Name: כל תא תיקון מהדק הקלטות של תאים אפיתל העיקרי מבודדים מן האברדימיס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: למדו את שיטת תיקון המהדק השלם לבידוד תאים אפיתליים מאפידידימיס העכברוש ומדידת תכונות חשמליות. שיטה זו חיונית להבנת תפקידיהם הפיזיולוגיים בבגרות הזרע.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד&quot;ר כריסטופר אנטוס על הערות מועילות על הטקסט. עבודה זו נתמכה על ידי מימון סטארט-אפ מאוניברסיטת שנחאי-טק שהוענק לוויני שום ובמימון הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NNSFC מס &#39;31471370).

<ol><li>Shum, W. W. C., Ruan, Y. C., Da Silva, N., Breton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+Cell-Cell+Cross+Talk+in+the+Epididymis%3A+Control+of+Luminal+Acidification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Androl%22%5BJournal%5D)">Establishment of Cell-Cell Cross Talk in the Epididymis: Control of Luminal Acidification.</a> J Androl. 32 (6), 576-586 (2011).</li>
<li>Robaire, B., Hinton, B. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRobaire%2C+B+%22Knobil+and+Neill%27s+Physiology+of+Reproduction%22">Knobil and Neill's Physiology of Reproduction</a>. Plant, T. M., Zeleznik, A. J. , Elsevier. 691-771 (2015).</li>
<li>Da Silva, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dense+network+of+dendritic+cells+populates+the+murine+epididymis%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">A dense network of dendritic cells populates the murine epididymis.</a> Reproduction. 141 (5), 653-663 (2011).</li>
<li>Kolb, H. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKolb%2C+HA+%22Special+Issue+on+Ionic+Channels+II%22">Special Issue on Ionic Channels II</a>. , Springer. 51-91 (1990).</li>
<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/abstract/S0092-8674(07)01531-0">Calcium Signaling.</a> Cell. 80 (2), 259-268 (1995).</li>
<li>Frizzell, R. A., Hanrahan, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+Epithelial+Chloride+and+Fluid+Secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spr+Harb+Pers+Med%22%5BJournal%5D)">Physiology of Epithelial Chloride and Fluid Secretion.</a> Cold Spr Harb Pers Med. 2 (6), (2012).</li>
<li>Wong, P. Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+gene+and+male+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">CFTR gene and male fertility.</a> Mol Hum Reprod. 4 (2), 107-110 (1998).</li>
<li>Shum, W. W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial+Projections+from+Basal+Cells+Are+Luminal+Sensors+in+Pseudostratified+Epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transepithelial Projections from Basal Cells Are Luminal Sensors in Pseudostratified Epithelia.</a> Cell. 135 (6), 1108-1117 (2008).</li>
<li>Gao, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+TRPV6+and+TMEM16A+in+epithelial+principal+cells+of+the+rat+epididymis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Coupling of TRPV6 and TMEM16A in epithelial principal cells of the rat epididymis.</a> J Gen Physiol. 148 (2), 161-182 (2016).</li>
<li>Huang, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+Studies+of+Anion+Secretion+in+Cultured+Human+Epididymal+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological Studies of Anion Secretion in Cultured Human Epididymal Cells.</a> J Physiol. 455, 455-469 (1992).</li>
<li>Chan, H. C., Fu, W. O., Chung, Y. W., Chan, P. S. F., Wong, P. Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Atp-Activated+Cation+Conductance+in+Human+Epididymal+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Repro%22%5BJournal%5D)">An Atp-Activated Cation Conductance in Human Epididymal Cells.</a> Biol Repro. 52 (3), 645-652 (1995).</li>
<li>Cheung, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+interaction+underlies+formation+of+fluid+in+the+male+reproductive+tract+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cell-cell interaction underlies formation of fluid in the male reproductive tract of the rat.</a> J Gen Physiol. 125 (5), 443-454 (2005).</li>
<li>Pastor-Soler, N., Pietrement, C., Breton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+acid%2Fbase+transporters+in+the+male+reproductive+tract+and+potential+consequences+of+their+malfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of acid/base transporters in the male reproductive tract and potential consequences of their malfunction.</a> Physiol. 20, 417-428 (2005).</li>
<li>Evans, A. M., Osipenko, O. N., Haworth, S. G., Gurney, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+potentials+and+potassium+currents+during+development+of+pulmonary+artery+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ame+J+Physiol-Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Resting potentials and potassium currents during development of pulmonary artery smooth muscle cells.</a> Ame J Physiol-Heart Circ Physiol. 275 (3), 887-899 (1998).</li>
<li>Golowasch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Capacitance+Measurements+Revisited%3A+Dependence+of+Capacitance+Value+on+Measurement+Method+in+Nonisopotential+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Membrane Capacitance Measurements Revisited: Dependence of Capacitance Value on Measurement Method in Nonisopotential Neurons.</a> J Neurophysiol. 102 (4), 2161-2175 (2009).</li>
<li>Cole, K. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCole%2C+KS+%22Membranes%2C+Ions+and+Impulses.+A+Chapter+of+Classical+Biophysics%22">Membranes, Ions and Impulses. A Chapter of Classical Biophysics</a>. , University of California Press. Berkeley, Calif. (1968).</li>
<li>Lo, C. M., Keese, C. R., Giaever, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impedance+analysis+of+MDCK+cells+measured+by+electric+cell-substrate+impedance+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Impedance analysis of MDCK cells measured by electric cell-substrate impedance sensing.</a> Biophys J. 69, 2800-2807 (1995).</li>
<li>Solsona, C., Innocenti, B., Fernandez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+exocytotic+fusion+by+cell+inflation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Regulation of exocytotic fusion by cell inflation.</a> Biophys J. 74 (2), 1061-1073 (1998).</li>
<li>Robinson, D. W., Cameron, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-dependent+changes+in+input+resistance+of+rat+hypoglossal+motoneurons+associated+with+whole-cell+recording%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Time-dependent changes in input resistance of rat hypoglossal motoneurons associated with whole-cell recording.</a> J Neurophysiol. 83 (5), 3160-3164 (2000).</li>
<li>Sontheimer, H. <a target="_blank" href="https://searchworks.stanford.edu/view/7645417">Neuro Methods: Patch-Clamp Applications and Protocols</a>. Boulton, A. A., Baker, G. B., Walz, W. , Humana Press. New Jersey. (1995).</li>
<li>Cheung, Y. M., Hwang, J. C., Wong, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+membrane+potentials+of+the+epididymis+in+rats+%5Bproceedings%5D%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Epithelial membrane potentials of the epididymis in rats [proceedings].</a> J Physiol. 263 (2), 280(1976).</li>
<li>Lybaert, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KATP+channel+subunits+are+expressed+in+the+epididymal+epithelium+in+several+mammalian+species%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">KATP channel subunits are expressed in the epididymal epithelium in several mammalian species.</a> Biol Reprod. 79 (2), 253-261 (2008).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

