Neurosci. 50 (1), 10-20 (2012).</li>
<li>Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Dynamics+of+Dendritic+Spines+in+Memory+and+Cognition%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Structural Dynamics of Dendritic Spines in Memory and Cognition.</a> Trends Neurosci. 33 (3), 121-129 (2010).</li>
<li>von Bohlen Und Halbach, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+dendritic+spines+within+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Anat%22%5BJournal%5D)">Structure and function of dendritic spines within the hippocampus.</a> Ann Anat. 191 (6), 518-531 (2009).</li>
<li>Wayman, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+dendritic+arborization+mediated+by+CaM-kinase+I+activation+and+enhanced+CREB-dependent+transcription+of+Wnt-2%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2.</a> Neuron. 50 (6), 897-909 (2006).</li>
<li>Bourne, J. N., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+structure+and+function+at+hippocampal+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Balancing structure and function at hippocampal dendritic spines.</a> Ann Rev Neurosci. 31, 47-67 (2008).</li>
<li>Lai, K. O., Ip, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+plasticity+of+dendritic+spines%3A+the+underlying+mechanisms+and+its+dysregulation+in+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Structural plasticity of dendritic spines: the underlying mechanisms and its dysregulation in brain disorders.</a> Biochim Biophys Acta. 1832 (12), 2257-2263 (2013).</li>
<li>Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+development%2C+and+plasticity+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Op+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Structure, development, and plasticity of dendritic spines.</a> Current Op Neurobiol. 9 (3), 343-348 (1999).</li>
<li>Harris, K. M., Kater, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spines%3A+cellular+specializations+imparting+both+stability+and+flexibility+to+synaptic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dendritic spines: cellular specializations imparting both stability and flexibility to synaptic function.</a> Ann Rev Neurosci. 17, 341-371 (1994).</li>
<li>Leuner, B., Shors, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress%2C+anxiety%2C+and+dendritic+spines%3A+what+are+the+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Stress, anxiety, and dendritic spines: what are the connections.</a> Neuroscience. 251, 108-119 (2013).</li>
<li>Harris, K. M., Fiala, J. C., Ostroff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+changes+at+dendritic+spine+synapses+during+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Structural changes at dendritic spine synapses during long-term potentiation.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358 (1432), 745-748 (2003).</li>
<li>Kasai, H., Matsuzaki, M., Noguchi, J., Yasumatsu, N., Nakahara, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12850432">Structure-stability-function relationships of dendritic spines.</a> Trends Neurosci. 26 (7), 360-368 (2003).</li>
<li>Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23681640">The Golgi-Cox method.</a> Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).</li>
<li>Koyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.oapublishinglondon.com/images/article/pdf/1397256114.pdf">The unending fascination with the Golgi method.</a> OA Anat. 1 (3), 24(2013).</li>
<li>Pasternak, J. F., Woolsey, T. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/46234">On the "selectivity" of the Golgi-Cox method.</a> J Comp Neurol. 160 (3), 307-312 (1975).</li>
<li>Friedland, D. R., Los, J. G., Ryugo, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+Golgi+staining+protocol+for+use+in+the+human+brain+stem+and+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A modified Golgi staining protocol for use in the human brain stem and cerebellum.</a> J Neurosci Methods. 150 (1), 90-95 (2006).</li>
<li>Rosoklija, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Golgi+methods+for+impregnation+of+brain+tissue+from+humans+and+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of Golgi methods for impregnation of brain tissue from humans and monkeys.</a> J Neurosci Methods. 131 (1-2), 1-7 (2003).</li>
