Neonatal Murine Cochlear Explant טכניקה כמו
8 ביוני 2017
המטרה של פרוטוקול זה היא להדגים את הכנה, תרבות, טיפול, immunostaining של explants מון neonatal cochlear. הטכניקה יכולה להיות מנוצל כמו כלי בדיקה במבחנה במחקרי שמיעה.
המטרה הכללית של הליך זה היא הכנה, גידול, טיפול וצביעה אימונוהיסטוכימית של תרביות רקמה (explants) של שבלול האוזן מעכבריו של גור חולדה ניונוטלי, לשימוש ככלי סינון in vitro במחקר שמיעה. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום מחקר השמיעה, כגון אפשרות למחקר סימולטני של תאי שיער בשבלול, סינפסות, נוריטים ונוירונים במודל ex vivo, וכן אספקת תובנות לגבי מנגנוני פעולה של מולקולות חדשות בשבלול, כולל גורמים הנמצאים בהפרשות אנושיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת להאיץ את תהליך הסינון של תרכובות טיפוליות מועמדות לפני בדיקתן in vivo.
התחילו עם ראש שלושייה שנאסף לאחרונה ושמור בתוך אתנול 70% במכסה של פטרי. השתמשו בלהב סקאלפל כדי לבצע חתך שטחי בעור מקצה הגולגולת הקדמי לקצה האחורי. לאחר מכן, חתכו את שני התעלות השמיעתיות החיצוניות וקפלו את העור קדימה כדי לחשוף את כל הגולגולת.
בשלב הבא, פתחו את הגולגולית לאורך התפר הסגיטלי (sagittal suture) על ידי הזזת להב הסכינור בעדינות למעלה ולמטה, מקדמה לאחור, כדי למנוע דחיסה של השבלול (cochlea). הסירו והשליכו את האף על ידי ביצוע חתך אנכי ישירות מאחורי המחשוליות (orbits). החלק האחורי של הגולגולת אמור להכיל עדיין את המוח ואת השבלול.
לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי לבצע דיסקציה קהה ולהסיר את המוח הקדמי, הדגיליה וגזע המוח. הניחו את שני חצאי הגולגולת בתוך צלחת פטרי פלסטית בנפח 60 מילימטר מלאה ב-HBSS קר. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי לחשוף לחלוטין את השבלול, הנמצא סמוך לעורק הסטפדיאלי שמסביבו, והפרידו בעדינות את האיבר מעצם הרקה.
העבירו את השבלול (cochlea) אל צלחת פטרי בעלת תחתית זכוכית ושקיפות בקוטר 50 מילימטר המכילה HBSS, והניחו את הצלחת תחת המיקרוסקופ. הניחו את צלחת הפטרי מפלסטיק בקוטר 60 מילימטר עם החצי השני של הגולגולת על קרח. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי לנתח בזהירות את הקפסולה האוטיקה של השבלול.
כעת, השתמשו בסכין מיקרוסקופית או בשני פינצטות 55 כדי להפריד בזהירות את הרצועה הספיראלית (spiral ligament) הדבוקה לאיבר קורטי (organ of Corti) משאר השבלול (cochlea) ומה-medialis. ניתן לעשות זאת על ידי תפיסת הרצועה הספיראלית בחלק הבסאלי ביותר ופיתולה העדין תוך כדי תנועה לכיוון האפקס. לאחר הסרת הרצועה הספיראלית, מקמו את הדגימה כדי לקבל מבט סגיטלי אורך של השבלול.
לאחר מכן, חתכו את השבלול (cochlea) לשניים או שלושה חלקים באמצעות סכין מיקרו, וסווגו חלקים אלו כסיבובים האפקליים (apical) והבזאליים (basal). הסירו את הרקמה שמעל לחלק האפקלי יותר ואת הרקמה שמתחת לחלק הבזאלי יותר, עד לשכבה הממשי של תאי השערה והנוריטים, כדי לאפשר לשתול השבלול להשכיב בצורה אופקית על פטריית המעבדה. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי לתפוס בעדינות ולקלף את קרומי הטקטוריה (tectorial membrane), שכבה שקופה ודקה מאוד הנמצאת מיד מעל לאיבר קורטי (organ of Corti).
