לשעבר Vivo הדמיה של לימפוציטים מסוג T CD8 תושב באמבריולוגיה הגידול פרוסות משתמש מיקרוסקופיה קונפוקלית

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמות תאי CD8 T חודרים לגידול תושב המסומנים בנוגדנים מצומדים פלואורסצנטיים בתוך פורסות גידול ריאה אנושיות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח באימונולוגיה של גידולים, כגון אופי האלמנטים המווסתים באופן חיובי ושלילי את נדידת תאי T בתוך גידולים אנושיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לנו לעקוב אחר ההתנהגות היומיומית של תאי CD8 T תושבים בסביבת גידול אנושית שמורה.

הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר הקמנו את השיטה בבלוטות הלימפה של מירין כדי לעקוב אחר תאי T, לשתול אותם על פרוסות, פרוטוקול שפורסם במקור ב-JoVE בשנת 2011. כדי להתחיל, הוסף גרם אחד של אגרוז נקודת התכה נמוכה במיכל, ולאחר מכן הוסף 20 מיליליטר של PBS סטרילי ללא סידן ומגנזיום. מיקרוגל את התמיסה כדי להמיס לחלוטין את האגרוז.

מצננים את תמיסת האגרוז הזו של 5% באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. במכסה המנוע של תרבית הרקמות, הוסף 1.1 מיליליטר של מדיום RPMI-1640 שלם לכל באר של צלחת תת-תרבית של שש בארות. לאחר מכן, בעזרת זוג מלקחיים סטריליים, הניחו תרבית תאים סטרילית בגודל 30 מילימטר לכל באר.

דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עד לשימוש מאוחר יותר. לאחר מכן, הניחו את ביופסיית הגידול בכלי פלסטיק של 10 סנטימטרים, ובעזרת להב חד וסטרילי, חתכו את הגידול לשבר קטן בצורת קובייה בגודל של כחמישה על חמישה מילימטרים. כעת, הוציאו את תמיסת האגרוז המוכנה מהחממה.

בעזרת זוג מלקחיים סטריליים, העבירו בזהירות את שברי הגידול למגבון טישו כדי לנקז עודפי מדיום, ואז שפכו את האגרוז לתוך צלחת פלסטיק של 35 מילימטר והכניסו את שברי הגידול כדי למקם אותם בתחתית צלחת הפלסטיק. השאירו את ג'ל האגרוז על הקרח למשך חמש דקות להתמצקות. לאחר שהאגרוז מתמצק, הפוך את צלחת הפלסטיק.

בעזרת מרית משחררים את כל הג'ל. בעזרת להב חד, חתוך את עודפי האגרוז המקיפים את שברי הגידול, והשאיר שלושה עד חמישה מילימטרים של ג'ל סביב הרקמה. בעזרת טיפה של דבק רקמות לא רעיל, הרכיב את גוש האגרוז על דיסק הדגימה של הוויברטום.

מלאו את מגש חיץ הוויברטום ב-PBS סטרילי וקר כקרח, והתקינו את דיסק הדגימה המכיל את בלוק האגרוז במגש. הגדר את מהירות ותדירות הרטט לערכים הרצויים. לאחר שמערך הוויברטומה מוכן, הוציאו את צלחת שש הבארות מהחממה.

כעת התחל לחתוך את הבלוק המותקן לפרוסות של 350 מיקרון באמצעות הוויברטום. בעזרת מלקחיים עדינים, אספו בזהירות את פרוסות הגידול בזמן החיתוך, והניחו אותן שטוחות מעל תוספות תרבית התאים בצלחת שש הבארות. מעבירים פרוסה אחת על כל תוספת.

לאחר מכן, בעזרת מלקחיים עדינים, הניחו מנקי נירוסטה מעוקרים ורטובים מראש על כל פרוסה. ודא שהדסקיות ממוקמות היטב על האגרוז המקיף את רקמת הגידול. השאירו את הצלחת ל-37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות באינקובטור לח של 5% פחמן דו חמצני לפני צביעה חיסונית.

