בידוד של האוכלוסייה בצד Myc- המושרה T- תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה דג הזברה

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד תאי אוכלוסיית צד (side population cells) ממודל דגי זהב של לוקמיה לימפובלסטית חריפה של תאי T המושרה על ידי myc. בדיקת אוכלוסיית הצד שימשה לזיהוי אוכלוסיות של תאי גזע ותאי פרוגניטור ברקמות נורמליות וסרטניות רבות, אך היא טרם יושמה במודלים של סרטן בדגי זהב.

היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת בידוד פרוספקטיבי של אוכלוסיית תאים ב-T-ALL בדגי zebrafish שעשויה להיות מועשרת בפעילות של תאי גזע סרטניים. למרות שהשיטה המתוארת כאן בעלת יישומים רחבים במחקר של לוקמיה בדגי zebrafish, היא עשויה להיות ישימה גם לסוגים אחרים של תאים ממאירים ולא-ממאירים בדגי zebrafish. אנשים שאינם מכירים את השיטה עשויים להיתקל בקשיים, כיוון שהיא רגישה לשינויים קלים.

על אף שהשיטה נראית פשוטה, נדרשת אופטימיזציה עבור כל סוג תא שנבדק. הכינו 20 milliliters של 10% FBS שעבר אינאקטיבציה בחום ב-0.9x PBS. הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת ה-FBS/PBS לבקבוקון של heparin sodium salt המכיל 300 units של נוגד הקרישה.

לאחר מכן, באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי, בחרו דגים שבהם תאי גידול פלשו ל-50 אחוזים מהגוף, או דגים המזוהים כסובלים מקשיים באכילה או בשחייה. השקיטו את הדגים על ידי העברתם לתמיסה של 1 עד 2 mg/mL tricaine במי דגים. עקבו אחר תנועות הזימים וקצב הלב של בעל החיים כדי לאשר את ההשקטה.

לאחר הסרת ראש הדג, הזרק באמצעות פפטה 100 µL של תמיסת הפרין לחלל הגוף כדי להסיר תאי דם אדומים עודפים. שאב את כל הנוזל שיוצא והעבר אותו באמצעות פפטה לתוך מבחנה למיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 mL. לאחר מכן, באמצעות טיפי פפטה נקיים, שטוף את חלל הגוף פעמיים נוספות או עד שתמיסת השטיפה לא תכיל דם, והשליך את הנוזל שנאסף מכל השטיפות.

לאיסוף תאי לוקמיה, מזריקים 100 µL של תמיסת FBS/PBS לחלל הגוף שנשטף מראש. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, מפעילים לחץ עדין על גוף הדג באמצעות קצה של פיפטה כדי לדחוק החוצה את תאי הגידול. אוספים את הנוזל ששוחרר אל תוך פרועת מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 mL.

חזרו על תהליך הבידוד עד שרוב תאי הגידול נאספים. אספו את כל התאים לאותה מבחנה למיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 milliliter ושמרו את הסספנסיה שהתקבלה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, ערבבו את תאי הגידול המבודדים באמצעות פיפוט עדין כדי לפרק גושים של תאים.

סננו את תרחיף התאים דרך מסנן רשת של 40 מיקרומטר. שטפו את המסנן פעם אחת עד פעמיים עם 100 מיקרוליטר של FBS/PBS. לאחר הסינון, שמרו את התאים בטמפרטורת החדר.

לבסוף, במבחנה חדשה, ערבבו 2 µL מת сусלול התאים עם 18 µL של תמיסת Trypan Blue סטרילית בריכוז 0.04%. העמיסו 10 µL מהסוסלול שהתקבל אל תוך המוציטור (hemocytometer) וספרו את תאי הגידול הפלואורסצנטיים החיוניים. חשוב לאסוף דגימה נקייה של תאי T-ALL.

הריכוז של Hoechst 33342 המשמש כאן מבוסס על מספר תאי הגידול החיים שנאספו. שיירי תאים נוספים או תאים שאינם תאי גידול עלולים להפריע לבדיקה. לפני צביעת התאים, המס את צבע ה-Hoechst במים נקיים מנוקליאז כדי לקבל תמיסת עבודה בריכוז של 1 mg/mL.

יש לאחסן את התמיסה שהוכנה, כשהיא מכוסה בנייר אלומיניום, בטמפרטורה של 4 °C. לאחר מכן, המיסו 49.1 mg של verapamil ב-1 mL של DMSO כדי לקבל תמיסת מעכב בריכוז 100 µM. לאחר מכן, הכינו את הדגימה על ידי הוספת FBS/PBS, כ-2.5 µL של DMSO, כ-15 µL של צבע Hoechst בריכוז 1 mg/mL, ו-10⁶ תאי גידול לשפופרת fax, עד לנפח סופי של 1 mL.