<li>de Castro, F., Lopez-Mascaraque, L., De Carlos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cajal%3A+lessons+on+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Cajal: lessons on brain development.</a> Brain Res Rev. 55 (2), 481-489 (2007).</li>
<li>Gabbott, P. L., Somogyi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%22single%22+section+Golgi-impregnation+procedure%3A+methodological+description%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">The "single" section Golgi-impregnation procedure: methodological description.</a> J Neurosci Methods. 11 (4), 221-230 (1984).</li>
<li>Zaqout, S., Kaindl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Golgi-Cox+staining+step+by+step%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Golgi-Cox staining step by step.</a> Front Neuroanat. 10 (38), (2016).</li>
<li>superGolgi Kit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.ihcworld.com/products/ssdatasheets/superGolgi%20Kit%20Datasheet%20Protocol.pdf">http://www.ihcworld.com/products/ssdatasheets/superGolgi%20Kit%20Datasheet%20Protocol.pdf</a> (2017).</li>
<li>Vibroslice NVSL & Vibroslice NVSLM123. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.wpiinc.com/clientuploads/pdf/NVSL_NVSLM1_IM.pdf">https://www.wpiinc.com/clientuploads/pdf/NVSL_NVSLM1_IM.pdf</a> (2000).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Neurolucida+11.03%22">Neurolucida 11.03</a>. , MBF Bioscience. Williston, VT USA. (2017).</li>
<li>Sholl, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+organization+in+the+neurons+of+the+visual+and+motor+cortices+of+the+cat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Dendritic organization in the neurons of the visual and motor cortices of the cat.</a> J Anat. 87 (4), 387-406 (1953).</li>
<li>Pillai, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+morphology+of+hippocampal+and+amygdalar+neurons+in+adolescent+mice+is+resilient+to+genetic+differences+in+stress+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Dendritic morphology of hippocampal and amygdalar neurons in adolescent mice is resilient to genetic differences in stress reactivity.</a> PLoS ONE. 7 (6), (2012).</li>
<li>Morley, B. J., Mervis, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+alterations+in+the+hippocampus+and+parietal+cortex+of+alpha7+nicotinic+acetylcholine+receptor+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine alterations in the hippocampus and parietal cortex of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor knockout mice.</a> Neuroscience. 233, 54-63 (2013).</li>
<li>Titus, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypobaric+hypoxia-induced+dendritic+atrophy+of+hippocampal+neurons+is+associated+with+cognitive+impairment+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Hypobaric hypoxia-induced dendritic atrophy of hippocampal neurons is associated with cognitive impairment in adult rats.</a> Neuroscience. 145 (1), 265-278 (2007).</li>
<li>Groves, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Fluorouracil+chemotherapy+upregulates+cytokines+and+alters+hippocampal+dendritic+complexity+in+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">5-Fluorouracil chemotherapy upregulates cytokines and alters hippocampal dendritic complexity in aged mice.</a> Behavioral Brain Research. 316, 215-224 (2017).</li>
<li>Risher, W. C., Ustunkaya, T., Singh Alvarado, J., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Golgi+analysis+method+for+efficient+and+unbiased+classification+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid Golgi analysis method for efficient and unbiased classification of dendritic spines.</a> PloS One. 9 (9), (2014).</li>
<li>Kaufmann, W. E., Moser, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+anomalies+in+disorders+associated+with+mental+retardation%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+cortex%22%5BJournal%5D)">Dendritic anomalies in disorders associated with mental retardation.</a> Cerebral cortex. 10 (10), 981-991 (2000).</li>
<li>Kulkarni, V. A., Firestein, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dendritic+tree+and+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The dendritic tree and brain disorders.</a> Mol Cell Neurosci. 50 (1), 10-20 (2012).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

