Name: Reiring מעגלים נוירונים: שיטה חדשה להארכה Neurite מהיר חיבור פונקציונלי העצבית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: חקור שיטה להארכה וחיבור נויריטים במהירות באמצעות חרוזים מצופים poly-D-lysine ומיקרופיפטות. השיטה מאפשרת מחקר מדויק של קצב צמיחת נוירונים והשפעת גורמים מכניים על התפתחות עצבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנחנו רוצים להודות יואיצ&#39;י Miyahara על דיונים מועילים רבים תובנות. MA ו PG להכיר מימון NSERC.

<ol><li>Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenges+of+long-distance+axon+regeneration+in+the+injured+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Brain.+Res%22%5BJournal%5D)">The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS.</a> Prog. Brain. Res. 201, 253-294 (2012).</li>
<li>Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+a+new+growth+cone+after+axotomy%3A+the+precursor+to+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 189-193 (2012).</li>
<li>Aguayo, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+connections+made+by+axons+regenerating+in+the+central+nervous+system+of+adult+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synaptic connections made by axons regenerating in the central nervous system of adult mammals.</a> J. Exp. Biol. 153, 199-224 (1990).</li>
<li>Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tension+can+specify+axonal+fate+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons.</a> J Cell Biol. 159 (3), 499-508 (2002).</li>
<li>Goslin, K., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+observations+on+the+development+of+polarity+by+hippocampal+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture.</a> J Cell Biol. 108 (4), 1507-1516 (1989).</li>
<li>Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Establishment+of+polarity+by+hippocampal+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Establishment of polarity by hippocampal neurons in culture.</a> J. Neurosci. 8 (4), 1454-1468 (1988).</li>
<li>Magdesian, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+mechanically+controlled+rewiring+of+neuronal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rapid mechanically controlled rewiring of neuronal circuits.</a> J. Neurosci. 36 (3), 979-987 (2016).</li>
<li>Lucido, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+assembly+of+functional+presynaptic+boutons+triggered+by+adhesive+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rapid assembly of functional presynaptic boutons triggered by adhesive contacts.</a> J. Neurosci. 29 (40), 12449-12466 (2009).</li>
<li>Suarez, F., Thostrup, P., Colman, D., Grutter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+presynaptic+protein+recruitment+induced+by+local+presentation+of+artificial+adhesive+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of presynaptic protein recruitment induced by local presentation of artificial adhesive contacts.</a> Dev. Neurobiol. 73, 1123-1133 (2013).</li>
<li>General Laboratory Techniques. An Introduction to Working in the Hood. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. 
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5036/an-introduction-to-working-in-the-hood">https://www.jove.com/science-education/5036/an-introduction-to-working-in-the-hood</a> (2016).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monitoring cell growth.</a> Curr Protoc Immunol. A-3A, (2001).</li>
<li>Beaudoin, G. M. 3rd, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+pyramidal+neurons+from+the+early+postnatal+mouse+hippocampus+and+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex.</a> Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).</li>
<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).</li>
<li>Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+outgrowth+of+cultured+neurons+is+not+limited+by+growth+cone+competition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Axonal outgrowth of cultured neurons is not limited by growth cone competition.</a> J. Cell Sci. 111, 3245-3252 (1998).</li>
<li>Pfister, B. J., Bonislawski, D. P., Smith, D. H., Cohen, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sketch-grown+axons+retain+the+ability+to+transmit+active+electrical+signals%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Sketch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals.</a> FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).</li>
<li>Magdesian, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+reveals+important+differences+in+axonal+resistance+to+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy reveals important differences in axonal resistance to injury.</a> Biophys. J. 103 (3), 405-414 (2012).</li>
<li>Polleux, F., Snider, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiating+and+growing+an+axon%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Persp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Initiating and growing an axon.</a> CSH Persp. Biol. 2 (4), 001925(2010).</li>
<li>Debanne, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired-recordings+from+synaptically+coupled+corticol+and+hippocampal+neurons+in+acute+and+cultured+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Paired-recordings from synaptically coupled corticol and hippocampal neurons in acute and cultured brain slices.</a> Nat. Protoc. 3, 1559-1568 (2008).</li>
<li>Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+and+Morphological+Characterization+of+Neuronal+Microcircuits+in+Acute+Brain+Slices+Using+Paired+Patch-Clamp+Recordings%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings.</a> J. Vis. Exp. (95), e52358(2015).</li>
<li>Harrison, R. G. <a target="_blank" href="http://rspb.royalsocietypublishing.org/content/118/808/155">On the origin and development of the nervous system studied by the methods of experimental embryology.</a> Proc. R. Soc. Lond. B. , 155-196 (1935).</li>
<li>Weiss, P. <a target="_blank" href="http://www.worldcat.org/title/nerve-patterns-the-mechanics-of-nerve-growth/oclc/537059321">Nerve patterns: the mechanics of nerve growth.</a> Growth 5 (Suppl. Third Growth Symposium). , 153-203 (1941).</li>
<li>Gray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+neural+growth%3A+calcitonin+gene-related+peptide+and+substance+P-containing+nerves+attain+exceptional+growth+rates+in+regenerating+deer+antler%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P-containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler.</a> Neurosci. 50 (4), 953-963 (1992).</li>
<li>Heidemann, S. R., Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tension-driven+axon+assembly%3A+a+possible+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tension-driven axon assembly: a possible mechanism.</a> Front. Cell Neurosci. 9, (2015).</li>
<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Axonal growth in response to experimentally applied tension.</a> Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).</li>
<li>Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tension+as+a+regulator+of+axonal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Mechanical tension as a regulator of axonal development.</a> Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytomechanics+of+axonal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Cytomechanics of axonal development.</a> Cell Biochem. Biophys. 27 (3), 135-155 (1995).</li>
<li>Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+stretch+growth+of+integrated+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extreme stretch growth of integrated axons.</a> J. Neurosci. 24 (36), 7978-7983 (2004).</li>
<li>Waxman, S. G., Kocsis, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWaxman%2C+SG+%22The+axon%3A+structure%2C+function+and+pathophysiology%22">The axon: structure, function and pathophysiology</a>. , Oxford University Press, USA. (1995).</li>
<li>Cho, E. Y., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate+of+regrowth+of+damaged+retinal+ganglion+cell+axons+regenerating+in+a+peripheral+nerve+graft+in+adult+hamsters%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Rate of regrowth of damaged retinal ganglion cell axons regenerating in a peripheral nerve graft in adult hamsters.</a> Brain Res. 419, 369-374 (1987).</li>
<li>Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+differences+in+the+growth+rate+of+early+nerve+fibres+related+to+target+distance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intrinsic differences in the growth rate of early nerve fibres related to target distance.</a> Nature. 337, 553-555 (1989).</li>
</ol>