בפרוטוקול זה, פיזור אנזימטית של epididymides cauda חולדה בעקביות הניב תאים אפיתל בריאים. איכות התאים אפיתל אפידלימלי עבור ניסויים מהדק תיקון תלוי במספר צעדים קריטיים בפרוטוקול. לדוגמה, צנטריפוגה של תערובת התא על כוח צנטריפוגלי נמוך (30 xg) חשוב להסרת spermatozoa ואת תוכן luminal epididymal; התאים אפיתל אפידלימלי להיות בריא בנוכחות הזרע בתרבות התא. בנוסף, culturing תערובת התא ניתק על צלחת פטרי במשך מספר שעות הוא צעד חשוב על מנת להסיר את fibroblasts ותאי השריר החלקים; התאים שאינם אפ...

אברידימיס בדרכי הרבייה הגברי הוא איבר מרופד בשכבת תאים אפיתל פסיפס. כמו ברקמות אפיתל אחרות, סוגי התאים השונים של האפיתל האפידידימלי, כולל תאים ראשיים, תאים ברורים, תאים ותאי בזל מהמערכות החיסוניות והלימפאטיות, פועלים באופן מתואם כדי לתפקד כמחסום בחזית הצינורית וכמו תאים תומכים עבור התבגרות הזרע ופיזיולוגיה 1 , 2 , 3 . לפיכך, תאים אלה אפיתל לשחק תפקיד חיוני בבריאות הרבייה. תאים אפיתל נחשבים בדרך כלל כמו תאים שאינם נרגשים שאינם מסוגלים לייצר פוטנציאל פעולה כל או לא בתגובה בתגובה גירויים depolarizing, בשל היעדר מתח מגודרת Na + או Ca 2 + ערוצי 4 , 5 . עם זאת, תאים אפיתל להביע UniQue ערכות של תעלות יונים ו מובילים המסדירים תפקידים פיזיולוגיים מיוחדים שלהם, כגון הפרשת תחבורה המזינים 6 . תאים אפיתל שונים ולכן יש תכונות חשמליות אופייניות. לדוגמה, התאים העיקריים להביע את CFTR עבור התחבורה נוזלים כלור ולהביע את TRPV6 עבור סידן reabsorption, ואילו התאים ברורים להביע את המשאבה פרוטון V-ATPase לחומצה לומינלית 1 , 7 , 8 , 9 . כמה מובילים ערוצי יון המווסתים את התכונות הפיזיולוגיות של התאים אפיתל אפידלימלי דווחו, אבל המאפיינים הפונקציונליים של תאים אפיתלתיים אפידרלי הם רובם לא הבנתי עדיין 10 , 11 , 12 , 13 . מהOle-cell-clamp ההקלטה היא טכניקה מבוססת היטב לבחינת התכונות המהותיות של תאים נרגשים ולא נרגשים, והוא מועיל במיוחד עבור לימוד הפונקציות של תאים ניתק בעיקר דגימות הטרוגניות; מתח מהדק משמש למדידת המאפיינים קרום פסיבי וזרמים יוניים של תאים בודדים 14 , 15 . תכונות הממברנה הפסיבית כוללות התנגדות קלט וקיבולת. הפרמטר לשעבר מציין את מוליכות הממברנה המהותית, בעוד שהאחרון מרמז על פני השטח של קרום התא (bilayer phospholipid, שבו נמצאים תעלות יונים ומובילים, המשמש כמבודד דק המפריד בין תאי תאיים ותאיים תאיים). הקיבול של הממברנה הוא פרופורציונלי ישירות על פני השטח של קרום התא. יחד עם התנגדות הממברנה המשתקפת בהתנגדות הקלט, הזמן הקבוע של הממברנה, wHich מציין כמה מהר פוטנציאל קרום התא מגיב לזרימה של זרמי ערוץ יון, ניתן לקבוע. בהקשר זה, על ידי שילוב של מאפייני התגובה הנוכחית מסדרה של צעדים מתח החלים על התאים, הקינטיקה הביופיסיקלית המאפיינים של התאים נקבעים 15 , 16 , 17 , 18 . במאמר הנוכחי, אנו מתארים את ההליכים לבידוד תאים אפיתל מ עכברוש cauda epididimis ואת הצעדים למדידת המאפיינים קרום של סוגי תאים שונים בתערובת התא ניתק באמצעות מהדק תיקון כל כולו. אנו מראים כי התאים העיקריים האפידידימלי התערוכה מאפיינים שונים electrophysiological קרום וכי מוליכות ניתן לזהות בקלות סוגי תאים אחרים.

<table><tbody><tr><td><חזק>מכשיר של מערכת AXON</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מגבר מבוקר מחשב</td><td>התקנים מולקולריים - מגבר</td><td></td><td>Axon Multiclamp 700B Patch-clamp</td></tr><tr><td>מערכת רכישה</td><td>דיגיטלית התקנים מולקולריים -</td> ממיר <td></td>Axon <td>Digidata 1550</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td>BX-61WI</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור</td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-325</td><td></td></tr><tr><td>תא הקלטה ומחמם