להכנת הביקורת, על ידי הוספת FBS/PBS, 2.5 µL של verapamil בריכוז 100 mM, ו-15 µL של צבע Hoechst בריכוז 1 mg/mL, הוסף 10⁶ תאי גידול לנפח סופי של 1 mL. דגור את הדגימה ואת הביקורת באמבט מים בטמפרטורה של 28 °C בחושך למשך 120 דקות. לאחר הדגירה, הנח את התאים מיד על קרח ושמור אותם בחושך.

סובב את התאים בצנטריפוגה במהירות של 300 ×g בטמפרטורה של 4 °C למשך שש דקות. לאחר מכן, הסר את העליון (supernatant) ושטוף את התאים עם 1 mL של FBS/PBS. סובב את התאים שוב בצנטריפוגה במהירות של 300 ×g בטמפרטורה של 4 °C למשך שש דקות נוספות.

לאחר שהתאים שקעו, הסירו את הנוזל העליון והשביו את התאים ב-1 mL של FBS/PBS. שמרו את הדגימות בטמפרטורה של 4 °C עד למיון התאים. 15 דקות לפני מיון התאים, הוסיפו 2 µL של תמיסת סטוק של propidium iodine בריכוז 1 mg/mL לכל 1 mL של תרחיף התאים.

לאחר מכן, ערבבו את הדגימות היטב באמצעות וורטקס. נתחו את תרחיפי תאי T-ALL של דגי zebrafish צבועים באמצעות ממיאן תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS). עוררו את הדגימות באמצעות לייזר UV לצורך ניתוח צבע Hoechst ולייזר של 488 ננומטר לזיהוי תאי T-ALL חיוביים ל-propidium iodide או GFP.

ייתכן ויהיה צורך לבצע אופטימיזציה למספר התאים, ריכוז הצבע, טמפרטורת האינקובציה ומשך האינקובציה עבור כל סוג תא שונה שנעשה בו שימוש. שינויים בכל אחד מהתנאים הללו עלולים לשנות באופן דרסטי את תוצאות הבדיקה. כדי לזהות את אוכלוסיית הצד (side population) מבין תאי T-ALL שבודדו מדגי zebrafish, ראשית יש להוציא פסדתיים תאיים וצבירי תאים.

לאחר מכן מנתחים את קליטת ה-Propidium iodide ואת ביטוי ה-GFP באוכלוסיית תאים בודדת כדי לזהות תאי גידול חיים. כדי להדגים את אוכלוסיית הצד (side population), משווים את הפליטות הכחולה והאדומה של צבע ה-Hoechst. אוכלוסיית הצד מופיעה כזנב עמום של תאים הנמתח מהצד השמאלי של אוכלוסיית התאים העיקרית לעבר ציר הפלואורסצנציה הכחולה.

כאן מוצגות תוצאות של אנליזת אוכלוסיית צד (side population) שבוצעה עבור שתי דגימות שונות של תאי גידול. אוכלוסיית צד זוהתה בשני הדגימות. עם זאת, דגימות הגידול השונות הכילו מספרים שונים של תאי אוכלוסיית הצד.

בכל דגימת גידול שנבדקה, טיפול בדגימה באמצעות מעכב השבחה (efflux inhibitor) של verapamil הוביל להיעלמות האות שנצפה בתאים שזוהו קודם לכן, ובכך אישר באופן נוסף את הפנוטיפ של אוכלוסיית הצד (side population). לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע את שיטת אוכלוסיית הצד ב-T-ALL של דגי זברה בפחות מארבע שעות, אם היא מבוצעת כראוי ובאופן שהצגנו כאן. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור את השלבים שעברו אופטימיזציה עבור T-ALL של דגי זברה, כגון טמפרטורת וזמן הדגירה, ריכוז הצבע ומעכב ההשבחה.

ייתכן שיהיה צורך לשנות אלו עבור מערכות ניסיוניות שונות. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון בידוד RNA או בדיקות השתלה in vivo, עם תאי אוכלוסיית הצד (side population) הממוינים, כדי לבחון שאלות הנוגעות לתפקוד ולבקרה הגנטית של תאי אוכלוסיית הצד. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו מבודדים את אוכלוסיית הצד של תאים מליוקמיה לימפתובלסטית חריפה מסוג T של דגי זבראפיש.