המחבר מרגרט H Magdesian הוא מנכ&quot;ל אננדה התקנים המייצרת מכשירים המשמשים במאמר זה.

באמצעות micromanipulation רגיל ומכשירים microfluidic חדשניים, טכניקה חדשה פותחה כדי ליזום במהירות, להאריך ולדויק לחבר מעגלים נוירונים פונקציונליים חדשים על פני מרחקים גדולים. פיפטה micromanipulation הוא כלי נפוץ ביותר במעבדות המוח 4 , 13 . האתגר האמיתי להשגת תוצאות לשחזור ואמינה היה סטנדרטיזציה של תרבויות נוירונים בריאים, הממוקמים במדויק במשך תקופת הניסוי (אשר יכול להיות על פי סדר של שבועות) באמצעות פיתוח של התקנים microfl...

פציעות במערכת העצבים המרכזית הבוגרת (CNS) עלולות להוביל לנכות קבועה בשל מנגנונים מרובים המגבילים את הצמיחה מחדש של הצירים. בעקבות פציעה, רבים אקסונים CNS לא יוצרים קונוס צמיחה חדשה להיכשל תגובה משובי יעיל 2 . יתר על כן, נזק ורקמת צלקת סביב נגעים CNS לעכב באופן משמעותי צמיחה axonal 1 , 2 , 3 . טיפולים הנוכחי כדי לקדם התחדשות CNS לאחר הפציעה התמקדו בשיפור פוטנציאל הצמיחה המהותי של הנוירון הפצוע ועל מסיכה את מעכבי הארכת סיבי המשויך פסולת מיאלין צלקת גלייה 1 , 3 . למרות זאת, היכולת ליצור מחדש את האקסונים הארוכים למטרות רחוקות וליצור סינפסות פונקציונאליות מתאימות נותרה מוגבלת מאוד 4 , </suP&gt; 5 , 6 , 7 . בעבודה הנוכחית, microbeads, micromanipulation פיפטה, והתקנים microfluidic משמשים ליזום במהירות, להאריך, בדיוק לחבר מעגלים נוירונים פונקציונליים חדשים על פני מרחקים ארוכים. עבודה קודמת הראתה כי poly-D- ליזין מצופה חרוזים (PDL חרוזים) לגרום הידבקות קרום ואחריו אשכולות של קומפלקסים שלפוחית ​​סינפטי ויצירת boutons presynaptic תפקודית 8 . זה הוכח גם כי כאשר חרוז PDL הוא משך מכנית משם לאחר הבחנה presynaptic, אשכול חלבון סינפטי הבא חרוז, ייזום neurite חדש 9 . ההליך הבא מנצל עובדה זו יחד עם היכולת התרבות נוירונים בהיפוקמפוס עובריים של חולדות לאזורים מאורגנים על coverslip באמצעות polydimethylsiloxane (PDMS) מכשירים microfluidic כדי בדיוק rewire נוירוניםמעגל חשמלי. אלה מכשירים PDMS microfluidic אינם רעילים, שקוף אופטית מורכבת משני חדרים מחוברים על ידי מערכת של microchannels. לאחר התאספו על coverslip, כל התקן משמש עובש להנחות צמיחה העצבית ולשמור על תרבויות עצביות בריאים על דפוסים מדויקים במשך יותר מ 4 שבועות במבחנה . כאן, במסגרת מוצג במסגרתו לחקור את גבולות הארכה ופונקציונליות של neurite החדש. חדש, neurites תפקודית נוצרים וממוקמים לשליטה (re) רשתות נוירונים. שיעורי ההארכה מושגת הם מהר יותר מ 20 מיקרומטר / דקות על פני מרחקים בקנה מידה מילימטר קשרים פונקציונליים נקבעים. תוצאות אלה מראות, באופן בלתי צפוי, כי היכולת הפנימית של אלה neurites להארכה היא הרבה יותר מהר ממה שחשבו בעבר. גישה מכנית מוצעת זו עוקפת אסטרטגיות כימיות איטיות ומאפשרת חיבור מבוקר ליעד מסוים. תהיא טכניקה פותחת אפיקים חדשים למחקר חוץ גופית של טיפולים חדשניים כדי לשחזר את הקישוריות העצבית לאחר הפציעה. זה גם מאפשר מניפולציה ו rewiring של רשתות נוירונים לחקור היבטים בסיסיים של עיבוד אותות עצביים תפקוד העצבית במבחנה .

<table><tbody><tr><td>התקני קו-תרבית</td><td>Ananda Devices</td><td></td><td>זמינים מסחרית ב-http://www.anandadevices.com</td></tr><tr><td>Neuro</td><td>Devices Ananda Devices</td><td></td><td>זמינים מסחרית ב-http://www.anandadevices.com</td></tr><tr><td>מס' 1 כיסוי זכוכית 25 מ"מ עגול</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0705</td><td></td></tr><tr><td>35 מ"מ תחתית זכוכית צלחות #0, לא מצופה,</td><td>תאגיד MatTex</td> בהקרנת גמא<td>P35G-0-20-C</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים 35 מ"מ, לא פירוגנית,</td><td>צלחת פטרי</td> סטרילית <td>430165</td><td></td></tr><tr><td>95 מ"מ x 15 מ"מ, מכסה ניתן להחלקה, פוליסטירן סטרילי</td><td>פישרברנד</td><td>FB0875714G</td><td></td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה 50 מ"ל עם סימונים מודפסים וכובעים שטוחים</td><td>VWR</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>צינור חרוטי פוליפרופילן 15 מ"ל, סגנון 17 x 120 מ"מ, לא פירוגני, בז סטרילי</td><td></td><td></td><td></td>352097</tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td> תוסף B-27 <td>תמיסה חוץ-תאית</td></tr><tr><td>(50X),</td><td>תוסף B-27 ללא סרום (50X), ללא סרום</td><td>17504044</td><td>תמיסה חוץ-תאית</td></tr><tr><td>פניצילין, סטרפטומיוצין, גלוטמין</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>11995-065</td><td>פתרון חוץ-תאי</td></tr><tr><td>200 &mu; L Pipettors</td><td>VWR</td><td>89079-458</td><td></td></tr><tr><td>2 - 20 &mu; L פיפטורים</td><td>טיפים עמידים לתרסיס</td><td>2149P</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 3 מ"ל פיפטות העברה [לא סטריליות]</td> <td>BD Falcon</td><td>357524</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>Gibco</td><td>15023-021</td><td>תמיסה חוץ-תאית</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>תמיסה/חרוזים חוץ-תאיים</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td>תמיסה</td></tr> <tr><td>חוץ-תאיתKCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7447-40-7</td><td>תמיסה חוץ-תאית</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10043-52-4</td><td>תמיסה חוץ-תאית</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td>פתרון חוץ-תאי</td></tr><tr><td>#5 פינצטה Dumont Dumostar 11 ס"מ</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>500233</td><td></td></tr><tr><td>כלי דיסקציה</td><td>בראון, Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine Hydrobromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו חלקיקים המבוססים על פוליסטירן, 10 &mu; m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72986</td><td></td></tr><tr><td>צינורות בורוסיליקט</td><td>King Precision Glass, Inc.</td><td>14696-2</td><td></td></tr><tr><td>אופקי חולץ פיפטה</td><td>Sutter Instruments</td><td>מיקרומניפולטורים P-97</td><td></td>חומים-בוערים</tr><tr>, <td>מכשירי SD</td><td>מסדרת PCS-5000</td><td>MC7600R</td><td></td></tr><tr><td>מזרק 1 מ"ל</td><td>BD Luer-Lok</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך</td><td>אולימפוס&nbsp;</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>אובייקטיבי</td><td>אולימפוס</td><td>UIS2, LUCPLFLN 40X</td><td></td></tr><tr><td>CCD</td><td>מצלמה פוטומטרית</td><td>מפל II: 512</td><td></td></tr><tr><td>לייבוביץ (1x) L-15 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11415-064</td><td>Rat Dissection</td></tr><tr><td>Typsin-EDTA (0.05%), פנול אדום</td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td><td>דיסקציה</td></tr> <tr><td>של חולדותDMEM (1x) מדיום נשר מעובד של Dulbecco [+4.5 גרם/ליטר D-גלוקוז, + L-גלוטמין, + 110 מ"ג/ליטר נתרן פירובט]</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td>דיסקציה של חולדות</td></tr><tr><td>HBSS (1x) תמיסת המלח המאוזנת של האנק [- סידן כלורי, - מגנזיום כלוריד, - מגנזיום גופרתי]</td> <td>Life Technologies</td><td>14170-112</td><td>דיסקציה של חולדות</td></tr></tbody></table>

