Name: דיספציה ותרבות של כליה עובריים עכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: למדו לבודד ולגדול רודימנטים מטנפריים מעוברי עכברים לחקר אורגנוגנזת כליות. שיטה זו מאפשרת מעקב אחרי התפצלות ניצני השופכן והבנת מומים מולדים בביולוגיה התפתחותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לייף Oxburgh ו דרק אדמס על שיתוף נדיב את הידע שלהם, לייף Oxburgh עבור הערות מועילות על כתב היד, ו סטפן וולפל ו Ulrike Müller על התמיכה הטכנית שלהם Saskia Schmitteckert, יוליה Gobbert, סאשה Weyer ויולה מאייר לעזרה מַעבָּדָה. עבודה זו נתמכה על ידי פיתוח, החברה של ביולוגים (כדי CP).

עכברים נשמרו על פי תקנות שוודית החקיקה של האיחוד האירופי (2010/63 / האיחוד האירופי). כל ההליכים בוצעו בהתאם להנחיות ועדת האתיקה השבדית (מתירים C79 / 9, C248 / 11 ו- C135 / 14). ההליכים באוניברסיטת היידלברג בהשתתפות נושאי בעלי חיים אושרו על ידי קארלסרוהה Regierungspräsidium וקציני רווחת בעלי חיים באוניברסיטת היידלברג. 1. הכנת חומרים כימיים וחומרים לתרבות הערה: השתמש ברדס זרימה למינרית כדי למזער זיהום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של דיסקציה, מראש אשכול האדם Fc לבד או רקומביננטי chimeric חלבון אפרין התמזגו כדי Fc האדם על ידי ערבוב זה עם נוגדנים Fc אנטי אנושי נגד יחס טוחנת של 1: 5 ב פוספט סטרילי שנאגרו מלוחים (PBS). לדגור על 1 שעה ב 37 ° C 5 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו את המדיום התרבות על ידי השלמת Dulbecco השתנה של הנשר בינוני: מזיןתערובת F-12 (DMEM / F12) עם 1% פניצילין / סטרפטומיצין (v / v), 1% גלוטמין (v / v), 1% אינסולין טרנספרין סלניום (v / v), 50 מיקרוגרם / Transrin, ו 1.5 מיקרוגרם / mL amphotericin. הערה: 10 מ&quot;ל של המדיום מספיק עבור 16 עוברי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף אשכולות רקומביננטי פתרון אפרין בריכוז סופי של 20 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​למדיום התרבות. השתמש Fc אנושי אשכולות כמו שליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו צלחות תרבות על ידי הוספת 500 μL של המדיום תרבות היטב כל של צלחת סטרילי, ללא ציפוי, צלחת שטוחה 4-היטב קלקר סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים סטרילית, בזהירות במקום אחד מסנן קרום פוליקרבונט עם גודל הנקבוביות של 5 מיקרומטר לכל היטב על גבי המדיום. מעבירים את הצלחת מוכנה האינקובטור (37 ° C / 5% CO 2 ). ודא כי המסנן נשאר יבש על פני השטח העליון צף. הערה: מסנן אחד מספיק עבור שתי anlagen כליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות סכין גילוח, לחתוך כ -30 טיפים פיפטה (נפח: 100 μL) approximatelY 1 מ&quot;מ מהקצה כדי לגרום לפתיחה רחבה יותר. מניחים את הטיפים בחזרה לתוך מתלה פיפטה קצה. </li></ol> 2. ניסוי של יסודות Metanephric ב E11.5 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב עכבר מתוזמן בהריון E11.5 על ידי נקע צוואר הרחם (או באמצעות שיטה שאושרה על ידי ועדת האתיקה המקומית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הרחם ואת העוברים, כפי שתואר על ידי Brown et al 6 . מנקודה זו קדימה, לעבוד תחת מיקרוסקופ לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מס &#39;5 מלקחיים שען, לחתוך את העובר ישירות מתחת הקדמי. השתמש בצלחת פטרי טרי כל העובר. הסר את הרגליים ואת זנב העובר. כדי לעשות זאת, לתפוס את הרקמה כדי להסיר עם זוג אחד של מלקחיים מס &#39;5 שען להשתמש בעצות של זוג השני לחתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר את מסת האיבר הגחון, השתמש בעצות של מלקחיים כדי לפתוח את דופן הגוף של העובר בכיוון מקורי אל הזנב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור באופן שטחי, במקביל tהוא אבי העורקים הגבי. השתמש