Reiring מעגלים נוירונים: שיטה חדשה להארכה Neurite מהיר חיבור פונקציונלי העצבית

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליזום נויריטים חדשים, להרחיב אותם במהירות ולחבר אותם במדויק לתאי מטרה. הליך זה אפשרי רק על ידי שימוש בתאים הגדלים בסביבה מבוקרת וניתנת לשחזור. שיטה זו מאפשרת לנו לענות על שאלות מפתח במדעי המוח.

מה מגביל את קצב הצמיחה של נוירונים? כמה מהר הם יכולים לצמוח? האם רמזים מכניים משחקים תפקיד?

אנו יכולים גם לחקור כיצד נוצרות סינפסות, כיצד תאי עצב מוצאים תא מטרה? איך סינפסות מזדקנות, מתבגרות? ושלישית, אנחנו יכולים להתחיל לבנות רשתות עצביות באופן שיטתי, לחקור כיצד נוירונים מחשבים.

היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא מאפשרת מניפולציה קלה, שחזור ניסיוני, ובסופו של דבר רמה גבוהה של שליטה ברמת התא הבודד. כדי להתחיל בהליך זה, יש לנקות ולהכין את המספר הרצוי של החלקות כיסוי סטריליות. לאחר מכן, מצפים כל תלוש כיסוי ב-0.5 עד 1 מיליליטר של 100 מיקרוגרם למיליליטר PDL למשך שעתיים לפחות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, שטפו את הכיסוי מחליק פעמיים במים והסירו את כל הנוזלים. הניחו להם להתייבש בסביבה סטרילית למשך 5 עד 10 דקות או עד שהמשטח יבש לחלוטין. לאחר מכן, הנח את המכשירים המיקרופלואידיים כשהתבניות פונות כלפי מעלה מתחת לאור ה-UV בארון בטיחות ביולוגית למשך 10 דקות.

לאחר 10 דקות, הנח מכשיר מיקרופלואידית כשהתבנית פונה כלפי מטה במגע עם החלקת הכיסוי הנקייה. השתמש בפינצטה כדי ללחוץ בעדינות על המכשיר כך שיידבק לזכוכית. כדי למלא את מכשיר האוכלוסייה הבודדת במדיום, הוסף 50 מיקרוליטר של מדיום תאים שלם לבאר העליונה הימנית.

ואז הוסף עוד 50 מיקרוליטר של מדיום תאים שלם לאלכסון הבאר אליו. כדי למלא את מכשיר האוכלוסיות המרובות במדיום, הוסף 30 מיקרוליטר של NBM שלם לשורה אחת של בארות. וודא שהמדיום זורם בין הבארות.

לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר בינוני לכל אחת מהבארות הנותרות. מניחים את המכשירים בצלחת גדולה יותר עם צלחת פתוחה של מים שעברו חיטוי, ומניחים את המנה באינקובטור למשך שעה עד שעתיים תוך כדי הכנת תרבית התאים. כעת, הסר את המדיום מהבארות העליונות של המכשירים המיקרופלואידיים מבלי לרוקן את הבארות.

לאחר מכן, הוסף 20 מיקרוליטר מתמיסת התא המרוכז לבאר הימנית העליונה של המכשיר המיקרופלואידי, ובדוק במיקרוסקופ כיצד תאים זורמים בתוך המכשיר המיקרופלואידי. כדי לצלחת תאים במכשיר האוכלוסיות המרובות, הוסף 20 מיקרוליטר מתמיסת התאים המרוכזת לכל אחת מהבארות העליונות. תחת המיקרוסקופ, בדוק אם התאים נמצאים בתוך התאים.

לאחר מכן, הנח את המכשירים בחממה למשך 15 עד 30 דקות כדי לקדם את הצמדת התאים למצע. לאחר שהתאים מתחברים למצע, הוסף 40 מיקרוליטר של NBM לשתי הבארות העליונות של מכשיר האוכלוסייה היחידה. זה יעזור להסיר את בועות האוויר מתעלות המיקרו.

הוסף 20 מיקרוליטר של MBM לבארות העליונות של מכשיר האוכלוסיות המרובות, אותן בארות שבהן הוזרקו התאים. המדיה צריכה לבלוט מעט כדי ליצור מניסקוס חיובי, ולתת לבארות היבט עליון של מאפינס. יום עד יומיים לפני הסרת המכשיר המיקרופלואידי, הוסף שני מיליליטר של NBM מחומם מראש לכל צלחת דגימה והציף את התאים.

לאחר מכן, שמור את המכשירים בחממה. לאחר מכן, השתמש בפינצטה סטרילית ובקצה פיפטה כדי להסיר את המכשירים המיקרופלואידיים מהחלקות הכיסוי ולהשאיר תצורה מעוצבת של נוירונים. בהליך זה, ו-40 עד 60 מיקרוליטר מהחרוזים המצופים PDL המוכנים לתרבית התאים.

