Name: Neonatal Murine Cochlear Explant טכניקה כמו במבחנה כלי הקרנה במחקר שמיעה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: למד הכנה וגידול של אקספלנטים קוכליאריים מעכברים נאונטליים לחקר שמיעה. שיטה זו מאפשרת בחינת תאי שיער, סינפסות ונוירונים במודל אקס vivo לסינון תרופות פוטנציאליות לפני בדיקה בחי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי של חירשות הפרעות תקשורת אחרות מעניקה R01DC015824 (KMS) ו T32DC00038 (תמיכה SD), משרד ההגנה מענק W81XWH-15-1-0472 (KMS), קרן ברטרלי (KMS), Nancy Sayles Day Foundation (KMS) ומרכז המחקר לאואר טיניטוס (KMS). אנו מודים לג &#39;סיקה E. Sagers, BA עבור הערות תובנה על כתב היד.

<ol><li>Mathers, C., Smith, A., Concha, M. Global burden of hearing loss in the year. World Health Organization (WHO). , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/healthinfo/statistics/bod_hearingloss.pdf">http://www.who.int/healthinfo/statistics/bod_hearingloss.pdf</a> (2000).</li>
<li>Geleoc, G. S., Holt, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sound+strategies+for+hearing+restoration%29%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sound strategies for hearing restoration).</a> Science. 344 (6184), 1241062(2014).</li>
<li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+age-related+hearing+loss+by+early+noise+exposure%3A+evidence+of+a+misspent+youth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth.</a> J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).</li>
<li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adding+insult+to+injury%3A+cochlear+nerve+degeneration+after+%26%2334%3Btemporary%26%2334%3B+noise-induced+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after &#34;temporary&#34; noise-induced hearing loss.</a> J Neurosci. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li>
<li>Makary, C. A., Shin, J., Kujawa, S. G., Liberman, M. C., Merchant, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+primary+cochlear+neuronal+degeneration+in+human+temporal+bones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Age-related primary cochlear neuronal degeneration in human temporal bones.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 12 (6), 711-717 (2011).</li>
<li>Jensen, J. B., Lysaght, A. C., Liberman, M. C., Qvortrup, K., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immediate+and+delayed+cochlear+neuropathy+after+noise+exposure+in+pubescent+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Immediate and delayed cochlear neuropathy after noise exposure in pubescent mice.</a> PLoS One. 10 (5), (2015).</li>
<li>Landegger, L. D., Psaltis, D., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+audiometric+thresholds+do+not+predict+specific+cellular+damage+in+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Human audiometric thresholds do not predict specific cellular damage in the inner ear.</a> Hear Res. , 83-93 (2016).</li>
<li>Wang, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+Activity+of+Cochlear+Hair+Cells+Triggered+by+Fluid+Secretion+Mechanism+in+Adjacent+Support+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spontaneous Activity of Cochlear Hair Cells Triggered by Fluid Secretion Mechanism in Adjacent Support Cells.</a> Cell. 163 (6), 1348-1359 (2015).</li>
<li>Barclay, M., Ryan, A. F., Housley, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+vs+type+II+spiral+ganglion+neurons+exhibit+differential+survival+and+neuritogenesis+during+cochlear+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Type I vs type II spiral ganglion neurons exhibit differential survival and neuritogenesis during cochlear development.</a> Neural Dev. 6, (2011).</li>
<li>Dinh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+interfering+RNA+against+Bax+attenuates+TNFalpha-induced+ototoxicity+in+rat+organ+of+Corti+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Short interfering RNA against Bax attenuates TNFalpha-induced ototoxicity in rat organ of Corti explants.</a> Otolaryngol Head Neck Surg. 148 (5), 834-840 (2013).</li>
<li>Mazurek, B., Yu, Y., Haupt, H., Szczepek, A. J., Olze, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salicylate+modulates+Hsp70+expression+in+the+explanted+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Salicylate modulates Hsp70 expression in the explanted organ of Corti.</a> Neurosci Lett. 501 (2), 67-71 (2011).</li>
<li>Kao, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+osteoprotegerin+expression+in+the+inner+ear+causes+degeneration+of+the+cochlear+nerve+and+sensorineural+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Loss of osteoprotegerin expression in the inner ear causes degeneration of the cochlear nerve and sensorineural hearing loss.</a> Neurobiol Dis. 56, 25-33 (2013).</li>
<li>Jan, T. A., Chai, R., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+LacZ-expressing+cells+from+mouse+inner+ear+tissues+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolating LacZ-expressing cells from mouse inner ear tissues using flow cytometry.</a> J Vis Exp. (58), e3432(2011).</li>