אבי העורקים הגבי, ולכן גלוי לעין עבור כיוון. בזהירות להפריד את החלק הגחון של קיר הגוף מהחלק הגבי באמצעות קצות מלקחיים סגורים להעיף את העובר מעל. חותכים את דופן הגוף לרוחב בכיוון מקורי אל הזנב באמצעות אבי העורקים הגבי עבור אוריינטציה, כמו בצד הקודם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קיר הגוף הגחון הופרד מהגוף הגבי, לתפוס אותו עם זוג אחד של מלקחיים בזהירות למשוך כדי להסיר אותו, יחד עם מסת האיבר. הערה: metanphric anlagen בדרך כלל להישאר מחובר לקיר הגוף הגבי. הם אליפסה, ~ 200 מיקרומטר מבנים ארוכים הממוקמים ברמה של הגפיים האחוריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את דופן הגוף הגב עם זוג אחד של מלקחיים, עם הצד הגחון פונה כלפי מעלה. באמצעות זוג אחר של מלקחיים, לתפוס את אבי העורקים הגבי על קצה מקורי שלה בזהירות לקלף את אבי העורקים הגבי מן הקיר הגוף הגבי. הערה: שתי הכליות metanphric בדרך כלל להישאר מצורףאד לאבי העורקים הגבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות זוג אחד של מלקחיים, לחתוך rostrally כדי anlagen הכליות כדי להסיר את אבי העורקים. לאחר מכן, בזהירות להפריד את שתי הכליות anlagen באמצעות קצות המלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לקלף את רקמות לא רצויות מן anlagen הכליות באמצעות קצות המלקחיים. הקפד לא לפגוע מזנכימה, כמו נזק יכול לגרום לצמיחה גרועה והדרה של explant מניתוח נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הכליה anlagen בנפרד באמצעות פיפטה microliter ואת קצה פתוח פיפטה פתוח μL 10 של PBS כדי מסנן קרום פוליקרבונט בצלחת 4-היטב. הערה: בשל מתח הפנים, האקספלנט יכוסה בשכבה דקה של מדיום. מסנן אחד מספיק עבור שתי anlagen כליות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כל אחד משני anlagen הכליות במרכז של כל מחצית בהתאמה של המסנן. מעבירים את הצלחת בחזרה לחממה ב 37 ° C / 5% CO 2 . להשאיר את הצלחת בחממה עד רוד metanphricIments מן העובר הבא מוכנים להיות ממוקם על המסנן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.3-2.9.1 עבור כל עוברי. הערה: עם קצת תרגול, הליך לנתיחה ייקח בערך 5 דקות לכל עובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה anlagen הכליות במשך 3 ימים ב 37 ° C / 5% CO 2 . </li></ol> 3. הכנה של ריאגנטים עבור קיבוע מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין paraformaldehyde 4% (PFA) ב PBS ללא סידן ומגנזיום (w / V), להמיס את PFA ב 60 מעלות צלזיוס ב PBS, ערבוב מתמיד. מגניב לטמפרטורת החדר ולהשתמש במסנן נייר כדי להסיר את החלקיקים הנותרים. Aliquot ולשמור על 4 מעלות צלזיוס לשימוש מיידי או להקפיא אחסון לטווח ארוך. זהירות: PFA הוא רעיל. ללבוש את הציוד מגן אישי המפורטים בתקני הבטיחות המקומי ולעבוד במנדף קטר. בטל פסולת בעקבות הנחיות מוסדיות ושימוש במיכלי פסולת ייעודיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין פתרון permeabilization, לדלל טריטון X-100ב- PBS ללא סידן ומגנזיום ל- 0.3% (v / v). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין פתרון חסימה, הוסף 5% (v / v) בסרום עז ו 0.1% Triton X-100 ל- PBS ללא סידן ומגנזיום. הוסף אזיד נתרן לריכוז סופי של 0.02% (w / v). חנות ב 4 ° C. זהירות: סודיום אזיד הוא רעיל. טיפול בנזיד נתרן בהתאם לתקנות הבטיחות המקומיות והגנת הסביבה. הערה: בעת שימוש נוגדנים עבור מכתים, להשתמש בסרום 5% מן המין מי נוגדנים משני נגזר כדי להפוך פתרון חסימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל biichinylated Dolichorus biflorus agglutinin 1: 200 ב חסימת פתרון. מדולל Alexa488-streptavidin מצומדות 1: 200 פתרון חסימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 0.1 גרם של פוליפוניל מסיסים במים, המבוססים על אלכוהול, על בסיס Mucoadhesive / mL ל- 25% (w / v) גליצרול ב 0.1 M Tris-HCl (pH 8.5) . מחממים ל 50 מעלות צלזיוס תחת תסיסה רציפה במשך שעה 1, להתקרר, ולהתאים את ה- pH 8.0-8.5 באמצעות 1M NaOH. הימנע ריכוז גבוה NaOH. הוסף 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​N- propylgallate ו thimerosal לריכוז סופי של 0.02% (w / v). מערבבים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. זהירות: Thimerosal הוא רעיל. טפל בה בהתאם לתקנות הבטיחות המקומיות והגנת הסביבה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים את המדידה הטבעה צינורות 50 מ&quot;ל, לאזן את הרוטור, צנטריפוגה ב 3,200 xg וטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. מוציאים את הפתרון הברור לתוך צינורות 15 מ&quot;ל וזורקים את גלולה. Aliquot ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות. פעם מופשר, לשמור על הפתרון ב 4 ° C. חם עד 30 ° C מיד לפני השימוש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו כמו שקופיות זכוכית רבים כמו מסננים עם explants הם להיות מותקן. בשביל זה, דבק שני coverslips קטן, 18 x 18 מ&quot;מ, משני צדי השקופית זכוכית באמצעות דבק מיידיות, השאירו שטח ~ 15 מ&quot;מ עבור המסנן בין. </li></ol> 4. קיבוע ו מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת תרבויות של 3ימים במבחנה (div), להסיר את הצלחות מן האינקובטור בזהירות לשאוב את המדיום תרבות מכל היטב באמצעות micropipette. הקפד לא לגעת במסנן ולשמור את קצה הפתיחה לעבר הקיר של הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μL של PFA 4% / PBS לכל טוב. מסננים יהיה לצוף על מקבע. באמצעות micropipette, בזהירות להוסיף את dropwise מקבע PFA להטביע את המסננים. לדגור בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. הערה: עבור כל השלבים הבאים, יש להקפיד לא לשטוף את explants מהמסנן. שמור על פתיחת קצה פיפטה לכיוון הקיר של הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את PFA ולשטוף פעמיים עם 500 μL של PBS, שקוע המסנן. הוסף 500 μL של פתרון permeabilization היטב כל דגירה בטמפרטורת החדר למשך 1 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמיים עם 500 μL של PBS ולהוסיף 500 μL של פתרון חסימה היטב כל אחד. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 1 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את פתרון החסימה באמצעות250 μL של biichinated Dolichorus ביפלורוס agglutinin מדולל 1: 200 ב חסימה פתרון ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון dichichorus biflorus agglutinin ולשטוף פעמיים עם 500 μL של PBS לכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μL של streptavidin Alexa488 מצומדות בדילול 1: 200 ב חסימה פתרון ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לחלופין, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות. הערה: יחס אות טוב יותר לרעש מושגת כאשר מודגרת ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמיים עם 500 μL של PBS לכל טוב. באמצעות מלקחיים, להעביר את המסננים על שקופיות זכוכית מוכן, עם explants פונה כלפי מעלה. הר עם ~ 50-100 μL של המדידה הטבעה. מכסים עם 60 מ&quot;מ אורך מס &#39;1.5 coverslips. אפשר פתרון בינוני הטבעה כדי לחזק במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר בחושך. המשך לדמיה או לאחסן את השקופיות, עטוף בנייר כסף, ב 4 ° C עד מוכן התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה עם מיקרוסקופ epifluorescence widefield 7 &lt;/ Sup&gt; מצמידים למנורת Hg ולהשתמש ביחידת מראה עבור עירור כחול (bandpass עירור, 460 - 495 ננומטר, מראה dichromatic, 505 ננומטר, ו bandpass פליטה, 510 - 550 ננומטר) ו 20x עדשות תוכנית אפוכרומט, 0.75 נומרית צוֹהַר. </li></ol>