reiring מעגלים נוירונים: שיטה חדשה להארכה neurite מהיר חיבור פונקציונלי העצבית

Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

פגיעה במוח ובחוט השדרה עלולה להוביל למוות ולמוות קבועים, משום שעדיין לא ניתן ליצור מחדש נוירונים על פני מרחקים ארוכים ולחבר אותם במדויק עם מטרה מתאימה. הנה הליך המתואר במהירות ליזום, להאריך, בדיוק לחבר מעגלים נוירונים פונקציונליים חדשים על פני מרחקים ארוכים. שיעורי ההארכה שהושגו להגיע מעל 1.2 מ&quot;מ / שעה, 30-60 פעמים מהר יותר מאשר את שיעורי vivo של האקסונים הצומחים במהירות ממערכת העצבים ההיקפית (0.02-0.44 מ&quot;מ / שעה) 28 ו 10 פעמים מהר יותר מאשר דיווח בעבר סוג נוירונים בשלב מוקדם יותר של התפתחות 4 . ראשית, אוכלוסיות מבודדות של נוירונים בהיפוקמפוס חולדה גדלים במשך 2-3 שבועות במכשירים microfluidic למיקום המדויק של התאים, המאפשר micromanipulation קל וניבוי ניסיוני. הבא, חרוזים מצופה poly-D- ליזין (PDL) ממוקמים על neurites כדי ליצור דבק contמעשים ו micromanipulation פיפטה משמש להזיז את החרוז שנוצר neadite חרוז. כמו חרוז הוא זז, זה מושך neurite חדש שיכול להיות המורחבת על מאות מיקרומטר מחובר תפקודית לתא היעד בתוך פחות מ 1 שעות. תהליך זה מאפשר שחזור נסיוני וקלות של מניפולציה תוך עקיפת אסטרטגיות כימיות איטיות יותר כדי לעודד צמיחה neurite. מדידות ראשוניות המוצגות כאן מדגימות קצב גידול עצבי הרבה מעבר לפיזיולוגיה. שילוב החידושים הללו מאפשר הקמה מדויקת של רשתות עצביות בתרבות עם מידה חסרת תקדים של שליטה. זוהי שיטה חדשנית שפותחת את הדלת שפע של מידע ותובנות שידור אות תקשורת בתוך הרשת העצבית כמו גם להיות מגרש משחקים שבו לחקור את גבולות הצמיחה העצבית. יישומים פוטנציאליים וניסויים נפוצים עם השלכות ישירות על טיפולים שמטרתם להתחבר neuronaמעגלים לאחר טראומה או במחלות נוירודגנרטיביות.