השלב המאתגר ביותר מבחינה טכנית הוא ככל הנראה הסרת קרומי התקרה (tectorial membrane) הדקים והשקופים, שכן ניתן לפגוע בקלות בתאי השערה הנמצאים תחתיהם. על ידי התחלה מהקצוות של הרקמה, תאי השערה לאורך כל השבב (explant) נשמרים, למעט בקצה המדויק שבו החלה קילוף קרומי התקרה. לבסוף, הסר את קרומי רייסנר (Reissner's membrane) הנמצאים מיד מעל לנוירונים של הגנגליון השבלולי, על ידי נגיעה בהם עם פינצטה משני הצדדים וקילופם.
דגימת השבלול מוכנה כעת לתרבית לאחר הסרת אזורים פגומים בקצוות. התחילו את הליך התרבית על ידי הרטבת קצה של פפית של 1 ml עם כ-120 µL של DMEM, כדי למנוע מהשתל להידבק לדופן הפנימית של הקצה. לאחר מכן, השתמשו בקצה שהורטב כדי לשאוב מקסימום 70 µL מתוך פטריית הזכוכית והניחו את הדגימה יחד עם הנוזל באחד מארבעת השקעים בפטריה בעלת ארבעה בארות.
בדקו תחת המיקרוסקופ שהשתל נמצא באוריינטציה הנכונה. ודאו שאזור תאי השערה ממנו הוסרה ממбраנת הטקטוריה (tectorial membrane) פונה כלפי מעלה, ושהממברנה הבסילרית (basilar membrane) יחד עם החלק הבסאלי הגזוז של המדיאליס פונים כלפי מטה ונצמדים לתוספת של זכוכית הכיסוי.
לאחר שהאקספלנט מונח בכיוון הנכון, שאבו את ה-HBSS העודף והמתינו 15 שניות. כעת, העבירו בפיפטה 60 µL של מצע גידול חם ישירות על הדגימה, תוך הקפדה לא לגעת בדגימה עם הפיפטה. החזירו את המכסים של פטרי פטרי הפנימית והחיצונית והדגרירו למשך הלילה בטמפרטורה של 37 °C.
ביום למחרת, העבירו את צלחות הפטרי הכוללות את השתלי השבלול (cochlear explant) מהאינקובטור למכסה זרימה למינרית. שאבו את מצע התרבית הישן שאינו מכיל FBS מההשכבה הפנימית. הוסיפו 60 µL למסגרת של מצע טיפול מחומם שהוכן מראש.
החזירו את צלחת הפטרי למדגרה עד לצביעת התרביות, למשך מקסימום שבעה ימים. כפי שניתן לראות בתמונה קונפוקלית זו, טכניקה זו משמרת את האנטומיה של כל סיבוב השבלול, כולל נוירוני הגנגליון הספירלי או SGNs, ובכך מאפשרת ניתוח של השפעות הטיפול עלהנוריטים והסומות של SGNs, בנוסף לאיבר קורטי. כפי שרואים כאן, ניתן להשתמש באקספלנטים אלו כדי להשוות בו-זמנית את השפעת הטיפול על הסיבובים האפיקליים והבזאליים לאחר צביעה אימונופלורסצנטית.
תאי שיער מוצגים בירוק ומבנים נוירונליים מופיעים באדום. ניתן להעריך סינפסות שלמות על ידי סימון חלבונים פרה-סינפטיים המוצגים באדום וחלבונים פוסט-סינפטיים המוצגים בירוק, יחד עם צביעה של מבנים נוירונליים בכחול. איור זה מציג תמונות מייצגות של השתלה (explants) של שבלול מהאזור האפיקלי והבזאלי לאחר שבעה ימים בתרבית עם 3%FBS משמאל או 1%FBS מימין.