<ol><li>Saxén, L. <a target="_blank" href="http://admin.cambridge.org/fk/academic/subjects/life-sciences/cell-biology-and-developmental-biology/organogenesis-kidney">Organogenesis of the kidney. Developmental and Cell Biology Series</a>. 19, Cambridge University Press. (1987).</li>
<li>Lindström, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+%CE%B2-catenin%2C+BMP%2C+PTEN%2C+and+Notch+signalling+patterns+the+nephron%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Integrated β-catenin, BMP, PTEN, and Notch signalling patterns the nephron.</a> eLife. 4, e04000(2015).</li>
<li>Peuckert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+Eph%2FEphrin+signaling+controls+several+phases+of+urogenital+development%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Multimodal Eph/Ephrin signaling controls several phases of urogenital development.</a> Kidney Int. 90 (2), 373-388 (2016).</li>
<li>Pasquale, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eph+receptor+signalling+casts+a+wide+net+on+cell+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Eph receptor signalling casts a wide net on cell behaviour.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (6), 462-475 (2005).</li>
<li>Bonanomi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ret+Is+a+Multifunctional+Coreceptor+that+Integrates+Diffusible-+and+Contact-Axon+Guidance+Signals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ret Is a Multifunctional Coreceptor that Integrates Diffusible- and Contact-Axon Guidance Signals.</a> Cell. 148 (2), 568-582 (2012).</li>
<li>Brown, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Culture+of+Cells+from+the+Nephrogenic+Zone+of+the+Embryonic+Mouse+Kidney%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney.</a> J Vis Exp. (50), e2555(2011).</li>
<li>Olympus Support. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.olympusamerica.com/cpg_section/cpg_archived_product_details.asp?id=817">http://www.olympusamerica.com/cpg_section/cpg_archived_product_details.asp?id=817</a> (2016).</li>
<li>Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jez.1401300207/abstract">Inductive interaction in the development of the mouse metanephros.</a> J Exp Zool. 130, 319-340 (1955).</li>
<li>Saxén, L., Toivonen, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nlmcatalog/38101">Primary Embryonic Induction</a>. , Academic Press. London. (1962).</li>
<li>Saxén, L., Koskimies, O., Lahti, A., Miettinen, H., Rapola, J., Wartiovaara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+kidney+mesenchyme+in+an+experimental+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Morphog%22%5BJournal%5D)">Differentiation of kidney mesenchyme in an experimental model system.</a> Adv Morphog. 7, 251-293 (1968).</li>
<li>Dudley, A. T., Godin, R. E., Robertson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+FGF+and+BMP+signaling+pathways+regulates+development+of+metanephric+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Interaction between FGF and BMP signaling pathways regulates development of metanephric mesenchyme.</a> Genes Dev. 13, 1601-1613 (1999).</li>
<li>Perälä, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sema4C-Plexin+B2+signalling+modulates+ureteric+branching+in+developing+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Sema4C-Plexin B2 signalling modulates ureteric branching in developing kidney.</a> Differentiation. 81 (2), 81-91 (2011).</li>
<li>Thesleff, I., Ekblom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+transferrin+in+branching+morphogenesis%2C+growth+and+differentiation+of+the+embryonic+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+exp+Morph%22%5BJournal%5D)">Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney.</a> J Embryol exp Morph. 82, 147-161 (1984).</li>
<li>Watanabe, T., Costantini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analysis+of+ureteric+bud+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Real-time analysis of ureteric bud branching morphogenesis.</a> Dev Biol. 271, 98-108 (2004).</li>
<li>Sebinger, D. D. R., Unbekandt, M., Ganeva, V. V., Ofenbauer, A., Werner, C., Davies, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel%2C+Low-Volume+Method+for+Organ+Culture+of+Embryonic+Kidneys+That+Allows+Development+of+Cortico-Medullary+Anatomical+Organization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Novel, Low-Volume Method for Organ Culture of Embryonic Kidneys That Allows Development of Cortico-Medullary Anatomical Organization.</a> PLoS One. 5 (5), e10550(2010).</li>
<li>Ekblom, P., Miettinen, A., Virtanen, I., Wahlström, T., Dawnay, A., Saxén, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+segregation+of+the+metanephric+nephron%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro segregation of the metanephric nephron.</a> Dev Biol. 84 (1), 88-95 (1981).</li>
<li>Davies, J. A., Unbekandt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA-mediated+RNA+interference+in+embryonic+kidney+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">siRNA-mediated RNA interference in embryonic kidney organ culture.</a> Methods Mol Biol. 886, 295-303 (2012).</li>
<li>Saxén, L., Lehtonen, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3328727">Embryonic kidney in organ culture.</a> Differentiation. 36 (1), 2-11 (1987).</li>
<li>Bard, J. B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+mouse+kidney+embryogenesis+writ+small%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">The development of the mouse kidney embryogenesis writ small.</a> Curr Opin Genet Dev. 2, 589-595 (1992).</li>
<li>Davies, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+cold+storage+and+transport+of+viable+embryonic+kidney+rudiments%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">A method for cold storage and transport of viable embryonic kidney rudiments.</a> Kidney Int. 70 (11), 2031-2034 (2006).</li>
<li>Batourina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distal+ureter+morphogenesis+depends+on+epithelial+cell+remodeling+mediated+by+vitamin+A+and+Ret%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Distal ureter morphogenesis depends on epithelial cell remodeling mediated by vitamin A and Ret.</a> Nat Genet. 32 (1), 109-115 (2002).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כתב יד זה מתאר שיטה לבודד את metanphric anlagen המתפתח מעובר העכבר ולתרבות את יסודות האורגן. שיטה זו היא טכניקה סטנדרטית, כפי שפותחה על ידי Grobstein 8 ו Saxén 9 , 10 , ו הותאם ו שונה על ידי רבים אחרים 11 , 12 . ההצלחה של השיטה תלויה בעיקר על משך הניתוח, כמו הישרדות אקספלנט וירידה פוטנציאלית אינדוקטיבי עם זמן לנתיחה ממושכת. יש להקפיד גם לא ל...