לדלל את הנוגדנים הנדרשים המסומנים בפלואורסצנט ואת הצבע הגרעיני הפלואורסצנטי, DAPI, לריכוזי הוויניל הנדרשים במדיום RPMI ללא פנול אדום. לאחר מכן, הסר את צלחת התרבות מהחממה ובעזרת קצה עדין שאב את הנוזל בתוך מנקי הנירוסטה. כעת, מבלי לגעת בפרוסה, הוסיפו 40 מיקרוליטר את הנוגדנים המדוללים לכל פרוסת גידול.

כדי לאפשר מכתים, דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר השלמת שלב הצביעה, בעזרת מלקחיים עדינים, הסר את הדסקיות. לאחר מכן, מוציאים בעדינות את הפרוסות וטובלים אותן במדיום RMPI-1640 ללא פנול אדום למשך 10 שניות.

מניחים את הפרוסות בחזרה על תוספות תרבית התאים ומוסיפים טיפה של מדיום RMPI-1640 ללא פנול אדום על כל פרוסה. דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואז המשיכו להדמיה. מספר שעות לפני תחילת ניסוי זה, הגדר את הטמפרטורה של תא החום של המיקרוסקופ ל-37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן הכן את מערך המיקרוסקופ לשפע מתמיד של פרוסות גידול עם מדיום RMPI מחומצן ללא פנול אדום ולשאוב את המומס לבקבוק איסוף פסולת באמצעות משאבה פריסטלטית.

בעזרת מלקחיים עדינים, הרם את הפרוסה המוכתמת מצלחת שש הבארות, והעביר אותה לכלי פלסטיק בגודל 35 מילימטר מלא במדיום RMPI ללא פנול אדום, הניח עוגן פרוסה מעל הפרוסה כדי לתמוך בה. לאחר מכן, הניחו את צלחת הפטרי הזו על שלב ההדמיה של המיקרוסקופ. לאחר חיבור קצות הכניסה והיציאה של מערכת הזילוף, הפעל את המשאבה הפריסטלטית כדי לאפשר למדיום המחומצן לעבור דרך צינורות הזילוף.

הורד את מטרת יציאת המים לפרוסה, והתמקד בחלק העליון של הפרוסה עם אור שדה בהיר, או באורך הגל המתאים. לאחר מכן, באמצעות מסננים מתאימים, דמיין ובחר אזור עניין המכיל את כל התאים המסומנים בפלורסנט המעניינים, כלומר תאי CD8 T, לולאות הגידול ותאי הסטרומה החיוביים CD90. הגדר מפגש הדמיה באמצעות עוצמת לייזר וזמני חשיפה מתאימים כדי להתאים לבהירות האותות הפלואורסצנטיים שנצפו.

לאחר מכן הגדר את עובי מחסנית ה-Z לתמונה בתוך פרוסת הגידול. לאחר מכן, בחר את מרווח הזמן של התמונה Z-stack ואת זמן ההקלטה הכולל כדי לצלם תמונות במרווחי זמן ספציפיים. לאחר לכידת וייצוא התמונות הפלואורסצנטיות, נתח את נדידת תאי CD8 T כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

מוצגת כאן תמונה מייצגת של פרוסת גידול ריאה אנושית מוכתמת. שימו לב להתפלגות של תאי T חיוביים CD8 ירוקים, תאי גידול מוכתמים במולקולת הידבקות תאי אפיתל כחולים, ותאי סטרומה חיוביים CD90 או Thyrum אדומים. בפרט, שימו לב שתאי CD8 T נמצאים בשפע יותר בסטרומה בהשוואה ללולאות הגידול.

משורטטים כאן מסלולים של תאי CD8 T תושבים בודדים צבועים בירוק, ותאי הגידול האדומים והכחולים של פרוסת גידול הריאה האנושית. קולגן שזוהה באמצעות דור הרמוני שני ומוצג באדום, מסמן את תא הסטרומה. למרות שהם פחות נפוצים מעיניות הגידול, תאי CD8 T נודדים באופן פעיל יותר בתא זה בהשוואה לסטרומה.

לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות בדרך כלל תוך ארבע-חמש שעות אם היא מבוצעת כראוי. לאחר סרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשיג דגימות גידול הומור חיסוני, על מנת לנטר תאי CD8 T תושבים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.