בשורה</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324C</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר של מערכת HEKA</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Patch מגבר מהדק</td><td>הרווארד ביוסיינס - HEKA</td><td>EPC-10 USB מיקרוסקופ כפול</td><td></td></tr><tr><td></td><td>אולימפוס</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור</td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-325</td><td></td></tr><tr><td>תא הקלטה ומחמם בשורה</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324C</td><td></td></tr><tr><td><חזק>מכשיר אחר</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument&nbsp;</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>תא הקלטה</td><td>וורנר אינסטרומנטס</td><td>RC-26G או תא</td><td></td>תוצרת בית</tr><tr><td>בורוסיליקט זכוכית נימית עם נימה</td><td>מכשיר סאטר / מכשיר הרווארד</td><td>BF150-86-10</td><td></td></tr><tr><td>שולחן בידוד רטט</td><td>TMC&nbsp;</td><td>63544</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת מצלמה דיגיטלית</td><td>HAMAMASTU</td><td>ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU</td><td></td></tr><<tr><td>חזק>ריאגנטים לבידוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 בינוני</td><td>Gibco</td><td>22400089</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Gibca</td><td>15140112</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>30-2005&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>C12440500BT</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז I</td><td>Sigma</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז II</td><td>Sigma</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>5-&alpha;-dihydrotestosterone</td><td>Medchemexpress</td><td>HY-A0120</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td></td><td>גדי FBS-12A</td><td></td></tr><tr><td><תמיסות פנימיות חזקות>מיקרופיפטות (תמיסה מבוססת K+) (pH 7.2, 280-295 mOsm)</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl, 35 מ"מ</td><td>סיגמא/</td><td>V900068</td><td></td>שונות</tr><tr><td>MgCl<תת>2 &middot; 6H2O, 2mM</td><td>Sigma/</td><td>שונים M2393</td><td></td></tr><tr><td>EGTA, 0.1mM</td><td>Sigma/שונים</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 10mM</td><td>Sigma/ V900477</td><td></td><td></td></tr><tr><td>שונים K-גלוקונאט, 100 מ"מ</td><td>סיגמא /</td><td>שונים P-1847</td><td></td></tr><tr><td>מ"ג-ATP, 3 מ"מ</td><td>סיגמא / שונים</td><td>A9187</td><td></td></tr> <tr><td><חזק>תמיסת המלח הפיזיולוגית החיצונית הסטנדרטית (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm)</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl, 140 מ"מ</td><td>סיגמא/שונים</td><td>V900058</td><td></td></tr><tr><td>KCl, 4.7 מ"מ</td><td>סיגמא/V900068</td><td></td><td></td></tr><tr><td>שונים CaCl2, 2.5mM</td><td>Sigma/different</td><td>V900266</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 &middot; 6H2O, 1.2mM</td><td>Sigma/different</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4, 1.2mM</td><td>Sigma/V900060</td><td></td><td></td></tr><tr><td>שונים HEPES, 10mM</td><td>Sigma/V900477 שונים</td><td></td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז, 10 מ"מ</td><td>סיגמא/מגוון</td><td>V900392</td><td></td></tr><tr><td><חזק>להתאמת pH</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>סיגמא</td>/טוהר <td>V900797</td> שונים <td>>=97%</td></tr> <tr><td>KOH</td><td>Sigma/שונים</td><td>60371</td><td>טוהר >=99.99%</td></tr></tbody></table>