כליית היונקים נגזרת משני מבנים קדמוניים שמקורם מזודרמלי: ניצן השופכן האפיתל הצינורי והמזנכימה המטאנפרית במהלך נפרוגנזה, ניצן השופכן פולש למזנכימה המטאנפרי ולענפים כדי ליצור את מערכת האיסוף. המזנכימה המטאנפרית מולידה את יסודות האפיתל של הנפרונים. תהליכים אלה מתרחשים באופן מתוזמן ומתואם מרחבית במדויק ומופעלים על ידי מנגנונים אינדוקטיביים הדדיים. שני מרכיבי הרקמה מתקשרים ומשפיעים על מורפוגנזה התא של האחר. 
בשנות ה-20 של המאה ה-20, היה זה בוידן שביצע את החסימה in vivo של הצינור המזונפרי בעוף, וסיפק את האינדיקציה הראשונה לאינטראקציות אינדוקטיביות כאשר בלסטמה נפרית מופרדת לא מצליחה להבדיל1. בערך באותו זמן, פורסמו הניסיונות המוצלחים הראשונים לתרבת יסודות נפריים של עוף בטיפה תלויה. לאחר מכן, פותחה תרבית האיברים כדי לחקור אינטראקציות רקמות באורגנוגנזה של יונקים. בשנות ה-50 של המאה ה-20 פיתח גרובשטיין טכניקה שבה ניתן לתרבת יסודות מטאנפריים על מסנן. טכניקה זו שונתה על ידי Saxén, שהציב את המסנן על מסך מסוג Trowell ב-dish1. במהלך השנים הופיעו שינויים ויישומים רבים לתרבית איברים. השיטה המתוארת כאן מבוססת על הטכניקה של סקסן אך מפושטת, שכן המסננים צפים בחופשיות על המדיום וקוטר התרבית עולה רק במעט על קוטר המסנן, מה שמגביל את התנועה הלא רצויה של המסנן.
תרבית איברים שלמים היא כלי קלאסי, זול ופשוט אך רב עוצמה לחקר תהליכים תאיים ותקשורת בין-תאית במהלך אורגנוגנזה. תרבית איברים מאפשרת טיפול בגורמים ביולוגיים, כגון גורמי גדילה, נוגדנים, אוליגונוקלאוטידים אנטיסנס, וירוסים ופפטידים, כמו גם בתרכובות פרמצבטיות וכימיקלים אחרים. כמו כן, ניתן לחקור את תפקוד הגנים באמצעות צמחים שמקורם בעכברים מהונדסים גנטית או באמצעות טכנולוגיית השראה של השראה, כגון מערכת Cre-loxP. זה מאפשר לחקור מוטציות גנטיות הגורמות לקטלניות עוברית לפני התפתחות הכליה. ניתן לשלב תרבית איברים גם עם תיוג פלואורסצנטי לתפקוד גנים או מעקב אחר שושלת וטכניקות הדמיה מודרניות, המאפשרות ניטור בזמן אמת של התנהגות התא2.
בדוגמה הספציפית שניתנה כאן, נבדקה ההשפעה של איתות קולטני Eph המופעל על ידי EphrinB2 על המורפולוגיה המסועפת של ניצן השופכה. המורפולוגיה של עכברי EphA4/EphB2 עם נוקאאוט כפול הצביעה על מספר פגמים חמורים בהתפתחות הכליות, שניתן היה לזהות כבר ביום העוברי 11 (E11) וכללו את ניצן השופכן, השופכן וה<צינור הנפרי המשותף class='xref'>3. איתות באמצעות קולטני Eph דורש אשכול של קולטן הליגנד4. כדי להפעיל יתר על המידה את איתות Eph, יסודות הכליות מעוברי עכברים E11.5 תורבבו בנוכחות EphrinB2-FC רקומביננטי מקובץ. EphrinB2 הוא ליגנד ידוע לקולטן EphA4, המתבטא בקצות ניצני השופכה3.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21331020</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>תוסף GlutaMAX תרמו</td><td>פישר Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, סידן, מגנזיום</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14040117</td><td>שימוש לדיסקציה</td></tr><tr><td>הולו-טרנספרין אנושי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0665</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין-טרנספרין-סלניום (ITS -G) (100x)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41400045</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>תמיסת