תאים שגודלו ב-3%FBS מתחילים לנדוד בין היום הרביעי לחמישי, כפי שמוצג על ידי החצים האפורים בהיר עבור תאי שערה והחצים האדומים עבור נוריטים. השתלים ב-1%FBS שומרים על שלמות ארגונית עד היום השביעי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לוודא חזותית את השלמות המבנית ואת הכיוון של רקמת השבלול לפני הוספת מדיום התרבית הסופי והחומרים הרלוונטיים.
לאחר ביצוע הליך זה, ניתן לבצע שחזור תלת-ממדי כדי לאשר לוקליזציה ספציפית לסוג התא של תאים המבטאים GFP בתוך ה-medialis.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מדגים את ההכנה, התרבית, הטיפול והצביעה האימונוהיסטוכימית של תרביות רקמה (explants) של שבלול האוזן מעכבריו של יומות. הוא משמש ככלי סריקה in vitro במחקר השמיעה, ומאפשר את חקר המבנים והמנגנונים של השבלול.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- חקר השמיעה
- טכניקות לתרבית תאים
רקע
- שתלים של שבלול עכבר מרכיבים ניאונטליים הם בעלי ערך רב לחקר תאי שיער בשבלול ומבנים עצביים.
- שיטה זו מאפשרת ניתוח סימולטני של רכיבים שונים בשבלול.
- היא מספקת תובנות לגבי ההשפעות של תרכובות טיפוליות על האנטומיה של השבלול.
- הטכניקה מאיצה את הסריקה של תרכובות מועמדות לפני בדיקה in vivo.
מטרת המחקר
- להכין ולגדל תרביות של ששבובים (explants) מהשבלול לצורך מחקר שמיעה.
- לחקור את השפעותיהם של טיפולים על מבני השבלול.
- להעמיק את ההבנה של מנגנוני השבלול ושל טיפולים פוטנציאליים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דיסקציה של שבלול אוזן מעכבריו של י新生 (neonatal) מהגולגולת.
- תרבית של השתלות (explants) מהשבלול בסביבה מבוקרת.
- צביעה אימונוהיסטוכימית להדמיית מבני השבלול.
- ניתוח מיקרוסקופי של ההשתלות המטופלות.
תוצאות עיקריות
- הכנה מוצלחת של תרביות (explants) של השבלול לצורך גידול במעבדה.
- שימור האנטומיה של השבלול, כולל תאי שיער ונוירונים.
- יכולת להעריך את השפעות הטיפול על מבני השבלול.
- הדגמה של נדידה תאית בתגובה לטיפול.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה מהימנה לחקר הביולוגיה של השבלול (cochlea).
- הוא מקל על בחינת התערבויות טיפוליות במקרים של אובדן שמיעה.
- מחקרים עתידיים יוכלו להתבסס על טכניקה זו כדי לשפר את המחקר בתחום השמיעה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
טכניקה זו מספקת מודל ex vivo רלוונטי פיזיולוגית להערכה של תרכובות טיפוליות מועמדות המכוונות למבנים של השבלול (cochlea), ובכך היא מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית מוקדמת בתהליך גילוי תרופות לאובדן שמיעה. על ידי שימור הארכיטקטורה המאורגנת של האוזן הפנימית, הכוללת תאי שיער, סינפסים, נוריטים ונוירונים של הגנגליון הספירלי, היא תומכת בביטחון ניבוי במחקרי תיקוף מטרות ומודולציה של מסלולים. השיטה מאיצה את לוחות הזמנים של הסריקה הפרה-קלינית על ידי התרה של השוואה סימולטנית בין תגובות בחלק העליון (apical) ובחלק הבסיסי (basal) של השבלול לפני בדיקות in vivo.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות בתאי שיער של השבלול, בסינפסים ובמבנים נוירונליים בהקשר של רקמה שלמה.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי שימור אינטראקציות תאיות טבעיות ולוקליזציה סוב-צלולית.