לעומת טכניקות מודרניות יותר, שיטת Golgi-Cox יש כמה יתרונות שהופכים אותו לשיטה המועדפת לבדיקת מורפולוגיה עמוד השדרה: 1) מכתים ניתן להשתמש עבור כל רקמה, 2) אור בסיסי מיקרוסקופ ההתקנה היא כל מה שצריך לרכוש תמונות מבוסס Golgi, 3) ההדמיה Golgi-Cox הוא מהיר יותר מאשר הדמיה confocal, ו 4) חלקים מוכתמים Golgi הם קיימא במשך מספר חודשים עד שנים יותר מאשר דגימות כי הם fluorescently שכותרתו. גם עם יתרונות אלה, שיטת Golgi-Cox עדיין יש מגבלות מסוימות. ראשית, התהליך כולו הוא זמן רב מאוד, הדורש כ...

<html> הדנדריטים הם החלק הגדול ביותר של נוירונים המקבלים ומעבדים קלט presynaptic 1 . לתהליכים הדנדריטים שלהם יש גיאומטריה מורכבת, שבה לענפים הפרוקסימליים יש קוטר גדול יותר מאשר הענפים הדיסטליים. כמו דנדריטים לפתח, הם יוצרים מספר קשרים עם נוירונים אחרים בתהליך המכונה arborization דנדריטים. היקף ודפוס של הסתעפות זו קובעת את כמות התשומות הסינפטי כי דנדריט יכול לעבד כראוי 2 . דבורריזם arborization הוא תהליך הכרחי עבור פעילות גמישות הפלסטיות ופיתוח תקין של מעגלים נוירונים. הארכה, חזרה, הסתעפות וסינפוגנזה הם תהליכים מורכבים הכוללים תוכניות גנטיות פנימיות והשפעות מגורמים חיצוניים. ההבדלים המורפולוגיים וההסתעפויות של הדנדריטים העצביים בתוך ההיפוקמפוס מעורבים בהבנה קוגניטיבית וזיכרוןF &quot;&gt; 3 , 4. השינויים במורכבות הדנדריטים קשורים לשינויים פתופיזיולוגיים והתנהגותיים 5. הפרעות קשורות למספר מצבי מחלה, כולל תסמונת X שבירה ותסמונת דאון 6 . הקוצים הדנדריטים הם תאים תת תאיים מיוחדים של דבורות arbors לקבל קלט מעורר בתוך מערכת העצבים המרכזית. ישנם שלושה סוגים מורפולוגיים של קוצים דנדריטים, עם שם של כל שיעור על פי גודלם וצורתם: 1) קוצים פטריות, אשר יש צפיפויות מורכבות postsynaptic עם קולטני גלוטמט יותר מאשר קוצים אחרים 7 ; 2) קוצים קטנטנים, שאין להם גזע; ו 3) קוצים דקים, המורכבת גזע מתמשך, צר ראש גלובלית 8 . נפח עמוד השדרה הדנדריטי משמש בחלקו להגדרתם, עם קוצים דקים בדרך כלל קטנים יותר (0.01 מיקרומטר 3 </sup&gt;) לעומת קוצים פטריות (0.8 מיקרומטר 3 ) 9 , 10 . הקוצים מתייצבים עם ההתבגרות. לדוגמה, קוצים דקים או נסוג לאחר כמה ימים או להתפתח פטיש spines. לחלופין, קוצים הפטרייה יציבים יחסית יכול לשרוד במשך תקופה ארוכה.החוזק של קשרים נוירונים הוא חשב להיות מבוסס על מספר הקוצים ו / או נפח שלהם 11 , 12 , 13 . שיטת הקולי הקלסית הקלאסית והווריאציות המודרניות יותר שלה היו מועילות לבחינת המורפולוגיה והצפיפות של עמוד השדרה הדנדריטים. היבט ייחודי אחד של מכתים Golgi היא כי כתמי אקראי על 5% מכלל הנוירונים, המאפשר מעקב אחר נוירונים בודדים 14 , 15 . אמנם את המנגנון המדויק שבו Golgi מתכתמי אוד נוירונים בודדים עדיין לא ידוע, העיקרון של השיטה מבוססת על התגבשות של כרומט כסף (Ag 2 CrO 4 ) 16 , 17 . ישנם שלושה סוגים עיקריים של שיטת Golgi: Golgi מהירה, Golgi-Cox, ואת Golgi-Kopsch 18 , 19 . כל שלוש שיטות להתחיל עם שלב הדגירה הראשונית של מלחי כרום במשך מספר ימים עד חודשים, אבל יש הבדלים מפתח מסוימים ביניהם. Golgi מהירה משתמשת tetroxide אוסמיום בשלב הראשון, ואילו Golgi-Kopsch כולל paraformaldehyde. מכתים הן מהיר Golgi ו Golgi-Kopsch ואחריו הדגירה של פתרון חנקתי 1-2% כסף במשך כ -7 ימים. שיטת Golgi-Cox משתמשת כלוריד כספית אשלגן dichromate במקום חנקתי כסף יש זמן הספגה של 2-4 שבועות. הרקמות נחתכות וממוקמות במהירות באמוניה מדוללתפתרון, ואחריו מסדר צילום כדי להסיר מלחים. מבין שלושת הסוגים, שיטת Golgy-Cox נחשבת הטובה ביותר להכתים את הנמלים הדנדריטים ללא הפרעות רקע רבות, בין היתר, משום שמוצרי הבדולח אינם מופיעים על פני הרקמה (בניגוד לשיטת Golgi המהירה) 17 , 20 , 21 . השיטה הנוכחית היא וריאציה קלה של הפרוטוקול שסופק עם ערכת מכתים Golgi מסחרי, והוא נועד להעריך כיצד מינון נמוך יחסית של 5-פו ישפיע על המאפיינים המורפולוגיים הדנדריטים וצפיפות עמוד השדרה. כל הנתונים שנרכשו יכולים לספק תובנה נוספת כיצד טיפול כימותרפי משפיע על המעגל העצבית.