כל תא תיקון מהדק הקלטות של תאים אפיתל העיקרי מבודדים מן האברדימיס

Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

האפידידימיס הוא איבר חיוני להבשלת הזרע ולבריאות הרבייה. אפיתל האפידידיום מורכב מסוגי תאים המחוברים בצורה מורכבת, אשר נבדלים לא רק בתכונות מולקולריות ומורפולוגיות אלא גם בתכונות פיזיולוגיות. הבדלים אלה משקפים את הפונקציות המגוונות שלהם, אשר יחד לבסס את microenvironment הצורך לפיתוח זרע שלאחר האשכים ב לומן האפידידימלי. ההבנה של המאפיינים הביופיזיים של תאי האפיתל האפידיאליים היא קריטית לחשיפת התפקודים שלהם בזרע ובבריאות, בתנאים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים. בעוד התכונות הפונקציונליות שלהם עדיין לא הובהר במלואו, תאים epithelial epididymal ניתן ללמוד באמצעות טכניקה טלאי תיקון, כלי למדידת האירועים הסלולר ואת המאפיינים קרום של תאים בודדים. כאן, אנו מתארים את שיטות בידוד התא ואת כל התא תיקון תיקון מהדק ל meaבטוח את המאפיינים החשמליים של תאים אפיתל ניתק העיקרי של עכברוש capid epididymides.

הליך העיכול האנזימי המתואר לבידוד של תאים אפיתל מן epididymides cauda חולדה הוא פרוטוקול שונה מן המחקרים הקודמים שלנו 9 , 12 . שיטה זו מייצרת תערובת של תאים בודדים עם מעל 90% הכדאיות וללא שלפוחיות פני השטח או נפח נפוח התא. תערובת תאים הטרוגנית מורכבת בעיקר של תאים עיקריים, תאים ברורים ותאי הבסיס, כפי שתיארנו בעבר 1 . בפרוטוקול זה, דגימות טהורות יחסית של תאים אפיתלתיי...

אנו מציגים פרוטוקול המשלב בידוד התא ואת כל התא תיקון תיקון מהדק כדי למדוד את המאפיינים החשמליים של תאים אפיתל העיקרי ניתק מן epididymides cauda חולדה. פרוטוקול זה מאפשר חקירה של המאפיינים הפונקציונליים של תאים אפיתלתיים ראשוניים אפידלימלי נוספת להבהיר את התפקיד הפיזיולוגי של האפידידימיס.