<li>Haque, K. D., Pandey, A. K., Kelley, M. W., Puligilla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+embryonic+mouse+cochlear+explants+and+gene+transfer+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Culture of embryonic mouse cochlear explants and gene transfer by electroporation.</a> J Vis Exp. (95), e52260(2015).</li>
<li>Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+and+plasmid+electroporation+of+the+murine+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti.</a> J Vis Exp. (36), (2010).</li>
<li>Mulvaney, J. F., Dabdoub, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+time+lapse+imaging+of+mouse+cochlear+explants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants.</a> J Vis Exp. (93), e52101(2014).</li>
<li>Wang, Q., Green, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+neurotrophin-3+in+synapse+regeneration+by+spiral+ganglion+neurons+on+inner+hair+cells+after+excitotoxic+trauma+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional role of neurotrophin-3 in synapse regeneration by spiral ganglion neurons on inner hair cells after excitotoxic trauma in vitro.</a> J Neurosci. 31 (21), 7938-7949 (2011).</li>
<li>Landegger, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+AAV+vector+enables+safe+and+efficient+gene+transfer+to+the+mammalian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear.</a> Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).</li>
<li>Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+Factors+from+Human+Vestibular+Schwannomas+Can+Cause+Cochlear+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage.</a> Sci Rep. 5, 18599(2015).</li>
<li>Soares, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+derived+from+human+vestibular+schwannomas+associated+with+poor+hearing+damage+cochlear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells.</a> Neuro Oncol. , (2016).</li>
<li>Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerated+synapses+between+postnatal+hair+cells+and+auditory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 14 (3), 321-329 (2013).</li>
<li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ouabain-induced+cochlear+nerve+degeneration%3A+synaptic+loss+and+plasticity+in+a+mouse+model+of+auditory+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Ouabain-induced cochlear nerve degeneration: synaptic loss and plasticity in a mouse model of auditory neuropathy.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 15 (1), 31-43 (2014).</li>
<li>Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+after+noise+exposure%3A+acceleration+of+cochlear+synaptopathy+in+%26%2334%3Brecovered%26%2334%3B+ears%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in &#34;recovered&#34; ears.</a> J Neurosci. 35 (19), 7509-7520 (2015).</li>
<li>Barclay, M., Constable, R., James, N. R., Thorne, P. R., Montgomery, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+sensory+stimulation+alters+the+molecular+make-up+of+glutamatergic+hair+cell+synapses+in+the+developing+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reduced sensory stimulation alters the molecular make-up of glutamatergic hair cell synapses in the developing cochlea.</a> Neuroscience. , 50-62 (2016).</li>
<li>Zinn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Silico+Reconstruction+of+the+Viral+Evolutionary+Lineage+Yields+a+Potent+Gene+Therapy+Vector%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector.</a> Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).</li>
<li>Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+genome+size+on+AAV+vector+packaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Effect of genome size on AAV vector packaging.</a> Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).</li>
<li>Shu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Adeno-Associated+Viral+Vectors+That+Target+Neonatal+and+Adult+Mammalian+Inner+Ear+Cell+Subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Identification of Adeno-Associated Viral Vectors That Target Neonatal and Adult Mammalian Inner Ear Cell Subtypes.</a> Hum Gene Ther. , (2016).</li>
<li>Kao, S. Y., Soares, V. Y., Kristiansen, A. G., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+TRAIL-DR5+pathway+promotes+sensorineural+degeneration+in+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of TRAIL-DR5 pathway promotes sensorineural degeneration in the inner ear.</a> Aging Cell. 15 (2), 301-308 (2016).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

החוקרים חייבים להשלים את הטכניקה לנתיחה לפני ביצוע ניסויים מעורבים explants cochlear. תאי שיער נפגעים בדרך כלל במהלך ניתוחים המבוצעים בשלב מוקדם בעקומת הלמידה, ורגע בעייתי במיוחד בשלמותם הוא הסרת הממברנה הטקטוריאלית, המחייבת ידיים יציבות, כלים מתאימים וניסיון. כדי לחסוך זמן ומשאבים, שליטה חזותית צריכה להתבצע תחת מיקרוסקופ לנתיחה ואזורים שנפגעו פוטנציאלית יש לציין. במקום להשתמש נוגדנים ראשוניים ומשניים יקרים, ריאגנטים זולים יותר כמו phalloidin מתאימים יותר עבור ניסויים ראשוניים. אק...

