הערכת המורכבות בהיפוקמפוס דנדריטי בעכברים בגילאים בשיטת Golgi-Cox

המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא לצבוע כראוי את רקמת המוח של גולגי על מנת לבחון ולכמת מורפולוגיה ומורכבות דנדריטית. שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח במדעי המוח. מאחר שצביעת גולגי צובעת רק תת-קבוצה קטנה של תאים, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לעקוב אחר מבנה הנוירונים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להכתים קטעי מוח בקלות ללא סיכון שהם יתייבשו או ייפלו במהלך כל אחד משלבי הכביסה. ידגימו את ההליך פרד קיפר, טיילר אלכסנדר וג'ולי אנדרסון, סטודנטים לתארים מתקדמים במעבדתו של ד"ר אלן. התחל בטבילת חצאי מוחות מכרסמים טריים ולא מקובעים בחמישה מיליליטר או בתמיסה מבוססת כלוריד כספי.

מכיוון שתמיסת כלוריד כספית רגישה לאור, מכסים את הצינור בנייר כסף. אחסן את הדגימות בחושך בטמפרטורת החדר. למחרת, שפכו לאט את התמיסה למיכל זמני לפני שתשליכו אותה כראוי למיכל פסולת ביולוגית.

הוסף חמישה מיליליטר של תמיסת כלוריד כספית טרייה וודא שהמוח טובל. החזירו את הדגימות לחושך בטמפרטורת החדר למשך 13 ימים נוספים. לאחר 14 יום, הכינו מאגר לאחר הספגה על ידי הוספת 30 גרם של מאגר לאחר הספגה מופעל ל-90 מיליליטר מים מזוקקים או נטולי יונים, DH2O.

מלאו כל באר בצלחת שש הבארות ב-6.5 מיליליטר של המאגר שלאחר ההספגה, באר אחת לכל מוח. לאחר מכן, הסר את תמיסת הכלוריד הכספי מרקמת המוח כמו קודם. שטפו את הטישו עם DH2O, ולאחר מכן העבירו את הרקמה לצלחות שש הבארות עם מאגר לאחר הספגה.

מכסים את הצלחות בנייר כסף ושומרים בטמפרטורת החדר בחושך. למחרת, שאפו והחליפו את המאגר שלאחר ההספגה. מכסים מחדש את הצלחת ושומרים במקרר של ארבע מעלות צלזיוס.

הכינו שתיים או שלוש צלחות של 12 בארות לכל מוח על ידי תיוג הצלחות על העפעפיים שלהן עם מספרים בסדר עולה משמאל לימין ומלמעלה למטה. הוסף את מספר הזיהוי של חתך המוח. פיפטה שני מיליליטר של 1X PBS לכל באר של כל צלחת, ואז הקימו את הבמה והפעילו את הוויברטום.

לאחר מכן, הניחו סרט על גוש הרקמות של מחזיק הדגימה והוסיפו מעט דבק ציאנואקרילט מעל. הוציאו מוח מצלחת שש הבארות והניחו אותו על צלחת פלסטיק או זכוכית. השתמש בלהב פיפיות מפלדת אל-חלד כדי לחתוך את המוח הקטן בזנב, וודא שהחלק של המוח הקטן שנותר על המוח שטוח.

לאחר מכן, הניחו את המשטח השטוח של המוח הקטן שנותר על הדבק. לאחר שהדבק יבש, הנח את מחזיק הדגימה עם הרקמה לתוך אמבט הדגימה. הנח את אמבט הדגימה על הוויברטום וכסה את דגימת הרקמה ב-PBS.

לאחר מכן, חבר את הלהב למחזיק הלהב של הוויברטום והורד לאט את הלהב לתוך אמבט הדגימה עד שהוא שקוע לחלוטין ומעט מתחת לחלק העליון של הרקמה. לאחר מכן, הגדר את מהירות הרטט לשבע, את המשרעת לשש ואת זווית החיתוך ל -12 מעלות. התחל את הרטט וחתוך קטעים של 200 מיקרון.

השתמש במברשת צבע גדולה כדי להעביר את חלקי הרקמות מאמבט הדגימה לכל באר ייעודית של צלחות 12 הבארות. המשך לחתוך את הרקמה עד להגעה למספר הרצוי של קטעי רקמה. לאחר החיתוך, השתמש בפיפטה העברה כדי לשאוב את ה- PBS מהבארות של צלחת 12 הבארות, ואז להוסיף שני מיליליטר PBS-T ולשטוף במשך 30 דקות בתסיסה.