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד תאי אפיתל מהאפידידימיס של חולדה ולמדוד את התכונות החשמליות של תאים אלו, שהופרדו באופן ראשוני, באמצעות שיטת whole-cell patch-clamp. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה הרבייתית, כגון תפקודו של האפידידימיס, החשוב לבשלות הזרע ולהורשה של תכונות אב. טכניקה זו מאפשרת למשתמש לאפיין את התכונות החשמליות של תאי אפיתל מבודדים מהאפידידימיס, כך שניתן יהיה להמחיש את התפקוד הפיזיולוגי הבלתי ידוע של תאים אלו.את הפרוצדורה תדגים Bao Li Zhang, סטודנטית לתואר מתקדם מהמעבדה שלי. כדי להתחיל בפרוצדורה, חטא את כלי הניתוח על ידי טבילה ב-70% ethanol. לאחר מכן, הנח להם להתייבש באוויר.בשלב הבא, הכינו את ה-IMDM המלא. לאחר מכן, צרו אליקוטים של 50 ml בתנאים אספטיים, אטמו באמצעות Parafilm ואחסנו בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הכינו תמיסת עיכול אנזימטית קולגנית על ידי המסה של collagenase type I ו-collagenase type II ב-RPMI, כך שריכוז כל סוג של קולגנאז בתמיסה יהיה 1 mg/mL.סננו את התמיסה דרך ממברנה של 0.22 micrometer. לאחר מכן, סמנו אותה כתמיסת collagenase, ושמרו את התמיסה בטמפרטורת החדר עד לשימוש. לאחר מכן, התאימו את נפח תמיסת האנזים בהתאם למשקל האנזים.הנפח המינימלי הנדרש משני זנבות האפדידימיס (cauda epididymides) של חולדה אחת הוא 2 mL. כדי לבצע דיסקציה של זנבות האפדידימיס בחולדה, יש להקריב את בעל החיים באמצעות הזרקת sodium pentobarbital תוך-בטנית (IP) או באמצעות תא isoflurane עד שהחיה אינה מגיבה לגירוי של צביטה בזנב, ולאחר מכן ביצוע פריקה צווארית (cervical dislocation). לאחר מכן, יש לחטא את הבטן התחתונה על ידי ניגוב עם 70% ethanol.דחפו בעדינות את שתי האשכים לכיוון הבטן התחתונה ולאחר מכן פתחו את הבטן התחתונה סמוך לשכין. לאחר מכן, הסירו את השומן מהאפידידימיס (epididymal fat) ובצעו דיסקציה של כל איברי הרבייה. לאחר מכן, העבירו אותם לצלחת עם RPMI.בתחנת עבודה נקייה בעלת זרימת אוויר מבוקרת, נתקו את ה-cauda epididymides מהרקמות החיבוריות והשומניות ומקפסולת האפידידימיס. העבירו אפידידימיס אחד עם 0.2 milliliters של תמיסת קולגנאז למבחנה של 1.5 milliliter. כדי להפריד תאים בודדים מה-cauda epididymides, גזרו את האפידידימיס בתוך תמיסת הקולגנאז באמצעות מספריים עדינים עד שהרקמה תהפוך לנוזל דמוי משחה.לאחר מכן, שטפו בעדינות את המספריים עם שאר תמיסת האנזים שבמבחנה. לאחר מכן, הניחו את המבחנה ב-thermo-mixer מתכתי למשך 30 דקות ב-37 degrees celsius במהירות ניעור של 1, 000 rpm. לאחר מכן, סבבו בצנטריפוגה את תערובת האנזים והרקמה בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות.לאחר מכן, שפכו את העלייה (supernatant) הדביקה המכילה בעיקר את תאי הזרע. לאחר מכן, השעיקו מחדש את המשקע ב-1 mL של IMDM מלא כדי לעצור את כל הפעילות האנזימטית. לאחר מכן, העבירו את ת сусפנזיית התאים לשפופרת של 50 mL המכילה 49 mL של RPMI.סבב את תערובת התאים בצנטריפוגה ושפוך את הנוזל העליון (supernatant). השהה מחדש את המשקע ב-1 mL של IMDM מלא באמצעות טריטורציה עדינה למשך חמש דקות לפחות, כדי להפריד תאים בודדים מתערובת רקמת האפידידימיס שעברה טיפול אנזימטי. הפרד את התאים האפיתליאליים מתאים אחרים בתנאים אספטיים, ושתול את תרחיף התאים בצלחת פטרי בקוטר 10 cm המכילה IMDM מלא למשך שמונה שעות לפחות או למשך הלילה באינקובטור בטמפרטורה של 32 °C.למחרת בבוקר, הכינו את לוחות הכיסוי הסטריליים על ידי טבילה באלכוהול 100%. ייבשו אותם באוויר ולאחר מכן טבלו אותם בכמות קטנה של מצע גידול. לאחר מכן, הניחו את לוחות הכיסוי בצלחות גידול של שישה סנטימטרים או בבארים בודדות של פלטת 24 בארות.כעת, אספו את התאים האפיתליאליים המופרדים על ידי איסוף עדין של תגליל התאים מתוך צלחת הפטרי, המורכב בעיקר מתאים אפיתליאליים. סבבו את תגליל התאים בצנטריפוגה ב-30 ×g בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות, ולאחר מכן שפכו את הנוזל העליון (supernatant). לאחר מכן, השעיו מחדש את משקע התאים בשני milliliters של IMDM מלא.זריעה של 0.2 milliliters של תרחיף התאים שנאסף למרכזו של כל כיסוי זכוכית סטרילי. יש להמתין לפחות 10 דקות עד שהתרחיף ישקע בטיפת הנוזל, כדי לאפשר לתאים להיצמד באופן רופף לכיסויי הזכוכית. לאחר מכן, יש להוסיף בזהירות 1 milliliter של IMDM מלא לקצה של צלחת בנרחב של 6 centimeters, או 0.3 milliliters של IMDM מלא לכל באער בלוח של 24 באערים, ללא הפרעה לתאים.