אובדן שמיעה חושבי (SNHL) משקף נזק לאוזן הפנימית או מסלול שמיעתי עולה. בעוד אובדן שמיעה הוא הגירעון הסנסורי הנפוץ ביותר בבני אדם 1 , טיפולים מרפא עדיין לא קיים 2 . למרות שתלות שתלי המוח או השמיעה השמיעתית יכולות לשקם מידה מסוימת של שמיעה לחולים עם SNHL חמור עד עומק, השימוע שסופק על ידי מכשירים אלה עדיין שונה מאוד משימוע &quot;טבעי&quot;, במיוחד במהלך ניסיונות להבין דיבור ברעש או להאזנה למוסיקה. בעוד שתנועת תאי השיער נחשבת מזה זמן רב לתוצאה העיקרית של אירועי השמיעה הטראומטיים ( למשל, חשיפה לרעש חזק), יש ראיות גוברות לכך שהסינפסות המשדרות מידע מתאי שיער לעצב השמיעתי הן לפחות פגיעות לטראומה אקוסטית 3 , 4 , 5 </sup<html> &gt; 6 . מאחר וספים אודיומטריים אנושיים, תקן הזהב הנוכחי להערכת תפקוד השמיעה, אינם מנבאים נזק תאגידי ספציפי באוזן הפנימית, נדרשים כלים מעודנים יותר כדי לזהות ניוון תאי מוקדם ככל האפשר וליזום טיפול הולם. טיפולים תרופתיים מבטיחים לאובדן שמיעה נבדקים לעתים קרובות על תרבויות תאים הומוגניות במבחנה , אך מערכות כאלה אינן מדויקות במדויק את מיקרו-הסביבה של השבלול. תאי Cochlear ידועים כדי להפריש גורמים trophic המשפיעים על סוגי תאים אחרים בתוך שבלול 8 , 9 , תהליך חיוני vivo כי הוא איבד כאשר איבר של קורטי 10 , 11 או ספירל גנגליון נוירונים (SGNs) 12 מתורבתים בבידוד או כאשר סמנים מולקולריים מנותחיםEf &quot;&gt; 13. עם זאת, במחקרים vivo כי ייתכן שיהיה צורך אימות של נתונים במבחנה להקים טיפולים חדשים, אישית עבור אובדן שמיעה במרדף של&quot; רפואה דיוק &quot;דורשים משאבים משמעותיים וזמן.זה רלוונטי במיוחד כאשר שוקלים כמה מאמץ נדרש כדי לבצע מושלמת אוזן באמצע או חלון עגול זריקות הממברנה עם בדיקות השמיעה ולאחר מכן לנתיחה של מכלול שבלול כולו.ההקרנה היעילה של תרכובות מבטיח בתרבויות vivo לשעבר organotypic המכונה explants cochlear מספק חלופה כלכלית ואמינה 14 , 15 , 16 , 17 . מאמר זה מפרט פרוטוקול שבאמצעותו ניתן ליצור, לשמור ולהעריך explants cochlear מטופלים. יישומים ספציפיים למודל זה מודגשים, כולל השימוש בו בהקרנהשל תרכובות טיפוליות פוטנציאליות והערכה השוואתית של וקטורים ויראליים לריפוי גנטי. גישה vivo exant לשעבר מאפשר לחוקרים לדמיין את ההשפעות של טיפול נתון על אוכלוסיות תאים שונים באתרם , להקל על זיהוי של סוג ספציפי תאים מנגנוני ואת חידוד הבאים של טיפול ממוקד. בסך הכל, טכניקה זו מספקת מודל ללמוד את vivo cochlea לשעבר תוך שמירה על חוצה שיחה בין סוגי תאים שונים מאוד להתקיים בתוך cochlea.