לאחר מכן, החזר את הדגימה לחממה למשך שעה כדי לקדם היווצרות מגעים סינפטיים. לאחר מכן, התקן את הדגימה במערך ניסיוני כך שניתן יהיה להעריך את התאים מלמעלה על ידי שני מיקרו-פיפטות, וגם לגשת אליהם אופטית. בתצורה זו, מצלמת CCD ממוקמת ביציאה הצדדית של המיקרוסקופ לצילום תמונה.

חבר כל פיפטה מלאה במי מלח למזרק מיליליטר אחד, ולאחר מכן החדיר את הדגימה בתמיסת מלח פיזיולוגית. לאחר מכן, תחת המיקרוסקופ, בדקו את הפער בין שתי אוכלוסיות הנוירונים המבודדות כדי לוודא ששתי האוכלוסיות אינן מחוברות באופן טבעי. בחר חרוז PDL שאינו מחובר לנוירון בשדה הראייה.

יישר את החרוז עם קצה מיקרופיפטה על ידי התמקדות בחרוז ולאחר מכן במיקרופיפטה. לאחר מכן, קרב את הקצה ככל האפשר לחרוז על ידי ניטור שלו דרך המיקרוסקופ. לאחר מכן, הפעילו לחץ שלילי על הפיפטה כדי להרים את החרוז, ושמרו על הלחץ השלילי לאורך כל הניסוי.

כעת, בחר חרוז PDL המחובר לנוירון בשדה הראייה, והצמד אותו למיקרופיפטה השנייה באמצעות יניקה. משוך את קומפלקס נוירוני חרוז ה-PDL על ידי הזזה איטית של המיקרומניפולטור או שלב הדגימה ב-0.5 מיקרומטר לדקה למשך מיקרומטר אחד, והשהה למשך חמש דקות כדי לאפשר התחלת נויריט. משוך את קומפלקס תאי העצב של חרוזי PDL על ידי הזזתו לאט לרוחב במהירות של 0.5 מיקרומטר לדקה על פני שני מיקרומטרים, ואז עצור למשך חמש דקות כדי לאפשר התארכות נויריט.

לאחר התחלה מוצלחת והארכת נויריט עבור חמשת המיקרומטרים הראשונים, משכו ברציפות את הנויריט במהירות של 20 מיקרומטר לדקה. כדי לחבר את הנוירונים, בחרו אזור עשיר בנוירונים. השתמש בחרוזים אחרים כדי לאמוד את גובה קצה הפיפטה מעל החלקת הכיסוי, והורד את קומפלקס הנויריט של חרוז PDL כך שהוא ייגע פיזית עם הנויריטים.

השאירו את קומפלקס הנויריט של חרוז ה-PDL במגע עם נויריט המטרה תוך כדי מניפולציה של המיקרו-פיפטה השנייה. לאחר מכן, הורידו את הפיפטה השנייה עם חרוז ה-PDL השני על גבי הנויריט החדש שנוצר כ-20 מיקרומטר מהחרוז הראשון, והשתמשו בחרוז ה-PDL השני כדי לדחוף את חוט הנויריט החדש לעבר תא המטרה. לאחר מכן, החזיקו את שני החרוזים במקומם למשך שעה לפחות.

ודא את היעדר נפיחות מוקדית, עיבוי של הנויריטים המגעים עם החרוז, באמצעות המיקרוסקופ. במהלך תקופה זו, שנה לאט את המדיום של הדגימה מתמיסת מלח פיזיולוגית ל-NBM מאוזן של פחמן דו חמצני מחומם מראש. שחרר את החרוז מהפיפטה השנייה על ידי שחרור היניקה.

אם הנויריט החדש נשאר מחובר, שחררו גם את החרוז הראשון. לאחר מכן, הנח בזהירות את הדגימה בחזרה באינקובטור כדי לחזק את הקשר העצבי לניסויים עתידיים. אתה יכול להשתמש בהקלטות מהדק תיקון תא שלם כדי לחקור את הפונקציונליות החשמלית של החיבור המיקרו-מניפולטיבי.

מוצגות כאן אוכלוסיות עצביות מבודדות המופרדות על ידי פער של 100 מיקרומטר במיקרו-התקני PDMS. הקלטות מהדק זוג לתיקון בוצעו בתצורת תא שלם, והחיבורים המושרים מכנית נותחו, והושוו לאלו באוכלוסיות עצביות מחוברות באופן טבעי, ואוכלוסיות לא מחוברות. התגובות החשמליות לאחר פוטנציאל הפעולה הפרה-סינפטי שנרשמו מהנוירונים המחוברים באופן טבעי ועל ידי מיקרומניפולציה גבוהות משמעותית ומתואמות באופן זמני עם הפעילות הקדם-סינפטית.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שמונה שעות אם היא נעשית כראוי, ובזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שיהיו תרביות תאים בריאות ומעוצבות היטב לטווח ארוך כדי להבטיח תוצאות מהירות וניתנות לשחזור. בעקבות הליך זה ניתן להשתמש בשיטות שונות כדי לאמת את הפונקציונליות החשמלית של החיבור המיקרו-מניפולטיבי. אחרי הצפייה בסרטון הזה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לגדל אוכלוסיות תאים בתאים מיקרופלואידיים, ולהשתמש במניפולציות של פיפטות כדי ליזום, להרחיב ולחבר נויריטים.