שמרו את התאים הבודדים המבודדים על לבישי זכוכית (cover slips) באינקובטור בטמפרטורה של 32 degrees celsius עד לביצוע ניסויי ה-patch-clamp. ביום ניסוי ה-patch-clamp, הפשיתו מנה אחת (aliquot) של תמיסה תוך-תאית על קרח ושמרו אותה בקירור במהלך הניסוי כדי למנוע התפרקות. לאחר מכן, העבירו את תאי האפיתל המגודלים על לביש הזכוכית לתא ההקלטה המלא ב-PSS סטנדרטי בטמפרטורת החדר.החלף בזהירות את תמיסת ה-PSS באמבט לפחות פעמיים באמצעות פיפט לפני ביצוע ניסויי patch-clamp. כדי לבסס את תצורת ה-whole-cell, טבול את הפיפט אל תוך תמיסת האמבט במהירות המקסימלית של המיקרו-מניפולטור. אתר את קצה הפיפט על המסך המחובר למצלמה הדיגיטלית.לאחר מכן, הפחית את מהירות המיקרו-מניפולטור למצב בינוני-גבוה. בדוק במהירות את ההתנגדות של המיקרו-פיפט באמצעות פקודת ממשק רכישת הנתונים, על ידי הפעלת קפיצת מתח (voltage step) הנוצרת מהמגבר הנשלט במחשב. החלף למיקרו-פיפט חדש אם ההתנגדות חורגת באופן משמעותי מטווח זה.הגדירו את פוטנציאל צומת הנוזלים (liquid junction potential) בין הפפיטה לבין תמיסת האמבט לאפס, באמצעות פקודת ה-pipette offset בממשק השליטה (commander interface) של התוכנה. עקבו אחר ההתנגדות באמצעות מבחן הממברנה (membrane test). אם ההתנגדות גדולה מ-500 megaohms, אך קטנה מ-one gigaohm, השלימו פוטנציאל שלילי כדי לסייע ביצירת ה-gigaseal.במקביל, פצה על זרם הקיבול השרירי (transient capacitive current) של המיקרופיפט. בשלב זה, החל שלב היפר-פולריזציה של 10 millivolt מפוטנציאל החזקה של אפס millivolt לצורך קביעת התנגדות האטם (seal resistance).שנו את מצב המתח למצב זרם אפס ובצעו הקלטה רציפה למשך 10 שניות כדי למדוד את פוטנציאל הממברנה במצב מנוחה של התא. לאחר מכן, חזרו במהירות למצב המתח והישאר בו. החילו את פרוטוקולי המתח בהתאם לניסויים המתוכננים ומדדו את תגובות הזרם.להלן דוגמאות של תאים אפיתליאליים שבודדו מה-cauda epididymides של חולדה לפני ואחרי איסוף חוזר של תרבית לילה בצלחת לפני ניסויי ה-patch-clamp. איור זה מציג זרמי תא שלמים (whole-cell currents) טיפוסיים שהוקלטו מתאים אפיתליאליים בודדים של האפידידימיס באמצעות פרוטוקול עירור בפולסים. הקו המקווקו מציין את רמות הזרם אפס.להלן קשרי המתח והזרם של תגובות הזרם שנמדדו בנקודות הזמן המצוינות. אלו הם רישומי ייצוג של פוטנציאל הממברנה במצב מנוחה של תאי העיקר (principal cells) שעברו דיאליזה עם תמיסת פיפט, עם ATP או ללא ATP. וגרף עמודות זה מראה כי אין הבדל מובהק בין פוטנציאל הממברנה ההתחלתי במצב מנוחה עם ATP לבין זה ללא ATP.המספרים בסוגריים בתוך העמודות מציינים את מספר התאים שנבחנו מלפחות שלושה בעלי חיים. וכאן מוצגים ניתוחי המתאם בין התנגדות האטם (seal resistance) וההתנגדות הקלטית (input resistance) של כל התאים, או של התאים הראשיים (principal cells) בלבד, לעומת פוטנציאלי המנוחה שנמדדו ב-zero current clamp זמן קצר לאחר ביסוס ה-whole-cell, וגודל הזרם שנמדד בשלב ההיפר-פולריזציה ל-100- millivolts מפוטנציאל ההחזקה. ברגע שהטכניקה נלמדת היטב, ניתן לבצעה תוך תשע שעות אם היא מבוצעת כראוי.במהלך ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להפסיק את העיכול האנזימטי באופן מיידי בשלבי בידוד התאים. אחרת, עלול להתרחש עיכול יתר שעלול להוביל לקושי ביצירת אטם ג'יגה-אוהם (gigaohm seal) ולכישלון של ניסויי patch-clamp. כדי לשמור על בריאות התרבית, חשוב לסבב בתסביב את תערובת התאים שעברו דיסוציאציה אנזימטית במהירות נמוכה של 30 G למשך שתיים עד שלוש דקות, ולאחר מכן לשפוך את העלייה (supernatant) הדביקה המכילה בעיקר תאי זרע.בעקבות פרוצדורות אלו, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון דימוי תאים חיים וטכניקות של תרבית תא בודד כדי להשיב על שאלות נוספות, כגון האופן שבו פוטנציאל הממברנה במצב מנוחה בתאי אפיתל נאיביים עשוי לווסת את ההתנהגות החוץ-תאית תחת תנאים מבוקרים. טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה הרבייתית לחקור את התכונות האלקטרופיזיולוגיות של תאי אפיתל של האפידידימיס לצורך ויסות הבשלת הזרע והורשה של תכונות אב נרכשות. לאחר צפייה בסרטון זה, תגמירו עם הבנה טובה לגבי האופן שבו מבודדים תאי אפיתל מאפידידימיס של חולדה וכיצד מודדים את התכונות החשמליות של תאים אלה באמצעות שיטת whole-cell patch-clamp.