<table><tbody><tr><td>Ampicillin, נתרן מלח</td><td>Invitrogen</td><td>11593-027</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד CtBP2, עכבר (IgG1)</td> <td>BD Transduction Laboratories</td><td>612044</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד Myo7A, ארנב</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25-6790</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד NF-H, עוף</td><td>EMD Millipore</td><td>AB5539</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד PSD95, נוגדנים לעכבר (IgG2a)</td><td> בע"מ</td><td>75-028</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד TuJ1, עכבר</td><td>BioLegend</td><td>801202</td><td></td></tr><tr><td>דבק תאים ורקמות Cell-Tak, 5 מ"ג</td><td>צינורות</td><td></td> צנטריפוגה 354241 <td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 15 מ"ל, תחתית חרוטית, סיום לימודים,</td> צלחת תרבית תאים סטרילית <td>של Greiner Bio-One</td><td>188161</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR, 100 x 20 מ"מ</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים CELLSTAR, 35 x 10 מ"מ, 4 טבעות פנימיות</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627170</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים CELLSTAR, 60 x 15 מ"מ</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה, תחתית חרוטית, סיום לימודים,</td><td>גריינר סטרילי Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>לק שקוף</td><td>מדעי מיקרוסקופיה</td><td>אלקטרונית 72180</td><td></td></tr><tr><td>כלים תחתונים מזכוכית שקופה (זכוכית 40 מ"מ), PELCO&reg;, שרוול/20, 50 x 7 מ"מ</td><td>טד פלה בע"מ.</td><td>14027-20</td><td></td></tr><tr><td>כיסויים, עגולים, זכוכית, קוטר 10 מ"מ, עובי #1, 0.13 - 0.16 מ"מ</td><td>טד פלה בע"מ.</td><td></td><td></td>260368</tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>מים מזוקקים, 500 מ"ל</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15230-162&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), גלוקוז גבוה, פירובט, ללא גלוטמין, 500 מ"ל</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #4 מלקחיים</td><td>Fine Science Tools</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 מלקחיים (Dumostar)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>אלכוהול אתילי (EtOH), טהור, 200 הוכחה, נטול מים, &ge; 99.5%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>459836-1L</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS), מוסמך, אזורים מאושרים על ידי USDA, 500 מ"ל</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10437-028&nbsp;</td><td>Aliquot בצינורות של 50 מ"ל ומאחסנים ב-20&deg; C מקפיא</td></tr><tr><td>עיזים נגד עוף-647 נוגדן משני</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>A-21469</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד עכברים (IgG)-568 נוגדן משני</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>A-11004</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד עכברים (IgG1)-568 נוגדן משני</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>A-21124</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד עכברים (IgG2a)-488 נוגדן משני</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>A-21131</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן משני נגד ארנב-488 Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>R37116</td><td></td></tr><tr><td>H2O, סטרילי, מים טהורים במיוחד של EmbryoMax, 500 מ"ל</td><td>EMD Millipore</td><td>TMS-006-B</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS), סידן, מגנזיום, ללא פנול אדום, 500 מ"ל</td><td>מגש מכשירים Thermo Fisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>עם מכסה נירוסטה</td><td>Mountainside Medical</td><td>TechMed4255</td><td></td></tr><tr><td>סכין מיקרו (חיתוך) &ndash; זווית 30&deg;</td><td>Fine Science Tools</td><td>10056-12</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ, VistaVision, מקודד צבע, 75 x 25 מ"מ (3 x 1 אינץ'), עובי 1 מ"מ, לבן, חבילה של 72</td><td>VWR</td><td>16004-382</td><td></td></tr><tr><td>N-2 תוסף (100X), 5 מ"ל</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3, נתרן ביקרבונט 7.5% תמיסה, 100 מ"ל</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25080-094</td><td></td></tr><tr><td>NaOH, תמיסת נתרן הידרוקסיד, 1 ליטר</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>סרום סוס רגיל (NHS)</td> <td>Invitrogen</td><td>16050130</td><td></td></tr><tr><td>מספריים הפעלה</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6806</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA), דרגת ריאגנט,</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' גבישי <td>P6148</td><td>לפני השימוש: קבע נהלי הפעלה סטנדרטיים המבוססים על פרוטוקולים זמינים באינטרנט</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4, 500 מ"ל</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023&nbsp;</td><td>חיטוי לפני השימוש</td></tr><tr><td>פלואידין, אלקסה פלואור 568&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>כרית הכנה, לא סטרילי&nbsp;</td><td>Medline</td><td>05136CS</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה עם נעילה בטוחה, פוליפרופילן, 0.5 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>022363719</td><td>חיטוי לפני השימוש</td></tr><tr><td>בצינורות מיקרוצנטריפוגה עם נעילה בטוחה, פוליפרופילן, 1.5 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>022363204</td><td>אוטוקלאב לפני השימוש</td></tr><tr><td>להבי אזמל - #15</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>ידית אזמל - #4</td><td>Fine Science Tools</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>סטמי 2000-C מיקרוסקופ סטריאו</td><td>Zeiss&nbsp;</td><td>000000-1106-133</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי TCS SP5</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X (פעילי שטח לא יוניים)</td> <td>Integra</td><td>T756.30.30</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield אמצעי הרכבה נגד דהייה עבור מעבדות וקטור פלואורסצנטיות</td><td>, בע"מ</td>תיק רוכסן <td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>, ניתן לסגירה חוזרת, 0609132541599 אומגה בעובי 4 x 6 אינץ' - 2 מ"מ</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