סיגמא-אולדריץ'</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>אמפוטריצין B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>תימרוסל</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T5125</td><td></td></tr><tr><td>פרופיל גלאט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>2370</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>ביוטינילאט, דוליקורוס ביפלורוס אגלוטינין</td>, <td>מעבדות וקטור</td><td>B-1035</td><td></td></tr>, <tr><td>Alexa488 סטרפטווידין מצומד</td><td>ג'קסון מחקר חיסוני</td><td>016-540-084</td><td></td></tr><tr><td>עכבר רקומביננטי אפרין-B2 FC חלבון כימרה, CF</td><td>R& D Systems</td><td>496-EB</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי IgG1 Fc, CF</td><td>מו"פ D Systems</td><td>110-HG-100</td><td></td></tr><tr><td>עז אנטי אנושי IgG Fc נוגדנים</td><td>R& D Systems</td><td>G-102-C</td><td></td></tr><tr><td>טבליות מלח חוצצות פוספט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>לשימוש לקיבוע וצביעה חיסונית</td></tr><tr><td>Dumont #5, biologie tips, INOX, 11 ס"מ</td><td>agnthos.se</td><td>0208-5-PS</td><td>דרושים 2 זוגות מלקחיים</td></tr><tr><td>מספריים לאיריס, ישרים, 12 ס"מ</td><td>agnthos.se</td><td>03-320-120</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים חבישה, ישר, עדינים, 13 ס"מ</td><td>agnthos.se</td><td>08-032-130</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי Nunclo Delta מטופל</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150679</td><td></td></tr><tr><td>TMTP01300 מסנן ממברנה איזופור, פוליקרבונט, הידרופילי, 5.0 ומיקרו; m, 13 מ"מ, לבן, רגיל</td><td>MerckMillipore</td><td>TMTP01300</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Multidish 4 בארות, תחתית שטוחה</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6789-1CS</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית כיסוי מיקרוסקופ בעובי 24 x 50 מ"מ. מס' 1.5H 0.17+/- 0.005 מ"מ</td><td>nordicbiolabs</td><td>107222</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי משקפיים מס' 1.5, 18 מ"מ x 18 מ"מ</td><td>nordicbiolabs</td><td>102032</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות ~ 76 x 26 x 1, 1/2-w. טחון רגיל</td><td>nordicbiolabs</td><td>1030418</td><td></td></tr><tr><td>סכיני גילוח</td><td>VWR VWR</td><td>55411-055</td><td></td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td> CLS430828 <td></td></tr><tr><td>15 מ"ל</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>CLS430055</td><td></td></tr><tr><td>נייר סינון איכותי קפל מראש, כיתה 113V, סיגמא-אולדריץ</td><td>'</td><td>WHA1213125</td><td></td></tr><tr><td>מחקר בשלב קבוע מירקוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td>BX61WI</td><td></td></tr><tr><td>שחור 6 עכברים מולדים, זכר, C57BL/6NTac</td><td>Taconic</td><td>B6-M</td><td></td></tr><tr><td>שחור 6 עכברים מולדים, נקבה, C57BL/6NTac</td><td>Taconic</td><td>B6-F</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאו Greenough</td><td>Leica Leica</td><td>S6 E</td><td></td></tr></tbody></table>

