כל תא תיקון מהדק הקלטות של תאים אפיתל העיקרי מבודדים מן האברדימיס

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד תאי אפיתל מהאפידידימיס של החולדה ולמדוד את התכונות החשמליות על תאים מנותקים אלה בעיקר בשיטת מהדק תיקון של תאים שלמים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הרבייה, כגון תפקוד האפידידימיס, החשוב להבשלת הזרע ולתורשה של תכונות אבהיות. טכניקה זו מאפשרת למשתמש לצרוב את התכונות החשמליות של תאי אפיתל אפידידימליים מבודדים כך שניתן יהיה להמחיש תפקוד פיזיולוגי לא ידוע של תאים אלה.

מי שתדגים את ההליך תהיה באו לי ג'אנג, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי להתחיל בהליך, יש לחטא את כלי החיתוך על ידי טבילה באתנול 70%. לאחר מכן, תנו להם להתייבש באוויר.

לאחר מכן, הכינו את ה-IMDM המלא. לאחר מכן, צור 50 מ"ל אליקוט בתנאים אספטיים, אטום עם Parafilm ואחסן בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הכינו תמיסת עיכול אנזימים קולגניים על ידי המסת קולגנאז מסוג I וקולגנאז מסוג II ב-RPMI, וכתוצאה מכך מיליגרם אחד למיליליטר מכל קולגנאז בתמיסה.

מסננים את התמיסה דרך קרום של 0.22 מיקרומטר. לאחר מכן, סמנו אותו כתמיסת קולגנאז, ושמרו את התמיסה בטמפרטורת החדר עד לשימוש. לאחר מכן, התאם את נפח תמיסת האנזים על סמך משקל האנזים.

הנפח המינימלי הנדרש לשני האפידידימידים של הזנב מחולדה בודדת הוא שני מיליליטר. כדי לנתח את החולדה cauda epididymides, הקריבו את החיה על ידי שימוש בנתרן פנטוברביטל באמצעות הזרקת IP או באמצעות תא איזופלורן עד שהחיה אינה מגיבה לגירוי צביטת הזנב, ואחריו נקע צוואר הרחם. לאחר מכן, יש לחטא את הבטן התחתונה על ידי ניגובה באתנול 70%.

דחף בעדינות את שני האשכים כלפי מטה אל הבטן התחתונה ולאחר מכן פתח את הבטן התחתונה ליד שק האשכים. לאחר מכן, הסר את השומן האפידידימלי ונתח את כל איברי הרבייה. לאחר מכן, העבירו אותם לצלחת בעזרת RPMI.

בתחנת עבודה נקייה ומבוקרת זרימת אוויר, נתחו את הזנב אפידידימידים מרקמות החיבור והשומן והקפסולה האפידידימלית. מניחים אפידידימיס אחד עם 0.2 מיליליטר תמיסת קולגנאז בצינור של 1.5 מיליליטר. כדי לנתק תאים בודדים מהזנב אפידידימידים, חותכים את האפידידימידים בתמיסת הקולגנאז בעזרת מספריים עדינים עד שהרקמה הופכת לנוזל דמוי משחה.

לאחר מכן, שטפו את המספריים בעדינות עם שאר תמיסת האנזים בצינור. לאחר מכן, הנח את הצינור על מערבל תרמו מתכתי למשך 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס במהירות טלטול של 1,000 סל"ד. לאחר מכן, צנטריפוגה את תערובת רקמת האנזים בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות.

לאחר מכן, שפכו את הסופרנטנט הדביק המכיל בעיקר את הזרע. לאחר מכן, השעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של IMDM מלא כדי להרוות את כל הפעילות האנזימטית. לאחר מכן, העבירו את מתלה התאים לצינור של 50 מיליליטר המכיל 49 מיליליטר RPMI.

צנטריפוגה את תערובת התאים ושפכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של IMDM מלא עם טריטורציה עדינה למשך חמש דקות לפחות כדי לנתק תאים בודדים מתערובת הרקמה האפידידימלית המטופלת אנזימטית. הפרד את תאי האפיתל מתאים אחרים בתנאים אספטיים, ותרבית את תרחיף התא על צלחת פטרי בגודל 10 סנטימטר המכילה IMDM מלא למשך שמונה שעות לפחות או לילה באינקובטור בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס.

למחרת בבוקר, הכינו את החלקות הכיסוי הסטריליות על ידי טבילה באלכוהול 100%. יבש באוויר ואז טבל אותם בכמות קטנה של מדיום תרבות. לאחר מכן, הניחו את החלקות הכיסוי בכלי תרבות של שישה סנטימטרים או בבארות בודדות של צלחת של 24 בארות.

כעת, קצרו את תאי האפיתל המנותקים על ידי איסוף עדין של תרחיף התאים מצלחת הפטרי המורכבת בעיקר מתאי אפיתל. צנטריפוגה את תרחיף התא בטמפרטורה של 30 פעמים G בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות, ולאחר מכן שפכו את הסופרנטנט. לאחר מכן, השעו מחדש את גלולת התא בשני מיליליטר של IMDM מלא.

זרע 0.2 מיליליטר מתרחיף התאים שנקטף על מרכז כל החלקת כיסוי סטרילית. הניחו לתרחיף התאים להתיישב בטיפת הנוזל למשך 10 דקות לפחות כדי לאפשר לתאים להיצמד באופן רופף להחלקות כיסוי הזכוכית. לאחר מכן, הוסף בזהירות מיליליטר אחד של IMDM מלא בקצה צלחת של שישה סנטימטרים או 0.3 מיליליטר של IMDM מלא לכל באר של צלחת של 24 בארות, מבלי להפריע לתאים.