neonatal murine cochlear explant טכניקה כמו<em&gt; במבחנה</em&gt; כלי הקרנה במחקר שמיעה

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

אמנם יש התקדמות בולטת במחקר השמיעה בעשורים האחרונים, עדיין אין תרופה עבור אובדן שמיעה Sensorineural (SNHL), מצב זה בדרך כלל כרוך נזק או אובדן של מבנים מכאנסנסורי עדין של האוזן הפנימית. מתוחכם מבחני חוץ גופית vivo לשעבר צמחו בשנים האחרונות, מה שמאפשר את ההקרנה של מספר גדל והולך של תרכובות טיפוליות פוטנציאליים תוך מזעור משאבים מאיצים המאמצים לפתח תרופות עבור SNHL. למרות תרבויות הומוגניות של סוגי תאים מסוימים ממשיכים לשחק תפקיד חשוב במחקר הנוכחי, מדענים רבים כיום להסתמך על תרבויות organotypic מורכבים יותר של האוזן הפנימית Murine, הידוע גם בשם explants cochlear. שימור מבנים תאיים מאורגנים בתוך האוזן הפנימית מקנה הערכה באתרו של מרכיבים שונים של תשתית השבלול, כולל תאי שיער פנימיים וחיצוניים, נוירונים גנגליונים ספירליים, נוירוניםItes, ותאים התומכים. כאן אנו מציגים את הכנה, תרבות, טיפול, immunostaining של explants מון neonatal cochlear. הכנה זהירה של explants אלה מאפשרת זיהוי של מנגנונים אשר תורמים SNHL ומהווה כלי רב ערך עבור קהילת המחקר השמיעה.

בעוד פרוטוקולים רבים מתמקדים באיבר של explants קורטי, טכניקה זו מנסה לשמר את האנטומיה של התור כולו cochlear, כולל SGNs. זה נותן לחוקרים את ההזדמנות לנתח את ההשפעות של טיפול נתון על neurites ו somata של SGNs בנוסף האיבר של קורטי. ביצוע דיסקציה שמשמרת חלק מהמודולוס, כפי שמתואר כאן, מאתגר יותר מבחינה טכנית מאשר חשיפת האיבר של קורטי בלבד. עם זאת, האזור neurite ו SGN חשוב, כי השפעות פתולוגיות משמעותיות נצפו באזור זה לאחר החלת הפרעות שוואנומה שיווי המשקל...

המטרה של פרוטוקול זה היא להדגים את הכנה, תרבות, טיפול, immunostaining של explants מון neonatal cochlear. הטכניקה יכולה להיות מנוצל כמו כלי בדיקה במבחנה במחקרי שמיעה.

Neonatal Murine Cochlear Explant טכניקה כמו<em&gt; במבחנה</em&gt; כלי הקרנה במחקר שמיעה