<table><tbody><tr><td>ערכת superGolgi&nbsp;</td><td>Bioenno Lifesciences</td><td>30100</td><td>&nbsp; מכיל חומרים מסוכנים.&nbsp;</td></tr><tr><td>תרכיז אבקת PBS 10x</td><td>פישר&nbsp;</td><td>BP665-1</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>סיגמא</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>פרמאונט&nbsp;</td><td>פישר&nbsp;</td><td>SP 15-100</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי שקופיות&nbsp;</td><td>פישר&nbsp;</td><td>12-546-14</td><td></td></tr><tr><td>7 מ"ל פיפטת העברה&nbsp;</td><td>גלוב סיינטיפיק&nbsp;</td><td>135030</td><td></td></tr><tr><td>צינורות בז 10 מ"ל&nbsp;</td><td>BD ביוסיינס&nbsp;</td><td></td><td></td>352099</tr><tr><td>נייר כסף&nbsp;</td><td>פישר&nbsp;</td><td>01-213-105</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 12 בארות&nbsp;</td><td>BD ביוסיינס&nbsp;</td><td></td><td></td>353043</tr><tr><td>200 הוכחה אתנול&nbsp;</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>קסילן&nbsp;</td><td>אקרוס אורגניקס&nbsp;</td><td>1330-20-7</td><td>מסוכן.&nbsp;</td></tr><tr><td>Permabond 200</td><td>Permabond LLC</td><td>GF2492</td><td></td></tr><tr><td>25 מ"ל פיפטה סרולוגית</td><td>Sigma</td><td>SIAL1489</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Midsci</td><td>HS234526C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ויברטום&nbsp;</td><td>מכשירי דיוק עולמיים&nbsp;</td><td>NVSLM1</td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6 עכברים זכרים&nbsp;</td><td>מעבדת ג'קסון&nbsp;</td><td></td><td></td>000664</tr><tr><td>Axio Imager 2</td><td>ZEISS</td><td>רכיבים מרובים, ראה webאתר לפרטים.&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת AxioCam MRc</td><td>ZEISS</td><td>426508-9902-000</td><td></td></tr><tr><td>צלחת מכתים,</td><td>Green Tissue-Tek</td><td>62541-12</td><td></td></tr><tr><td>סט כלי מכתים&nbsp;</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית&nbsp;</td><td>70312-20</td><td></td></tr><tr><td>מילוי פיפט ממונע&nbsp;</td><td>פישר&nbsp;</td><td>03-692-168</td><td></td></tr><tr><td>נוירולוסידה&nbsp;</td><td>MBF ביו-סיינס&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>נוירולוסידה אקספלורר&nbsp;</td><td>MBF ביו-סיינס&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פריזמה&nbsp;</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הערכת המורכבות בהיפוקמפוס דנדריטי בעכברים בגילאים בשיטת golgi-cox