עובריים עכברוש נוירונים בהיפוקמפוס הם מתורבת במכשירים microfluidic כדי לאפשר מיקום מדויק של תאים, PDL חרוזים micromanipulators. הצעד הראשון הוא כראוי להרכיב את המכשיר microfluidic על coverslip זכוכית או צלחת. זה חיוני כי המכשיר microfluidic להיות מחובר היטב המצע, כדי למנוע תאים היוצאים מן החדרים נעים מתחת לחלקים של המכשיר כי צריך להיות אטום ( איור 1 א ). כדי לשמור על תרבויות בריאות במשך מספר שבועות, חשוב למנוע אידוי בי...

הליך זה מתאר כיצד במהירות ליזום, להרחיב ולחבר neurites מאורגן בתאי microfluidic באמצעות poly-D- ליזין מצופה חרוזים קבוע micropipettes כי מדריך התארכות neurite.

Reiring מעגלים נוירונים: שיטה חדשה להארכה Neurite מהיר חיבור פונקציונלי העצבית

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להשרות צמיחה של נוריטים חדשים, להאריך אותם במהירות ולחבר אותם במדויק לתאי מטרה. פרוצדורה זו אפשרית רק באמצעות שימוש בתאים שגודלו בסביבה מבוקרת וניתנת לשחזור. שיטה זו מאפשרת לנו לענות על שאלות מפתח במדעי העצב.מה מגביל את קצב הצמיחה של נוירונים? באיזו מהירות הם יכולים לגדול? האם רמזים מכניים ממלאים תפקיד?אנו יכולים ללמוד גם כיצד נוצרים סינפסים, כיצד נוירונים מוצאים תא מטרה? כיצד סינפסים מזדקקים ומבשילים? ושלישית, אנו יכולים להתחיל לבנות רשתות נוירונים באופן שיטתי ולחקור כיצד נוירונים מבצעים חישובים.היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא מאפשרת מניפולציה קלה, שחזור ניסיוני, ובסופו של דבר דרגת בקרה גבוהה ברמה של תא בודד. כדי להתחיל בהליך זה, נקו והכינו את המספר הרצוי של לביבות כיסוי סטריליות. לאחר מכן, צפו כל לביבת כיסוי ב-0.5 עד 1 milliliters של 100 µg/mL PDL למשך שעתיים לפחות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, שטפו את כיסויי הזכוכית פעמיים במים והסִירו את כל הנוזל. הניחו להם להתייבש בסביבה סטרילית למשך 5 עד 10 דקות או עד שהפני השטח יבשו לחלוטין. לאחר מכן, הניחו את המכשירים המיקרופלואידיים כאשר התבניות פונות כלפי מעלה תחת אור UV בתוך קבינה לבטיחות ביולוגית למשך 10 דקות.לאחר 10 דקות, הניחו התקן מיקרופלואידי כאשר התבנית פונה כלפי מטה במגע עם כיסוי הזכוכית הנקי. השתמשו בפינצטה כדי ללחוץ בעדינות על ההתקן כך שיידבק לזכוכית. כדי למלא את התקן האוכלוסייה הבודדת במצע, הוסיפו 50 µL של מצע תאים מלא לבאר העליונה מימין.לאחר מכן, הוסיפו 50 µL נוספים של מצע תרבית תאים מלא לבאר שמעומתה באלכסון. כדי למלא את מכשיר האוכלוסיות המרובות במצע, הוסיפו 30 µL של NBM מלא לשורה אחת של בארות. ודאו שהמצע זורם בין הבארות.לאחר מכן, הוסיפו 50 µL של מצע לכל אחת מהבארות שנותרו. הניחו את ההתקנים בתוך פלטה גדולה יותר עם צלחת פתוחה של מים שעברו אוטוקלאב, והכניסו את הצלחת לאינקובטור למשך שעה עד שעתיים בזמן הכנת תרבית התאים. כעת, הסירו את המצע מהבארות העליונות של ההתקנים המיקרופלואידיים מבלי לרוקן את הבארות לחלוטין.לאחר מכן, הוסיפו 20 µL של תמיסת התאים המרוכזת לבאר הימנית העליונה של ההתקן המיקרופלואידי, ובדקו תחת המיקרוסקופ כיצד התאים זורמים בתוך ההתקן המיקרופלואידי לאוכלוסייה בודדת. להחדרת תאים להתקן של אוכלוסיות מרובות, הוסיפו 20 µL של תמיסת התאים המרוכזת לכל אחת מהבארים העליונות. בדקו תחת המיקרוסקופ אם התאים נמצאים בתוך התאים (chambers).לאחר מכן, הניחו את המכשירים באינקובטור למשך 15 עד 30 דקות כדי לעודד היצמדות של התאים לתשתית. לאחר שהתאים נצמדו לתשתית, הוסיפו 40 µL של NBM לשתי הבארות העליונות של מכשיר האוכלוסייה הבודדת. פעולה זו תסייע בהסרת בועות אוויר מהמיקרו-תעלות.הוסיפו 20 µL של MBM לבארים העליונות של התקן לאוכלוסיות מרובות, אותן בארים שבהן הוזרקו התאים. המדיה צריכה לבלוט מעט כדי ליצור מניסקוס חיובי, ולהעניק לבארים מראה של "ראש מאפין" (muffin top). יום עד יומיים לפני הסרת ההתקן המיקרופלואידי, הוסיפו 2 מיליליטר של NBM שחומם מראש לכל צלחת דגימה והמיסו את התאים בתוך התאים.לאחר מכן, השאירו את המכשירים באינקובטור. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה סטרילית ובקצה פיפטה כדי להסיר את המכשירים המיקרופלואידיים מהכיסויות, כך שתישאר תצורה דפוסית של נוירונים. בהליך זה, הוסיפו 40 עד 60 µL של חרוזי PDL מצופים שהוכנו לתרבית התאים.לאחר מכן, החזירו את הדגימה לאינקובטור למשך שעה אחת כדי לעודד היווצרות של מגעים סינפטיים. לאחר מכן, התקינו את הדגימה במערך הניסויי כך שניתן יהיה להעריך את התאים מלמעלה באמצעות שתי מיקרופיפטות, וכן לגשת אליהם באופן אופטי. בתצורה זו, מצלמת CCD ממוקמת בפתח הצדי של המיקרוסקופ לצורך לכידת תמונות.חברו כל פיפטה מלאה בתמיסת מלח למזרק של one milliliter, ולאחר מכן בצעו פרפוזיה לדגימה באמצעות תמיסת מלח פיזיולוגית. לאחר מכן, תחת המיקרוסקופ, בדקו את המרווח שבין שתי אוכלוסיות הנוירונים המבודדות כדי לוודא ששתי האוכלוסיות אינן מחוברות באופן טבעי. בחרו חבב PDL שאינו צמוד לנוירון בשדה הראייה.יישרו את החרוז עם קצה המיקרופיפט על ידי מיקוד על החרוז ולאחר מכן על המיקרופיפט. לאחר מכן, קרבו את הקצה ככל האפשר אל החרוז תוך מעקב דרך המיקרוסקופ. לאחר מכן, הפעילו לחץ שלילי בפיפט כדי לאסוף את החרוז, ושמרו על הלחץ השלילי לאורך כל הניסוי.כעת, בחרו חרוזי PDL המחוברים לנוירון בשדה הראייה, והצמידו אותם למיקרופיפטה השנייה באמצעות שאיבה. משכו את קומפלקס חרוזי ה-PDL והנוירון על ידי הזזה איטית של המיקרו-מניפולטור או של במת הדגימה במהירות של 0.5 micrometers לדקה למרחק של 1 micrometer, והמתינו חמש דקות כדי לאפשר התחלה של צמיחת נוריטים. משכו את קומפלקס חרוזי ה-PDL והנוירון על ידי הזזה איטית שלו הצידה במהירות של 0.5 micrometers לדקה למרחק של שני micrometers, ולאחר מכן המתינו חמש דקות כדי לאפשר התארכות של הנוריטים.לאחר התחלה מוצלחת והארכת נוריטים בחמישה מיקרומטרים הראשונים, משכו את הנוריט באופן רציף במהירות של 20 מיקרומטרים לדקה. כדי לחבר את הנוירונים, בחרו אזור עשיר בנוריטים. השתמשו בחרוש (beads) אחרים כדי למדוד את גובה ראש הפ pipette מעל הלוח המכסה (cover slip), והורידו את קומפלקס הנוריטים של חרוש ה-PDL כך שיהיה במגע פיזי עם הנוריטים.השאירו את קומפלקס חרוץ ה-PDL והנוריט במגע עם הנוריט המטרה בזמן התפעול של המיקרופיפט השני. לאחר מכן, הורידו את הפיפט השני עם חרוץ ה-PDL השני אל מעל הנוריט שזה עתה נוצר, במרחק של כ-20 micrometers מהחרוץ הראשון, והשתמשו בחרוץ ה-PDL השני כדי לדחוף את סיב הנוריט החדש לכיוון תא המטרה. לאחר מכן, החזיקו את שני החרוצים במקומם למשך שעה אחת לפחות.אששו באמצעות המיקרוסקופ את היעדרו של נפיח מוקדי (focal swelling), שהנובע מעיבוי של הניוריטים הבאים במגע עם החרוז. במהלך זמן זה, החליפו באיטיות את המדיום של הדגימה ממי מלח פיזיולוגיים ל-NBM שחומם מראש והושרה בדו-חמצן פחמני. שחררו את החרוז מהפיפטה השנייה על ידי הפסקת השאיבה.אם הנויריט החדש נותר מחובר, שחררו גם את החרוז הראשון. לאחר מכן, החזירו בזהירות את הדגימה למדגרה כדי לחזק את החיבור העצבי עבור ניסויים עתידיים. ניתן להשתמש בהקלטות whole cell patch clamp כדי לבחון את התפקוד החשמלי של החיבור שעבר מיקרו-מניפולציה.כאן מוצגות אוכלוסיות נוירונליות מבודדות המופרדות על ידי מרווח של 100 מיקרומטר במיקרו-מכשירים של PDMS. הקלטות patch clamp של זוגות בוצעו בתצורת תא שלם (whole-cell), והקשרים שהושגו באופן מכני נותחו והושוו לאלו שקיימים באוכלוסיות נוירונליות המחוברות באופן טבעי, ולאוכלוסיות שאינן מחוברות. התגובות החשמליות לאחר פוטנציאל פעולה פרה-סינפטי, שהוקלטו מנוירונים המחוברים באופן טבעי ובאמצעות מיקרו-מניפולציה, גבוהות באופן משמעותי ומתואמות זמנית עם הפעילות הפרה-סינפטית.לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בשמונה שעות אם היא מבוצעת כראוי, ובמהלך ניסיונות ביצוע של הליך זה, חשוב לזכור להשתמש בתרביות תאים ארוכות טווח בריאות ובעלות תבניות טובות כדי להבטיח תוצאות מהירות וניתנות לשחזור. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות שונות כדי לאמת את התפקודיות החשמלית של החיבור שעבר מיקרומניפולציה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לגדל אוכלוסיות תאים בתאי מיקרופלואידיקה, ולהשתמש במניפולציות של פיפטה כדי ליזום, להאריך ולחבר נוריטים.