whole-cell-patch-clamp-recordings-isolated-primary-epithelial-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

זה נועד כהקדמה תיקון הקלטה מהדק מ ביציות Xenopus laevis. היא משתרעת על הסרת vitelline קרום, היווצרות חותם gigaohm (gigaseal), ואת ההמרה אופציונלי של תיקון כדי טופולוגיה מחוץ הקצוב.

הצמד תיקון הקלטה של ​​תעלות יונים מתבטא ביציות Xenopus

מטרת סרטון זה היא להדגים הליכים לקבלת תאי שיער בריאים, ללא פגע מהאיברים הפנימיים של דג זברת האוזן בוגר ולאחר מכן להשתמש בם ללימודים מהדקים תיקון שנועדו לאפיין את מאפייני biophysical של ערוציהם מתח המגודרים.

הקלטות קלאמפ תיקון בתאי שיער באוזן פנימיים מבודדות מדג הזברה

פרוטוקול זה מתאר טכניקה הנקראת אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי שלם, שהיא שיטה לחקר תכונות חשמליות של נוירוני מאוטנר ותאים רטיקולוספינליים אחרים בעוברים של דגי זברה.

אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי תאי שלם: שיטה לחקר תכונות חשמליות של נוירונים

סרטון זה מדגים את טכניקת מהדק המדבקה למדידת זרמים יוניים בגופי תאי נוירון חושיים באוזן הפנימית. הוא מפרט את ההכנה והשימוש בפיפטת מהדק טלאי מלוטשת מלאה בתמיסה פנימית המכילה אמפוטריצין B, המנקב את הממברנה כדי לאפשר תנועת יונים תוך שמירה על התנאים התוך-תאיים. פולסי מתח מופעלים כדי להפעיל ולתעד את פעילות תעלת היונים, ומספקים תובנות לגבי תכונותיהם והתנהגותם.