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

קוצים דנדריטים הם הבולטים של פירים דנדריטים נוירונים המכילים סינפסות מעוררות. ההבדלים המורפולוגיים וההסתעפויות של הדנדריטים העצביים בתוך ההיפוקמפוס מעורבים בהבנה קוגניטיבית וזיכרון. ישנן מספר גישות מכתים Golgi, אשר כולם היו שימושיים לקביעת המאפיינים המורפולוגיים של דנדריטים סוכות לייצר רקע ברור. השיטה הנוכחית Golgi-Cox, (וריאציה קלה של הפרוטוקול מסופק עם ערכת מכתים Golgi מסחרי), נועד להעריך כיצד מינון נמוך יחסית של התרופה chemotherapeutic 5-flurouracil (5-Fu) ישפיע על המורפולוגיה הדנדריטים , את מספר הקוצים, ואת המורכבות של arborization בתוך ההיפוקמפוס. 5-Fu מאופיינת באופן משמעותי את המורכבות הדנדריטים והורידה את צפיפות עמוד השדרה לאורך ההיפוקמפוס באופן ספציפי לאזור. הנתונים המוצגים מראים כי שיטת מכתים Golgi efמוכתמים בצורה נוקשה את הנוירונים הבוגרים ב- CA1, CA3, ואת gyrus משוננת (DG) של ההיפוקמפוס. פרוטוקול זה מדווח על הפרטים עבור כל צעד, כך שחוקרים אחרים יכולים לרקום כתם אמין ברחבי המוח עם תוצאות באיכות גבוהה ופתרון בעיות מינימלי.

ההשפעות של טיפול 5-Fu על arborization המורכבות הדנדריטים ואת ההיפוקמפוס של קטעי מוח מוכתמים Golgi היו לכמת ו traced באמצעות תוכנת הדמיה זמין מסחרית. לאחר המעקב, ניתחו את ההסתגלות הדנדריטית, את צפיפות עמוד השדרה ואת מורפולוגיה עמוד השדרה באמצעות ניתוח Sholl ומדד המורכבות הדנדריטים (DCI). ניתוח Sholl היא שיטה כמותית אנליטית שניתן להשתמש בהם כדי לקבוע את מורפולוגיה דנדריטים arbor 25 . החל מן soma, מעגלים 10 מיקרומטר מלבד אחד את...

כאן אנו מציגים פרוטוקול Golgi-Cox בפירוט רב. זו שיטה אמינה רקמת כתם מאפשר הערכה איכותית גבוהה של cytoarchitecture בהיפוקמפוס, ובכל רחבי המוח כולו, עם פתרון מינימלי.