rewiring-neuronal-circuits-new-method-for-fast-neurite-extension

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פרספקטיבות על המוח

סרטון זה מדגים טכניקה לאתחול והרחבה מהירים של תא עצב ויצירת קשרים חדשים עם נוירון מטרה באמצעות מכשיר מיקרופלואידי ומיקרומניפולציה. זה יכול לשמש לטיפולים שמטרתם לחבר מחדש מעגלים עצביים לאחר טראומה או במחלות נוירודגנרטיביות.

ייזום הרחבה והיווצרות מהירה של תאי עצב קשרים עצביים פונקציונליים

מתואר פרוטוקול ליצירת מערכת תרבית משותפת המורכבת מתאי עצב שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), נוירונים ראשוניים בקליפת המוח ואסטרוציטים. מערכת קו-תרבית זו מאפשרת לזהות היווצרות של מגעים ומעגלים סינפטיים בין נוירונים חדשים שמקורם ב-iPSC לבין נוירונים קיימים בקליפת המוח המבטאים channelrhodopsin-2.

גישת optogenetic להערכת יצירת קשרים עצביים במערכת Co-תרבות

כתב יד זה מתאר פרוטוקול לגדול ברשתות מודולרי מבחנה המורכבת של מעגלים עצביים, מבחינה תפקודית בין מחוברים-מוגבלים במרחב. מסכת פולימרים משמשת לדפוס שכבת חלבון לקדם הידבקות סלולרית על מצע culturing. נוירונים מצופים לגדול באזורים מצופים יצירת קשרים ספונטניים ומציג פעילות אלקטרו.