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

המטרה הכללית של הליך זה היא הכנה, גידול, טיפול וצביעה אימונוהיסטוכימית של תרביות רקמה (explants) של שבלול האוזן מעכבריו של גור חולדה ניונוטלי, לשימוש ככלי סינון in vitro במחקר שמיעה. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום מחקר השמיעה, כגון אפשרות למחקר סימולטני של תאי שיער בשבלול, סינפסות, נוריטים ונוירונים במודל ex vivo, וכן אספקת תובנות לגבי מנגנוני פעולה של מולקולות חדשות בשבלול, כולל גורמים הנמצאים בהפרשות אנושיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת להאיץ את תהליך הסינון של תרכובות טיפוליות מועמדות לפני בדיקתן in vivo.התחילו עם ראש שלושייה שנאסף לאחרונה ושמור בתוך אתנול 70% במכסה של פטרי. השתמשו בלהב סקאלפל כדי לבצע חתך שטחי בעור מקצה הגולגולת הקדמי לקצה האחורי. לאחר מכן, חתכו את שני התעלות השמיעתיות החיצוניות וקפלו את העור קדימה כדי לחשוף את כל הגולגולת.בשלב הבא, פתחו את הגולגולית לאורך התפר הסגיטלי (sagittal suture) על ידי הזזת להב הסכינור בעדינות למעלה ולמטה, מקדמה לאחור, כדי למנוע דחיסה של השבלול (cochlea). הסירו והשליכו את האף על ידי ביצוע חתך אנכי ישירות מאחורי המחשוליות (orbits). החלק האחורי של הגולגולת אמור להכיל עדיין את המוח ואת השבלול.לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי לבצע דיסקציה קהה ולהסיר את המוח הקדמי, הדגיליה וגזע המוח. הניחו את שני חצאי הגולגולת בתוך צלחת פטרי פלסטית בנפח 60 מילימטר מלאה ב-HBSS קר. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי לחשוף לחלוטין את השבלול, הנמצא סמוך לעורק הסטפדיאלי שמסביבו, והפרידו בעדינות את האיבר מעצם הרקה.העבירו את השבלול (cochlea) אל צלחת פטרי בעלת תחתית זכוכית ושקיפות בקוטר 50 מילימטר המכילה HBSS, והניחו את הצלחת תחת המיקרוסקופ. הניחו את צלחת הפטרי מפלסטיק בקוטר 60 מילימטר עם החצי השני של הגולגולת על קרח. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי לנתח בזהירות את הקפסולה האוטיקה של השבלול.כעת, השתמשו בסכין מיקרוסקופית או בשני פינצטות 55 כדי להפריד בזהירות את הרצועה הספיראלית (spiral ligament) הדבוקה לאיבר קורטי (organ of Corti) משאר השבלול (cochlea) ומה-medialis. ניתן לעשות זאת על ידי תפיסת הרצועה הספיראלית בחלק הבסאלי ביותר ופיתולה העדין תוך כדי תנועה לכיוון האפקס. לאחר הסרת הרצועה הספיראלית, מקמו את הדגימה כדי לקבל מבט סגיטלי אורך של השבלול.לאחר מכן, חתכו את השבלול (cochlea) לשניים או שלושה חלקים באמצעות סכין מיקרו, וסווגו חלקים אלו כסיבובים האפקליים (apical) והבזאליים (basal). הסירו את הרקמה שמעל לחלק האפקלי יותר ואת הרקמה שמתחת לחלק הבזאלי יותר, עד לשכבה הממשי של תאי השערה והנוריטים, כדי לאפשר לשתול השבלול להשכיב בצורה אופקית על פטריית המעבדה. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי לתפוס בעדינות ולקלף את קרומי הטקטוריה (tectorial membrane), שכבה שקופה ודקה מאוד הנמצאת מיד מעל לאיבר קורטי (organ of Corti).