הערכת המורכבות בהיפוקמפוס דנדריטי בעכברים בגילאים בשיטת Golgi-Cox

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

המטרה הכללית של מתודולוגיה זו היא לבצע צביעת גולג'י תקינה לרקמת מוח על מנת לבחון ולכמת את המורפולוגיה והמורכבות הדנדריטית. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח במדעי העצבים. מכיוון שצביעת גולג'י צובעת רק תת-קבוצה קטנה של תאים, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי למפות את מבנה הנוירונים.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לצבוע חתכי מוח בקלות ללא חשש שהם יתייבשו או ינשרו במהלך אחד משלבי השטיפה. את הפרוצדורה ידגימו פרד קיפר, טיילר אלכסנדר וג'ולי אנדרסון, סטודנטים לתארים מתקדמים במעבדה של ד"ר אלן. התחילו על ידי טבילה של חצאי מוח של מכרסמים, שנקטפו טריים ולא קובעו, ב-5 milliliters של תמיסה המבוססת על mercuric chloride.כיוון שתמיסת מרקורי כלוריד רגישה לאור, יש לכסות את המבחנה בנייר אלומיניום. יש לאחסן את הדגימות בחושך בטמפרטורת החדר. למחרת, יש למסוך בזהירות את התמיסה למכל זמני לפני השלכתה כראוי למכל פסולת ביולוגית מסוכנת.הוסיפו חמישה מיליליטרים של תמיסת mercuric chloride טרייה וודאו שהמוחות טבולים. החזירו את הדגימות למקום חשוך בטמפרטורת החדר למשך 13 ימים נוספים. לאחר 14 ימים, הכינו באפר לאחר ספיגה (post-impregnation buffer) על ידי הוספת 30 גרם של אבקת post-impregnation buffer ל-90 מיליליטרים של מים מזוקקים או דה-יוניים, DH2O.מלאו כל באער בלוחית שש-בארים ב-6.5 milliliters של באפר לאחר ההחדרה (post-impregnation buffer), באער אחד לכל מוח. לאחר מכן, הסירו את תמיסת כסופית הכלוריד מרקמת המוח כפי שבוצע קודם לכן. שטפו את הרקמה ב-DH2O, ואז העבירו את הרקמה ללוחיות שש-הבארים המכילות את הבאפר לאחר ההחדרה.כסו את הצלחות בנייר אלומיניום ואחסנו בטמפרטורת החדר בחושך. למחרת, שאבו והחליפו את בופר לאחר הספיגה. כסו שוב את הצלחת ואחסנו במקרר בטמפרטורה של 4 °C.הכינו שתי או שלוש פלטות בעלות 12 בארות לכל מוח, על ידי סימון המכסים של הפלטות במספרים בסדר עולה משמאל לימין ומלמעלה למטה. הוסיפו את מספר הזיהוי של המוח שנחתך. העבירו בפיפטה 2 mL של 1X PBS לכל בארה בכל פלטה, לאחר מכן הגדירו את הבמה והפעילו את הוויברטום.לאחר מכן, הדביקו סרט דביק על בלוק הרקמה של מחזיק הדגימה והוסיפו מעט דבק ציאנואקרילט מעליו. הוציאו מוח מתוך פלטת שש הבארות והניחו אותו על צלחת פלסטיק או זכוכית. השתמשו בלהב פלדת אל-חלד דו-צדדי כדי לחתוך את ה-cerebellum כודאלית, תוך וידוא שחלק ה-cerebellum שנותר על המוח שטוח.לאחר מכן, הנח את המשטח השטוח של שארית המוחון על הדבק. לאחר שהדבק התייבש, הכנס את מחזיק הדגימה עם הרקמה לאמבט הדגימה. הנח את אמבט הדגימה על הוויברטום וכסה את דגימת הרקמה ב-PBS.לאחר מכן, חברו את הלהב למחזיק הלהבים של הוויברטום והורידו באיטיות את הלהב אל תוך אמבט הדגימות עד שיהיה טבול לחלוטין ומעט מתחת לחלקו העליון של הרקמה. כעת, הגדירו את מהירות הוויברטום ל-7, את האמפליטודה ל-6 ואת זווית החיתוך ל-12 מעלות. הפעילו את הרטט ובצעו חיתוכים בעובי 200-micron.השתמשו במברשת צבע גדולה כדי להעביר את חיתוכי הרקמה מאמבט הדגימות לכל באער מיועד בלוחות בעלי 12 באערים. המשיכו לחתוך את הרקמה עד להגעה למספר החיתוכים הרצוי. לאחר החיתוך, השתמשו בפיפטת העברה כדי לשאוב את ה-PBS מהבאערים בלוח בעל 12 הבאערים, לאחר מכן הוסיפו two milliliters של PBS-T ושטפו למשך 30 דקות תוך כדי ערבוב.