לקראת סוף תקופת הכביסה, יש לדלל שלושה חלקים תמיסת אמוניום הידרוקסיד עם חמישה חלקים DH2O. לאחר מכן, לאחר הסרת ה-PBS-T, הוסף את תמיסת האמוניום הידרוקסיד המדוללת. יש להגן מפני אור באמצעות נייר כסף ולהכתים את החלקים למשך 19 עד 21 דקות.

לאחר מכן, לאחר הסרת תמיסת האמוניום הידרוקסיד בבטחה, הוסף מאגר לאחר צביעה. יש להגן עם נייר כסף וכתם למשך 19 עד 21 דקות נוספות. לבסוף, שטפו את החלקים ב-PBS-T שלוש פעמים במשך חמש עד 10 דקות בכל פעם.

הרכיבו את החלקים על שקופיות מצופות ג'לטין 1% בעזרת מברשת הצבע הגדולה. הניחו להם להתייבש במשך 20 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר, ואז הניחו אותם בצנצנת קופלין והשאירו למשך הלילה. הסר את השקופיות מצנצנת קופלין והניח אותן ברשת פלסטיק במכסה האדים.

מניחים בכלי מכתים המכיל 100% אתנול למשך חמש דקות. ייבש את החלקים באמצעות שתי שטיפות אתנול נוספות של חמש דקות. לאחר מכן, הניחו את השקופיות ברשת זכוכית והשתמשו בידית מתכת כדי להוריד את המתלה לכלי כתמים מזכוכית המכיל 99% קסילן.

שטפו את השקופיות בשני החלפות של קסילן למשך חמש דקות כל אחת. לאחר שחלף זמן הכביסה השנייה, הסר את השקופיות מהקסילן אחת בכל פעם וכסה במהירות את הרקמה בכ- 0.25 מיליליטר של אמצעי הרכבה. לאחר מכן, קח מכסה שקופיות והניח אותו על המדיה.

דחוף את כל בועות האוויר הכלואות מתחת לכיסויי השקופיות לקצה עם חפץ קהה, כגון קצה מברשת הצבע. הניחו את המגלשות באזור הרחק מאור שמש ישיר והניחו להן להתייבש במשך יומיים-שלושה. לאחר הייבוש, המשך לרכישת תמונה באמצעות מיקרוסקופ וניתוח עם התוכנה המתאימה.

תמונת שדה בהירה זו מציגה נוירון מוכתם בגולגי העומד בקריטריונים להדמיה וניתוח נוסף. ניתן לראות בקלות את כל שלושת סוגי עמוד השדרה. הצביעה עקבית לכל אורך הדנדריט והדנדריט מבודד מתאי עצב אחרים.

איור זה מראה כי נוירונים מוכתמים בגולגי בתוך הבליטה המשוננת הראו ירידה באורך בסדר הרביעי והשישי לאחר טיפול ב-5-פלואורואורציל בהשוואה לקבוצה שטופלה במי מלח. ניתן להשתמש בצביעת גולגי כדי לזהות הבדלים משמעותיים בצפיפות עמוד השדרה. בדנדריטים פירמידליים אפיקליים CA1, מתן 5-fluorouracil לעכברים חיים הפחית משמעותית את צפיפות עמוד השדרה.

בדנדריטים הבסיסיים, לא היו שינויים משמעותיים בצפיפות הכללית של הקוצים. ניתוח שול של דנדריטים פירמידליים אפיקליים CA1 גילה כי טיפול ב-5-פלואורואורציל הפחית משמעותית את הארבוריזציה הדנדריטית במרחקים שבין 40 ל-160 מיקרון מהסומה. בדנדריטים הבסיסיים, הטיפול ב-5-פלואורואורציל הפחית את הארבוריזציה הדנדריטית במרחק של 30 עד 110 מיקרון מהסומה.

לאחר שליטה, טכניקה זו, הלוקחת בחשבון הן את תהליך הצביעה של גולגי והן את ההרכבה, הניקוי והכיסוי יכולה להיעשות תוך שלוש שעות לכל מוח אם היא מבוצעת כראוי. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הנוירוביולוגיה לחקור קשרים נוירו-אנטומיים במודל עכברים. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור את החלקים בתמיסת אמוניום הידרוקסיד למשך 19 עד 21 דקות בלבד כדי לא להכתים יתר על המידה את הנוירונים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לצבוע, לחתוך ולשטוף כראוי רקמת מוח. אל תשכח שעבודה עם תמיסה מבוססת כלוריד כספי, תמיסת אמוניום הידרוקסיד וקסילן עלולה להיות מסוכנת ביותר, לכן נקוט באמצעי זהירות ולבש כפפות מעבדה ועבוד במכסה אדים בעת ביצוע הליך זה.