עיצוב, משטח טיפול, סלולרי ציפוי, וCulturing של רשתות עצבי מודולרי מורכב ממעגלי קשרים בין פונקציונלי

אנו לשנות וליישם פרוטוקול שפורסם בעבר המתאר את הבידול מהירה, לשחזור, ויעיל של תאי גזע מושרים אנושיים (hiPSCs) לתוך נוירונים בקליפת המוח מעוררים 12. באופן ספציפי, השינוי שלנו מאפשר שליטה של ​​צפיפות תאים עצבית ושימוש על מערכים מיקרו-אלקטרודות למדוד תכונות אלקטרו ברמת הרשת.

בידול העצבי המהיר של גזע תאים המושרה pluripotent למדידת פעילות רשת על מערכי מייקרו-אלקטרודה

כתב היד הזה מפרט את ייצור של רקמות מיקרו- רקמות מהונדסות ברשתות עצביות: מבנים תלת-מימדיים בגודל מיקרון המורכבים משטחים אקסונליים ארוכי טווח המקיפים אוכלוסייה נוירונית מצטברת (s), המצופים בהידרוגול צינורי. אלה הפיגומים החיים יכולים לשמש ממסרים תפקודית לשחזר או לווסת מעגלים עצביים או כמו מיטות בדיקה ביופידלית מחקה נוירונטומי חומר אפור לבן.

אנטומיה השראה תלת מימדי מיקרו רקמות מתוכנן רשתות עצביות עבור שחזור מערכת העצבים, אפנון, דוגמנות

אנחנו ראווה הפיתוח של חבילות שהורכב עצמית, תלת מימדי של somata astrocytic longitudinally מיושר ותהליכים בתוך למטרתו biomaterial הרומן. אלה מהונדסים "חי פיגומים", מפגין בקנה מידה מיקרון קוטר עדיין הארכת ס מ אורך, עשוי לשמש מבחן-מיטות לימוד מנגנוני התפתחותיות או להקל על neuroregeneration על-ידי הגירה העצבית המשגה ו/או עצב pathfinding.

תלת מימדי רקמות מהונדסים מיושר אסטרוציט רשתות כדי לסכם מנגנונים התפתחותית וכדי להקל על מערכת העצבים התחדשות

כאן אנו מציגים את שיטת מודל אנושי במבחנה של פציעה מתיחה בתבנית 96-ובכן בציר הרלוונטי לפגיעה טראומה. זה כולל שיטות בדיית לוחות מתיחה, לכימות את העלבון מכני culturing, ופצעו תאים, הדמיה, ניתוח תוכן גבוהה לכמת פגיעה.

שיטת עבור מהירות גבוהה מתיחה פציעתו של האדם המושרה נוירונים נגזר תאי גזע Pluripotent בתבנית 96-ובכן

בהתבסס על הנדסת חוץ גופית ויראלי של מראש עצבי, שיתוף ההשתלה שלהם למוח פראי סוג ולזווג הערכה מורמטרית של "מבחן" ו "שליטה" נגזרים, שיטה זו מאפשרת דוגמנות מדויקת של בקרת vivo gene של הנאוקורטילית עצב מורפולוגיה בדרך פשוטה ובמחיר סביר.

השתלת השתלות מהונדסים של הנדסה עצבית בVivo לימודי נוירוארכיטקטורה

בדו ח זה, אנו מתארים פרוטוקול פשוט עבור לימוד neurite מוצלח בנוירונים הקליפת המוח העובריים על ידי שיתוף הפעולה עם egfp ואת חלבון הריבית.

משופרת ירוק מבוסס חלבון פלואורסצנטית מבוססת על לימוד Neurite Outgrowth בנוירונים ראשוניים

מבחני צמיחת עצבים מספקים ערך כמותי על תהליכים עצביים רגנרטיביים. היתרון של תוכנה חצי אוטומטית זו הוא שהיא מחלקת גופי תאים ונוירוטים בנפרד על ידי יצירת מסכה ומודדת פרמטרים שונים כגון אורך נוירוט, מספר נקודות הסתעפות, שטח אשכול תא-גוף ומספר אשכולות תאים.

סטנדרטיזציה של תוכנה חצי-אוטומטית חדשנית למדידת צמיחת עצבים 

חקור שיטה להארכה וחיבור נויריטים במהירות באמצעות חרוזים מצופים poly-D-lysine ומיקרופיפטות. השיטה מאפשרת מחקר מדויק של קצב צמיחת נוירונים והשפעת גורמים מכניים על התפתחות עצבית.

Reiring מעגלים נוירונים: שיטה חדשה להארכה Neurite מהיר חיבור פונקציונלי העצבית

גלה סרטונים נוספים