לקראת סיום תקופת השטיפה, דללו שלושה חלקים של תמיסת ammonium hydroxide בחמישה חלקים של DH2O. לאחר מכן, לאחר הסרת ה-PBS-T, הוסיפו את תמיסת ה-ammonium hydroxide המדוללת. הגנו מאור באמצעות נייר אלומיניום וצבעו את החתכים למשך 19 עד 21 דקות.לאחר מכן, לאחר הסרה בטוחה של תמיסת האמוניום הידרוקסיד, יש להוסיף בופר לאחר צביעה (post-staining buffer). יש להגן בנייר אלומיניום ולצבוע למשך 19 עד 21 דקות נוספות. לבסוף, יש לשטוף את החתכים ב-PBS-T שלוש פעמים, למשך חמש עד 10 דקות בכל פעם.העבירו את החתכים לסליידים מצופים ב-1% gelatin באמצעות מברשת צבע גדולה. הניחו להם להתייבש במשך 20 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הניחו אותם ב-Coplin Jar והשאירו למשך הלילה. הוציאו את הסליידים מה-Coplin Jar והניחו אותם במעמד פלסטיק בתוך מ خدنا של מנדף.הנח בתוך כלי צביעה המכיל 100% ethanol למשך חמש דקות. בצע דהידרציה לסבכים באמצעות שני שטיפות נוספות של ethanol למשך חמש דקות כל אחת. לאחר מכן, הנח את השקופיות במעמד זכוכית והשתמש בידית מתכת כדי להוריד את המעמד לתוך כלי צביעה מזכוכית המכיל 99% xylene.שטפו את השקופיות בשני סבבים של xylene למשך חמש דקות כל אחד. לאחר שחלף הזמן לשטיפה השנייה, הוציאו את השקופיות מה-xylene אחת אחת וכסו במהירות את הרקמה בכ-0.25 milliliters של מדיום קיבוע (mounting media). לאחר מכן, קחו כיסוי שקופית והניחו אותו מעל המדיום.דחפו בועות אוויר כלואות מתחת למכסי הזכוכית לשוליים באמצעות חפץ קהה, כגון קצה של מברשת צבע. הניחו את השקופיות באזור שאינו חשוף לאור שמש ישיר והניחו להן להתייבש במשך יומיים עד שלושה ימים. לאחר הייבוש, עברו לרכישת תמונות באמצעות מיקרוסקופ ולניתוח באמצעות התוכנה המתאימה.תמונה זו בשדה בהיר מציגה נוירון שנצבע בשיטת Golgi העומד בקריטריונים לדימוי ולניתוח נוסף. ניתן לראות בקלות את שלושת סוגי הקוצים. הצביעה עקבית לאורך כל הדנדריט, והדנדריט מבודד מנוירונים אחרים.איור זה מראה כי נוירונים שנצבעו בשיטת Golgi בתוך ה-Dentate Gyrus הראו ירידה באורך בסדר הרביעי והשישי בעקבות טיפול ב-5-fluorouracil בהשוואה לקבוצה שטופלה במי מלח (saline). ניתן להשתמש בצביעת Golgi כדי לזהות הבדלים משמעותיים בצפיפות הקוצים (spine density). בדנדריטים פירמידליים אפקליים באזור CA1, מתן 5-fluorouracil לעכברים חיים הפחית באופן משמעותי את צפיפות הקוצים.בדנדריטים הבזאליים, לא נצפו שינויים משמעותיים בצפיפות הכללית של הקוצים. ניתוח שול (Sholl Analysis) של דנדריטים פירמידליים אפקליים ב-CA1 העלה כי טיפול ב-5-fluorouracil הפחית באופן משמעותי את ההסתעפות הדנדריטית במרחקים שבין 40 ל-160 מיקרונים מהסומה. בדנדריטים הבזאליים, הטיפול ב-5-fluorouracil הפחית את ההסתעפות הדנדריטית במרחק של 30 עד 110 מיקרונים מהסומה.ברגע שהטכניקה נשלטת, התהליך — הכולל את צביעת הגולג'י, ההרכבה, הניקוי והכיסוי — יכול להסתיים תוך שלוש שעות לכל מוח, במידה והוא מבוצע כראוי. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הנוירוביולוגיה לחקור קשרים נוירו-אנטומיים במודל של עכברים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להשאיר את החתכים בתמיסת ammonium hydroxide למשך 19 עד 21 דקות בלבד, כדי למנוע צביעת יתר של הנוירונים.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן הנכון לצבוע, לחתוך לפרוסות ולשטוף רקמת מוח. זכרו כי עבודה עם תמיסה המבוססת על mercuric chloride, תמיסת ammonium hydroxide ו-xylene עלולה להיות מסוכנת ביותר, לכן יש לנקוט באמצעי זהירות, להשתמש בכפפות מעבדה ולעבוד תחת מנדף כימי בעת ביצוע הליך זה.