דיספציה ותרבות של כליה עובריים עכבר

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

המטרה של פרוטוקול זה הוא לתאר שיטה לנתיחה, בידוד, ותרבות של עכברים metanephric עכבר. במהלך התפתחות הכליות של היונקים, שני רקמות האב, הניצן השופכן והמטנפיך המזנכי, מתקשרים ומפעילים מנגנונים סלולריים כדי ליצור בסופו של דבר את מערכת האיסוף ואת הנפרונים של הכליה. כמו עוברי יונקים לגדול תוך הרחם ולכן הם בלתי נגישים הצופה, תרבות איבר פותחה. בשיטה זו, ניתן ללמוד אינטראקציות אפיתל- mesenchymal והתנהגות הסלולר במהלך כליה אורגנוזה. יתר על כן, מקורם של כליות מולדות ומומים פגומים בדרכי השתן. לאחר דיסקציה זהיר, את metanphric rudiments מועברים על מסנן כי צף על המדיום תרבות והוא יכול להישמר בתרבות החממה לתא במשך מספר ימים. עם זאת, צריך להיות מודע לכך התנאיםמלאכותי יכול להשפיע על חילוף החומרים ברקמות. כמו כן, החדירה של חומרי הבדיקה יכול להיות מוגבל בשל המטריצה ​​תאיים וממברנה קרום הנוכחי אקספלנט. אחד היתרונות העיקריים של תרבות האיברים הוא שהניסויים יכולים לקבל גישה ישירה לאורגן. טכנולוגיה זו היא זולה, פשוטה, ומאפשרת מספר רב של שינויים, כגון הוספת חומרים פעילים ביולוגית, מחקר של גרסאות גנטיות, ויישום טכניקות הדמיה מתקדמות.

כליות metanphric כליות נגזרו עכברים בהריון שחור -6 inbred ב E11.5 ו היו מתורבתים. לאחר 3 ימים, הניצן השופכן הסתעף עד 5 פעמים, וכתוצאה מכך ההשלכה של ניצן טנטורי בצורת T בתחילה. כל אקספלנט צולם, ומספרי המקטעים ונקודות הקצה נמדדו כדי לקבוע את הדורות המסתעפים ולחשב את מספר נקודות הקצה לכל ענף ( איור 1 ). ( Rd), הדור הרביעי הגיע רק ל 8% - מהמטופלים שהשתתפו במחקר, בהשוואה ל - 35% מקבוצת הביקורת ( איור 1 ב</s...

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד ו culturing raniments metanephric מעוברים העכבר.

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

המטרות הכלליות של פרוצדורה זו הן לבודד ולתרבת נבטי מטנפריס (metanephric rudiments) מעוברי עכבר, ולבחון את ההשפעות של טיפולים ספציפיים על מורפולוגיית ההסתעפות של ניצן השתן (ureteric bud). שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח באורגנוגנזה של הכליה בנוגע לבקרת המורפוגנזה של הסתעפותו של הצינור, לגבי אינטראקציות בין אפיתל למזנכימה, ובנוגע למקורם של מומים מולדים. היתרונות המרכזיים של טכניקה זו הם שהיא מאפשרת גישה ישירה לאיבר; ושהיא פשוטה, זולה וניתנת לשינוי בקלות.לפני תחילת הניתוח, השתמשו בפינצטה סטרילית כדי להניח בזהירות מסנן ממברנה מפוליקרבונט בעלת נקבים בגודל 5 מיקרומטר בכל באער של פלטה בעלת ארבעה באערים המכילה 500 microliters של מצע גידול טרי. העבירו את הפלטה לאנקובטור לתרביות תאים. לאחר מכן, השתמשו בסכין גילוח כדי לחתוך כ-30 טיפים של מיקרופיפט בגודל 100 microliter, במרחק של כמילימטר אחד מקצה הטיפ, כדי להרחיב את פתחי הטיפים, והחזירו את הטיפים למעמד הטיפים.כאשר הטיפים מוכנים, הניחו עובר ביום עוברי 11 1/2 בתוך PBS תחת מיקרוסקופ דיסקציה. השתמשו בצלחת נקייה עבור כל עובר. ובאמצעות פינצטה של שעון מספר 5, גזרו את העובר ישירות מתחת לרגליים הקדמיות.בשלב הבא, אחזיקו את הרגליים עם זוג פינצטות אחד והשתמשו בזוג פינצטות שני כדי להסיר את רקמת הרגליים. הסירו את הזנב באופן דומה, והשתמשו בקצות ה

dissection-and-culture-of-mouse-embryonic-kidney

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

בדו"ח זה אנו מתארים שיטה לבידוד והתרבות של נישה הקדמון התא הכליות עכבר עובריים שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד מסלולי איתות ויסות גזע / ובתאים של הכליה המתפתחת. אלו תאים בתרבית נגישים מאוד מולקולה קטנה וטיפול חלבון רקומביננטי, והוא חשוב גם התמרה ויראלית, המאפשרת מניפולציה יעילה של המסלולים מועמד.