- ערך ניבוי: מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים באמצעות תצפית ישירה על השפעות התרכובת על צמיחת נוריטים ועל שלמות תאי השיער.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצר תרביות אקספלאנטים סטנדרטיות וניתנות לשחזור, המתאימות לסריקת תרכובות ולניתוח תגובה למינון.
- פלט כמותי: מאפשר כימות של הישרדות תאי שערה, צפיפות נוריטים וקו-לוקליזציה של חלבונים סינפטיים על בסיס צביעה אימונוהיסטוכימית.
- יכולת הרחבה: מאפשר השוואה מקבילה של סיבובי השבלול האפיקליים והבזאליים תחת תנאי טיפול משתנים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה את הפתופיזיולוגיה של אובדן שמיעה סנסורי-עצבי על ידי שמירה על חיוניות של תאי שיער מכנו-סנסוריים ואוכלוסיות נוירונליות.
- רצף תרגומי: מגשר בין שלבי הגילוי לשלבים הפרה-קליניים על ידי מתן אפשרות להערכת תרכובות שנמצאו בהפרשות אנושיות או בנוזלים ביולוגיים אחרים.
- קידום מותאם סיכון: מספק בסיס להחלטות של המשך או הפסקת התהליך (go/no-go) באמצעות מדדים מבניים ותפקודיים לבריאות השתל החלזוני (cochlear explant).
שילוב תהליכי עבודה ושרשראות עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף שבין שלב הגילוי לשלב הפרה-קליני, ותומכת במחקרי מעורבות מטרה (target engagement) בשלבים מוקדמים ובפיתוח בדיקות עבור תרופות לטיפול באובדן שמיעה.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת היפותזות על סוגי תאים בשבלול ונתיבים מולקולריים המעורבים בתפקוד השמיעה.
- סינון (Screening): מספקת נתיחים (explants) מוכנים לבדיקה עם אוריינטציה עקבית ושלמות מבנית להערכה מהימנה של תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת קריאות מרובות-ערוצים (multiplexed) באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית לתאי שיער (ירוק), מבנים עצביים (אדום) וסממנים סינפטיים.
- מחקר תרגומי: תומכת בהערכה של גורמים אנדוגניים ומועמדים טיפוליים במודל רלוונטי התפתחותית.
- שימוש חוזר ארגוני: מקריבה פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר לצורך סינון איטרטיבי של ספריות תרכובות מגוונות לאורך פרויקטים מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון במטרה על ידי שימור הcytoarchitecture המקורית של השבלול ומאפשר רזולוציה סוב-סלולרית של השפעות הטיפול.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של דיסקציה, תרבית וצביעה.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי הפחתת נשירה באמצעות זיהוי מוקדם של תרכובות לא יעילות או רעילות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מבוסס נתונים של מועמדים על בסיס פרופילי תגובה של explant של השבלול.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בדיסקציה מיקרו-כירורגית וטיפול ברקמות כדי לשמר את מבני השבלול העדינים.
- תלוי בגישה למיקרוסקופיה קונפוקלית ולתשתית לצביעה אימונוהיסטוכימית עבור אנליזה מרובת רכיבים (multiplexed analysis).
- מצריך פרוטוקולי התמצאות סטנדרטיים כדי להבטיח פולריות אפקלית-בזאלית עקבית בין הניסויים.
- כולל אופטימיזציה של משך התרבית ותנאי הסרום, בהתבסס על יציבות התרכובת ולוח הזמנים הפנוטיפי הצפוי.
- מוגבל על ידי זמינות הרקמה וחלון החיוניות, דבר המחייב תכנון ניסיוני מתוזמן.