assessment-hippocampal-dendritic-complexity-aged-mice-using-golgi-cox

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

טכניקה לנתיחה להסרת gyrus משוננת מהעכבר הבוגרת תחת stereomicroscope הודגם פרוטוקול וידאו מוקלט זה.

Dissection של gyrus משוננת בהיפוקמפוס מתוך עכבר למבוגרים

מאמר זה מתאר פרוצדורות להכנת פרוסות בהיפוקמפוס של חולדות העכברים הטרנסגניים לחקר שינויים סינפטיים הקשורים להזדקנות המוח הקשורים לגיל מחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר.

הכנת פרוסות בהיפוקמפוס של חולדות חריפה העכברים הטרנסגניים לחקר שינויים Synaptic במהלך ההזדקנות עמילואיד פתולוגיה

מאמר זה מתאר את הנהלים לגירוי חוש המישוש של גורי חולדה ומכתים Golgi-קוקס הבא של מורפולוגיה עצבית. גירוי חוש המישוש הוא חוויה חיובית כי הוא מנוהל בתקופה סביב הלידה על ידי מלטף את הגורים עם מטלית משק בית. מכתים Golgi-קוקס הוא הליך אמין המאפשר ההדמיה של כל הנוירונים.

לדמיין את ההשפעות של ניסיון מוקדם חיובי, מישוש גירוי, על דנדריטים מורפולוגיה וSynaptic קישוריות עם Golgi-קוקס מכתים

אנו מתארים שתי שיטות להדמיה וכימות של ארבוריזציה דנדריטית בהיפוקמפוס של מודלים של עכברים: הדמיה בזמן אמת ועומק שדה מורחב. בעוד שהשיטה הראשונה מאפשרת מעקב טופוגרפי מתוחכם וכימות של היקף ההסתעפות, השנייה מאפשרת הדמיה מהירה של העץ הדנדריטי.

הערכה של דנדריטים arborization ברכס המשונן של האזור בהיפוקמפוס של עכברים

אנו מציגים פרוטוקול בשיטת מכתים גולגי-קוקס בסעיפי מוח עבים, כדי להמחיש נוירונים עם עצי דנדריטים ארוכים בתוך דגימות רקמה אחת. שתי גרסאות של פרוטוקול זה גם מוצגים שכוללות counterstaining סגול cresyl, והקפאת המוח מעובד עבור אחסון לטווח ארוך.

נוירונים הדמיה בתוך חלקים במוח עבים שימוש בשיטת גולגי-קוקס

נוהל לאיתור ואבחון מדויק סינפסות בהיפוקמפוס פרוסות באמצעות immunofluorescence הוא המתוארים במאמר זה.

הערכה של צפיפות סינפסה פרוסות המוח מכרסמים בהיפוקמפוס

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר גישה לניתוח התנהגות של מבוגרים בתאי גזע/מחולל קדמון בתגובה לטיפול כימוגנטי של מעגל מקומי ספציפי עצביים.

Assaying בוויסות מעגל ספציפי של היפוקמאל מבוגרים תאים מקודמן עצבי

זהו פרוטוקול להכנת פרוסה חריפה מהיפוקמפוס עכבר מבוגר ומזדקן המנצל את התסיסה הקרדיאלית וחיתוך פרוסה עם NMDG-aCSF קר כקרח כדי להפחית את הנזק היפוקסי לרקמות. הפרוסות המתוברות נשארות בריאות במשך שעות רבות, ומתאימים לטלאים ארוכי טווח ולהקלטות שדה.

מזעור היפוקסיה בפרוסות היפוקמפוס מעכברים מבוגרים ומזדקנים

אנו מציגים פרוטוקול להכנת פרוסות חריפות מההיפוקמפוס הגבי-ביניים של עכברים. אנו משווים הכנה רוחבית זו עם חתך קורנל במונחים של איכות הקלטות ושמירה על תכונות מורפולוגיות של נוירונים מוקלטים.

הכנת פרוסות חריפות מהיפוקמפוס הגבי להקלטה של תא שלם ושחזור עצבי בGyrus דנטאטה של עכברים בוגרים

הפרוטוקול מתאר שינוי של שיטת גולגי המהירה, אשר ניתן להתאים לכל חלק של מערכת העצבים, עבור הכתמת נוירונים בהיפוקמפוס וקליפת המוח הקדם מצחית המדיאלית של החולדה.

כתם גולגי מהיר להדמיית עמוד שדרה דנדריטי בהיפוקמפוס וקליפת המוח הקדם-מצחית

למדו את שיטת Golgi-Cox להערכת מורכבות דנדריטית בהיפוקמפוס עכברים. פרוטוקול זה מאפשר צביעה איכותית של רקמת מוח ללא נזק לדגימות, ומסייע בחקר מורפולוגיה נוירונלית וארכיטקטורה מוחית.

הערכת המורכבות בהיפוקמפוס דנדריטי בעכברים בגילאים בשיטת Golgi-Cox

גלה סרטונים נוספים