השלב המאתגר ביותר מבחינה טכנית הוא ככל הנראה הסרת קרומי התקרה (tectorial membrane) הדקים והשקופים, שכן ניתן לפגוע בקלות בתאי השערה הנמצאים תחתיהם. על ידי התחלה מהקצוות של הרקמה, תאי השערה לאורך כל השבב (explant) נשמרים, למעט בקצה המדויק שבו החלה קילוף קרומי התקרה. לבסוף, הסר את קרומי רייסנר (Reissner's membrane) הנמצאים מיד מעל לנוירונים של הגנגליון השבלולי, על ידי נגיעה בהם עם פינצטה משני הצדדים וקילופם.דגימת השבלול מוכנה כעת לתרבית לאחר הסרת אזורים פגומים בקצוות. התחילו את הליך התרבית על ידי הרטבת קצה של פפית של 1 ml עם כ-120 µL של DMEM, כדי למנוע מהשתל להידבק לדופן הפנימית של הקצה. לאחר מכן, השתמשו בקצה שהורטב כדי לשאוב מקסימום 70 µL מתוך פטריית הזכוכית והניחו את הדגימה יחד עם הנוזל באחד מארבעת השקעים בפטריה בעלת ארבעה בארות.בדקו תחת המיקרוסקופ שהשתל נמצא באוריינטציה הנכונה. ודאו שאזור תאי השערה ממנו הוסרה ממбраנת הטקטוריה (tectorial membrane) פונה כלפי מעלה, ושהממברנה הבסילרית (basilar membrane) יחד עם החלק הבסאלי הגזוז של המדיאליס פונים כלפי מטה ונצמדים לתוספת של זכוכית הכיסוי.לאחר שהאקספלנט מונח בכיוון הנכון, שאבו את ה-HBSS העודף והמתינו 15 שניות. כעת, העבירו בפיפטה 60 µL של מצע גידול חם ישירות על הדגימה, תוך הקפדה לא לגעת בדגימה עם הפיפטה. החזירו את המכסים של פטרי פטרי הפנימית והחיצונית והדגרירו למשך הלילה בטמפרטורה של 37 °C.ביום למחרת, העבירו את צלחות הפטרי הכוללות את השתלי השבלול (cochlear explant) מהאינקובטור למכסה זרימה למינרית. שאבו את מצע התרבית הישן שאינו מכיל FBS מההשכבה הפנימית. הוסיפו 60 µL למסגרת של מצע טיפול מחומם שהוכן מראש.החזירו את צלחת הפטרי למדגרה עד לצביעת התרביות, למשך מקסימום שבעה ימים. כפי שניתן לראות בתמונה קונפוקלית זו, טכניקה זו משמרת את האנטומיה של כל סיבוב השבלול, כולל נוירוני הגנגליון הספירלי או SGNs, ובכך מאפשרת ניתוח של השפעות הטיפול עלהנוריטים והסומות של SGNs, בנוסף לאיבר קורטי. כפי שרואים כאן, ניתן להשתמש באקספלנטים אלו כדי להשוות בו-זמנית את השפעת הטיפול על הסיבובים האפיקליים והבזאליים לאחר צביעה אימונופלורסצנטית.תאי שיער מוצגים בירוק ומבנים נוירונליים מופיעים באדום. ניתן להעריך סינפסות שלמות על ידי סימון חלבונים פרה-סינפטיים המוצגים באדום וחלבונים פוסט-סינפטיים המוצגים בירוק, יחד עם צביעה של מבנים נוירונליים בכחול. איור זה מציג תמונות מייצגות של השתלה (explants) של שבלול מהאזור האפיקלי והבזאלי לאחר שבעה ימים בתרבית עם 3%FBS משמאל או 1%FBS מימין.תאים שגודלו ב-3%FBS מתחילים לנדוד בין היום הרביעי לחמישי, כפי שמוצג על ידי החצים האפורים בהיר עבור תאי שערה והחצים האדומים עבור נוריטים. השתלים ב-1%FBS שומרים על שלמות ארגונית עד היום השביעי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לוודא חזותית את השלמות המבנית ואת הכיוון של רקמת השבלול לפני הוספת מדיום התרבית הסופי והחומרים הרלוונטיים.לאחר ביצוע הליך זה, ניתן לבצע שחזור תלת-ממדי כדי לאשר לוקליזציה ספציפית לסוג התא של תאים המבטאים GFP בתוך ה-medialis.