הקלטות מהדק טלאי מחורר של גופי תאי עצב חושיים באוזן הפנימית

סרטון זה מדגים את בחינת עוררות תאי העצב התחושתיים בגרעיני השורש הגבי באמצעות טכניקת מהדק טלאי כדי למדוד את בסיס הריאוס ואת פוטנציאל הממברנה, תוך ניתוח תגובות הנוירונים לזריקות זרם מצטבר.

הקלטות מהדק טלאי של תא שלם על גרעיני שורש גבי חולדה שלמים

פיתחנו הכנת מוח השדרה שלמה כבל כדי להקליט ולעקוב אחר פעילות חשמלית באמצעות הקלטת מהדק תיקון מתאי העצב ותאי מאוטנר reticulospinal אחרים בעוברי דג הזברה. לפיכך, אנו מסוגלים להקליט זרמים מעוררים ומעכבים הסינפטי, פעילות ערוץ מתח מגודרת ופוטנציאל פעולה מתא העצב מרכזי בעובר מתפתחת.

תיקון הקלטות קלאמפ מתאים עוברי דג הזברה מאוטנר

שתואר כאן הוא הליך לקבלת משתרע הקלטה הנוכחית ארוך מערוץ יון אחד עם טכניקת התיקון-clamp מצורף תא. שיטה זו מאפשרת להתבוננות, בזמן אמת, את הדפוס של תצורות ערוץ פתוחות קרובים העומדות בבסיס האות הביולוגית. נתונים אלה להודיע ​​על נכסי ערוץ בממברנות ביולוגיות באין מפריע.

הקלטת תיקון מהדק מצורף תא אחד ערוצים

תעלות יונים מתבטאות באפיתל צינורי הכליות לשחק תפקיד משמעותי בפתולוגיה של מחלת כליות פוליציסטיות. כאן אנו מתארים פרוטוקולי ניסוי המשמשים לביצוע מדידות וניתוח רמת סידן תוך תאי תיקון מהדק באפיתל פיברוזיס המבודדים טרי מכליות מכרסמים.

יישום הצמד תיקון והחי מיקרוסקופ פלואורסצנטי לפקח על מאפיינים פונקציונליים של מבודד טרי PKD האפיתל

מאמר זה מתאר כיצד נקבעת סלקטיביות היונים של channelrhodopsin באמצעות רישומים אלקטרופיזיולוגיים של Patch-Clamp של תאים שלמים באמצעות תאי HEK293. כאן, מודגם ההליך הניסיוני לחקירת סלקטיביות כלוריד של תעלה רודופסין סלקטיבי של אניונים. עם זאת, ההליך ניתן להעברה לתעלות רודופסינים אחרים בעלי סלקטיביות מובחנת.

תא שלם תיקון מהדק הקלטות עבור קביעת electrophysiological של יון סלקטיביות ב Channelrhodopsins

תאים Enterochromaffin (EC) מהווים תת קבוצה קטנה של מערכת העיכול תאים אפיתל. תאים EC חשמלית טמפרמנט, לשחרר סרוטונין, אך קשיים culturing זיהוי תאים EC מוגבלת מחקרים פיזיולוגיים. השיטה המוצגת כאן יוצר מודל תרבות ראשי לבצע בדיקה של תאים בודדים EC מאת אלקטרופיזיולוגיה.

אלקטרופיזיולוגיה התא כולו של ראשי Enterochromaffin מאתר בתרבית תאים

פרוטוקול זה מתאר שיטה מהירה ויעילה לבידוד תאי שריר חלק מהעורק הבסיסי של החולדה ורישום זרמי תעלת אשלגן מיישרים פנימה בתאים אלה באמצעות טכניקת מהדק תיקון של תא שלם. הוא מציע גישה חדשה לחוקרים החוקרים את העורק הבסיסי ותעלות היונים.

רישום זרמי K+ מיישרים פנימה בתאי שריר חלק של העורקים הבסיסיים המבודדים הטריים בטכניקת Patch Clamp

למדו את שיטת תיקון המהדק השלם לבידוד תאים אפיתליים מאפידידימיס העכברוש ומדידת תכונות חשמליות. שיטה זו חיונית להבנת תפקידיהם הפיזיולוגיים בבגרות הזרע.

כל תא תיקון מהדק הקלטות של תאים אפיתל העיקרי מבודדים מן האברדימיס

גלה סרטונים נוספים