בידוד והתרבות של תאים מאזור nephrogenic של הכליה עכבר עובריים

שיטה המאפשרת מניפולציה תרופתי ישירה של עוברי עכברים במהלך neurulation עוקף מטבוליזם אימהית מתואר. הטכניקה ניתן להתאים ללמוד היבטים שונים של neurulation על ידי שינוי נקודת זמן סוכן תרופתי.

Tube סגירת עצבית בתרבות העובר שלם עכבר

סרטון זה מתאר את השיטה לבידוד גלומרולי שלם מכליות עכבר. הגלומרולי העטוף והמכוסה המתקבל כך יכול לשמש גם לטיפוח גידולי תאי אפיתל קודקודיים מהכליה המורין.

בידוד גלומרולי: טכניקה להשגת גלומרולי שלם מכליה מורין

סרום מנוצל בתרבויות עובר מכיל מרכיבים לא ידועים שיכול להשפיע על התוצאה של ניסויים במיוחד במחקרים שכלל אינטראקציות איתות. כאן אנו מנוצלים מערכת תרבות מחומצן בסרום ללא ולהראות שעוברי עכברים באמצע ההריון תרבותי ל16-40 שעה להפגין פיתוח מורפולוגיים דומה לעוברים המתפתחים ברחם.

עכבר עוברי פיתוח במערכת סרום ללא תרבות שלמה עובר

נוירונים דופמינרגיים ממלאים תפקיד ויסות חיוני במוח. אובדן שלהם קשור למחלת פרקינסון. בסרטון זה, אנו מראים כיצד ליצור תרביות ראשוניות של נוירונים דופמינרגיים מרכזיים ממזנספלון של עכברים עובריים. תרבויות כאלה שימושיות לחקר הפגיעות הקיצונית של נוירונים אלה ללחצים שונים.

יסודי תרבות של עכבר דופאמין נוירונים

אנו מציגים שיטה בידוד והתרבות של צינור העכבר Wolffian (WD). אנחנו גם מדגימים נוהל מפורט immunostaining הר שלם של WDS תרבותי / טרי מבודד עם נוגדנים מתויג fluorescently. יחד, טכניקות אלו מאפשרים את חקר התפתחות WD, התפתלות, והבחנה.

תרבות איברים שלמים הר Immunofluorescence מכתים של עכבר Wolffian צינוריות

רקמות מהונדסים בונה כליות לספק פתרון מצוקת איברים, השפעות מזיקות של דיאליזה. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מיקרו לנתח הכליות מאתר עבור בידוד של מקטעי מדולרי-cortico. מקטעים אלה מושתלים לתוך המבנים לגרדום ללא הסלולר, ויוצרים organoids כליות.

Microdissection של מקטעי רקמת הכליה העיקרי, התאגדות עם טכנולוגיית הרומן לבנות בפיגומים-חופשית

כאן, אנחנו מציגים בטכניקה המיקרוכירורגית הרומן על בידודו של תאי גזע עצביים מ E13 העכבר עובר ganglionic קדושתו.

בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים עובריים בעכבר

מאמר זה מתאר שיטה עבור culturing וניתוח החוצה הקודקוד הקודקודית תא האפיתל של פקולי כדורית מבודדים מכליה העכבר. שיטה זו יכולה לשמש לחקר מסלולים המעורבים התפשטות התא הקודקודית והגירה.

בלתי מימדית כמו לשעבר שיטת Vivo לנתח מסלולים מעורב הקודקוד הקודקודית התא ההפעלה

עבודה זו מתארת שתי שיטות למחקר התפתחות איברים, התקנה משופרת xenotransplantation שתלת על ממברנה כוראולאנטואית (CAM) מעוברי העופות המאפשר vascularization של איברים עובריים ואורגנואידים הרומן קבוע z-כיוון שיטת תרבות האיברים עם תנאים ניסיוני שונה המאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה מיקוד הזמן.

אופטימיזציה של כליות אורגאיד ותרבות אורגנותית לvascularization, פיתוח מורחב והדמיה מיקרוסקופית משופרת

למדו לבודד ולגדול רודימנטים מטנפריים מעוברי עכברים לחקר אורגנוגנזת כליות. שיטה זו מאפשרת מעקב אחרי התפצלות ניצני השופכן והבנת מומים מולדים בביולוגיה התפתחותית.

דיספציה ותרבות של כליה עובריים עכבר

גלה סרטונים נוספים