neonatal-murine-cochlear-explant-technique-as-an-vitro-screening-tool

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

הליך זה מתאר שיטה לבידוד והתרבות של האיבר של קורטי Murine עם או בלי לימבוס ספירלה ספירלה נוירונים גנגליון. אנחנו גם להדגים שיטה הביטוי של הגן כתב אקסוגניים האיבר של קורטי explant ידי electroporation.

תרבות ראשיים electroporation פלסמיד של האיבר Murine של קורטי.

האוזן הפנימית העכבר הוא איבר placode הנגזרות חושית אשר התפתחותית תוכנית מפורטת במהלך ההריון. אנו...

ין העברת לאוזן הפנימית על ידי פיתוח מאוס<em&gt; In vivo</em&gt; Electroporation

הדמיה חיה של שבלול האוזן של יונקים העובריים היא מאתגרת, כי התהליכים התפתחותיים ביד פועלים על שיפוע זמני על עשרה ימים. כאן אנו מציגים שיטה culturing ולאחר מכן ההדמיה רקמות explant השבלול עוברית שנלקחו מעכבר כתב ניאון בחמישה ימים.

לטווח ארוך זמן פקיעת הדמיה של Explants שבלול העכבר

אנו מציגים שיטה המתארת בידוד ותרבית של צמחי שבלול מהאוזן הפנימית של עכבר עוברי.  אנו גם מדגימים שיטה להעברת גנים לתוך צמחי שבלול באמצעות אלקטרופורציה של גל מרובע. תרבית הצמח במבחנה יחד עם טכניקת העברת גנים מאפשרת לחוקרים לחקור את ההשפעות של שינוי ביטוי גנים במהלך ההתפתחות.

תרבות של עוברי Explants שבלול העכבר וג&#39;ין העברה על ידי Electroporation

קיימות שיטות שונות להחדרת חומרים אוטוטוקסיים לשבלול של מודלים של בעלי חיים. מוצג פרוטוקול כירורגי להעברת חומרים אוטוטוקסיים לגומחת החלון העגול. ההליך אמין, יוצר נגעים תוך-שבלוליים ממוקדים ומונע נזק מכני למיקרו-ארכיטקטורה. ניתן לבחון תיקון/התחדשות עצמית של השבלול.

גישת העכבר עגול החלון לototoxic סוכן משלוח: מהיר וטכניקה אמינה גרימת ניוון תא שבלול

במחקר זה, אנו מתארים את הגישה תעלת semicircular האחורי בתור שיטה אמינה למסירה גן באוזן הפנימית בעכברים neonatal. אנו מראים כי המסירה הגן דרך תעלת semicircular האחורי הוא היכולת perfuse האוזן הפנימית כולה.

גישה תעלת Semicircular אחורי האוזן הפנימית המסירה הגן עכבר Neonatal

מודלים חייתיים של שתלי שבלול יכול לקדם את הידע בסיסי טכנולוגיים לטיפול אובדן שמיעה sensorineural קבוע עם גירוי חשמלי. מחקר זה מציג פרוטוקול כירורגי מחריש אוזניים חריפה, שבלול השרשה של מערך אלקטרודה עכברים, כמו גם את הערכת תפקודי עם גזע המוח השמיעתית תגובה.

ניתוח שתל שבלולי והקלטות תגובה חשמלית עורר גזע המוח בעכברים C57BL/6

הגוזל הוא אורגניזם מודל חסכוני, נגיש וזמין באופן נרחב למגוון מחקרים. כאן מפורטת סדרה של פרוטוקולים להבנת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס ההתפתחות וההתחדשות של האוזן הפנימית של העופות.

בשיטות אובו ואקס אובו לחקר התפתחות האוזן הפנימית של העופות

חזירים מיניאטוריים (מיני חזירים) הם מודל אידיאלי של בעלי חיים גדולים למחקר על שתלי שבלול. ניתן להשתמש בניתוח השתלת שבלול במיני חזירים כדי לספק ראיות ראשוניות לבטיחות ולביצועים הפוטנציאליים של מערכי אלקטרודות חדשניים וגישות ניתוחיות במערכת חיה הדומה לבני אדם.

החזיר המיניאטורי: מודל חייתי גדול לחקר שתל שבלול

הפרוטוקול הנוכחי מעדכן פרוטוקולים קודמים ומשלב גישות פשוטות יחסית לגידול צמחי שבלול באיכות גבוהה. זה מספק איסוף נתונים אמין והדמיה ברזולוציה גבוהה בתאים חיים וקבועים. פרוטוקול זה תומך במגמה המתמשכת של חקר תאי האוזן הפנימית.

צמחי שבלול שלמים של ילודים כמודל במבחנה

במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבידוד וטיפוח תאי שערת שבלול ראשוניים מעכברים. בתחילה, האיבר של קורטי נותח מהיילוד (בגיל 3-5 ימים) שבלול מורין תחת מיקרוסקופ. לאחר מכן, התאים עוכלו אנזימטית לתרחיף חד-תאי וזוהו באמצעות אימונופלואורסנציה לאחר מספר ימים בתרבית.

בידוד ותרבית של תאי שיער שבלול ראשוניים מעכברי יילודים

למד הכנה וגידול של אקספלנטים קוכליאריים מעכברים נאונטליים לחקר שמיעה. שיטה זו מאפשרת בחינת תאי שיער, סינפסות ונוירונים במודל אקס vivo לסינון תרופות פוטנציאליות לפני בדיקה בחי.

Neonatal Murine Cochlear Explant טכניקה כמו

גלה סרטונים נוספים