שמור את התאים הבודדים המבודדים על החלקות הכיסוי באינקובטור בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס עד לניסויי מהדק התיקון. ביום ניסוי ה-patch-clamp, הפשירו מנה אחת של תמיסה תוך-תאית על קרח ושמרו אותה מקוררת במהלך ניסוי ה-patch-clamp כדי למנוע פירוק. לאחר מכן, העבירו את תאי האפיתל המתורבתים על תלוש כיסוי הזכוכית לתא ההקלטה המלא ב-PSS סטנדרטי בטמפרטורת החדר.

החלף בזהירות את ה-PSS לרחצה לפחות פעמיים באמצעות פיפטה לפני כל ניסוי מהדק טלאי. כדי לבסס את תצורת התא השלם, טבלו את הפיפטה בתמיסת האמבטיה במהירות הגבוהה ביותר של המיקרומניפולטור. מצא את קצה הפיפטה על המסך המחובר למצלמה הדיגיטלית.

לאחר מכן, האט את מהירות המיקרומניפולטור למצב בינוני-גבוה. בדוק במהירות את התנגדות המיקרופיפטה באמצעות פקודת ממשק רכישת הנתונים על ידי הפעלת שלב מתח שנוצר מהמגבר הנשלט על ידי המחשב. החלף למיקרופיפטה חדשה אם ההתנגדות חורגת משמעותית מטווח זה.

והגדר את פוטנציאל צומת הנוזל בין הפיפטה לתמיסת האמבטיה לאפס באמצעות פקודת היסט הפיפטה בממשק המפקד של התוכנה. עקוב אחר ההתנגדות באמצעות בדיקת הממברנה. אם ההתנגדות גדולה מ-500 מגה-אוהם, אך קטנה מג'יגה-אוהם אחד, הפעל פוטנציאל שלילי כדי לסייע ביצירת הג'יגה-סיל.

בינתיים, פיצו את הזרם הקיבולי החולף של המיקרופיפטה. ברגע זה, החל צעד היפר-פולריזציה של 10 מילי-וולט מפוטנציאל החזקה של אפס מילי-וולט לקביעת התנגדות האיטום. מיד לאחר השגת תצורת תא שלם מוצלחת, החל צעד היפרפולריזציה של 10 מילי-וולט מפוטנציאל החזקה של 60 מילי-וולט שלילי.

העבר את מצב המתח למצב זרם אפס ובצע הקלטה ללא פער של 10 שניות כדי למדוד את פוטנציאל הממברנה במנוחה של התא. לאחר מכן, חזור במהירות למצב המתח והישאר בו. ליישם את פרוטוקולי המתח בהתאם לניסויים המתוכננים ולמדוד את תגובות הזרם.

להלן הדוגמאות לתאי האפיתל שבודדו מאפידידימידים של זנב החולדה לפני ואחרי קציר חוזר של תרבית לילה על הצלחת לפני ניסויי מהדק הטלאי. איור זה מציג את הזרמים האופייניים של תאים שלמים שנרשמו מתאי אפיתל אפידידימליים בודדים באמצעות פרוטוקול מעורר דופק. הקו המקווקו ציין את רמות הזרם האפס.

להלן יחס המתח הנוכחי של תגובות הזרם הנמדדות בנקודות הזמן שצוינו. אלה הם המעקב המייצג של פוטנציאל הממברנה במנוחה של התאים העיקריים שעברו דיאליזה עם תמיסת פיפטה, עם ATP או ללא ATP. וגרף עמודות זה אינו מראה הבדל משמעותי בין פוטנציאל הממברנה הראשונית במנוחה של פלוס ATP למינוס ATP.

המספרים בסוגריים בתוך העמודות מציינים את מספר התאים שנבדקו משלושה בעלי חיים לפחות. והנה ניתוחי המתאם של התנגדות האיטום והתנגדות הכניסה של כל התאים, או התאים העיקריים בלבד לעומת פוטנציאל המנוחה שנמדדו במהדק זרם האפס זמן קצר לאחר הקמת התא כולו ועוצמות הזרם שנמדדו בשלב ההיפרפולריזציה ל-100 מילי-וולט שלילי מפוטנציאל ההחזקה. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך תשע שעות אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להפסיק את העיכול האנזימטי מיד במהלך שלבי בידוד התאים. אחרת, עלול להתרחש עיכול יתר שעלול להוביל להיווצרות קשה של חותם ג'יגה-אוהם ולכישלון ניסויי מהדק טלאי. כדי לשמור על בריאות התרבית, חשוב לסובב את תערובת התאים המנותקים אנזימטית במהירות נמוכה של 30 גרם למשך שתיים-שלוש דקות, ולאחר מכן לשפוך את הסופרנטנט הדביק המכיל בעיקר תאי זרע.

בעקבות הליכים אלה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון הדמיית תאים חיים וטכניקות תרבית תא אחד על מנת לענות על שאלות נוספות, כגון פוטנציאל הממברנה במנוחה בתאי אפיתל נאיביים עשוי לווסת את ההתנהגות החוץ-תאית בתנאים מבוקרים. טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של הרבייה לחקור את התכונות האלקטרופיזיולוגיות של תאי אפיתל של אפידידימיס לוויסות הבשלת הזרע ותורשת התכונות הנרכשות של האב. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד תאי אפיתל מאפידידימיס של חולדה וכיצד למדוד את התכונות החשמליות על תאים אלה באמצעות שיטת תיקון-מהדק של תא שלם.