Name: הבדל Chondrocytes מ היקפי דם הנגזרות האדם תאים Pluripotent Pluripotent Induced (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: למדו פרוטוקול ליצירת כונדרוציטים מתאי דם היקפי אנושיים דרך iPSCs. השיטה כוללת יצירת גופי עובריים, התפשטות תאים פיברובלסטיים והבדלות כונדרוגנית בתנאי ללא סרום וללא קסנו.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לזיאובין ג&#39;אנג על הפלסמיד שלו. אנו מודים גם שאורונג גאו ו Qianfei ואנג על עזרתם סוג במהלך הניסוי. מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (No.81101346, 81271963, 81100331), פרויקט הכשרונות הגבוהים בבייג&#39;ינג 215 (No.2014-3-025), ובית החולים צ&#39;או-יאנג בבייג&#39;ינג (לא . CYXX-2017-01), ואת הנוער החדשנות לקידום האגודה של האקדמיה הסינית למדעים (YL).

פרוטוקול הדור של hiPSCs מ PBCs ניתן למצוא במחקר הקודם שלנו 5 . המחקר אושר על ידי המוסד לביקורת מוסדית של המוסד שלנו. 1. גבריות גוף (גיבוש) גיבוש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע 50 מ&quot;ל של המדיום hiPSC: נוקאוט Dulbecco השתנה בינוני בינוני (DMEM) בתוספת 15% החלפת נוקאאוט בסרום (KSR), 5% בסרום שור עוברית (FBS), 1 × חומצות אמינו לא חיוניות, 55 מיקרומטר 2-mercaptoethanol, 2 מ&quot;מ L - glutamine, ו 8 ng / mL בסיסי fibroblast גורם הצמיחה (bFGF). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 50 mLof בינוני היווצרות EB: DMEM בתוספת KSR 15%, 5% FBS, 1x חומצות אמינו חיוניות, 55 מיקרומטר 2-mercaptoethanol, ו 2 מ&quot;מ L- גלוטמין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 50 מ&quot;ל של המדיום התרבות הבסיסית: DMEM בתוספת 20% FBS, 1 × חומצות אמינו לא חיוניות, 55 מיקרומטר 2-mercaptoethanol, ו 2 מ&quot;מ L- גלוטמין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 מ&quot;ל של פתרון dispase, 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב נוקאאוט DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CultuRe hiPSCs על 60 מ&quot;מ צלחות תרבות רקמה עם תאים מזין ( כלומר, monolayer של תאים עובריים fibroblast עובריים עכבר). כאשר התאים הם 80-90% confluent, disassociate התאים עם dispase ומעבר hiPSCs 1: 3 כל 4-5 ימים. מניחים את התאים לתוך 37 ° C ו 5% CO 2 חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את מושבות hiPSC לא מובחן לחתיכות קטנות יותר (כ 50-100 מיקרומטר בקוטר) באמצעות מחט זכוכית מצוירת באש כאשר iPSCs הם 80-90% ומחוברות. בדרך כלל, להשתמש מושבות hiPSC בצלחת 60 מ&quot;מ לייצר EBS צלחת 100 מ&quot;מ פטרי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות פחות מ 100 חתיכות קטנות של מושבות צלחת 100 מ&quot;מ, לא חסיד פטרי המכיל 10 מ&quot;ל של המדיום היווצרות EB. מניחים את הכלים לתוך 37 ° C ו 5% CO 2 חממה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף כ 25% של המדיום הראשוני עם כמות שווה של המדיום התרבות הבסיסית כל 2 ימים. להטות את המנה לתת EBs להתיישב. הסר בזהירות 3 מ&quot;לשל המדיום העליון ומוסיפים 4 מ&quot;ל של מדיום בינוני טרי. אין להפריע EBS. הערה: EBs מאופיינים מורפולוגית על ידי פיסות המושבות, לוקח על מראה עגול עם הגבולות החלקים מתחת למיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 10 ימים של תרבות בצלחת פטרי לא חסיד, מעיל חדש 100 מ&quot;מ צלחת רקמה תרבות עם 4 מ&quot;ל של ג&#39;לטין 0.1% למשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את המדיום בתוספת EBS מ 100 מ&quot;מ, צלחת פטרי חסין לצינור חרוטי 15 מ&quot;ל. תן משקעים EBS במשך 4-5 דקות. לשאוב supernatant בזהירות ולהשאיר פחות מ 0.5 מ&quot;ל של מדיום בתוספת EBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע פחות מ -100 EBS על 100 מ&quot;מ, צלחת גלאטין מצופה רקמות תרבות עם 10 מ&quot;ל של המדיום התרבות הבסיסית. מניחים את הכלים לתוך 37 ° C ו 5% CO 2 חממה. </li></ol> 2. תא גלולה גיבוש בידול chondrocyte <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 10 מ&quot;ל של 0.25% טריפסין / ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA). הפוך 80 מ&quot;ל של basאל תרבות בינוני: DMEM בתוספת 20% FBS, 1x חומצות אמינו חיוניות, 55 מיקרומטר 2-mercaptoethanol, ו 2 מ&quot;מ L- גלוטמין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 10 מ&quot;ל של המדידה בידול chondrogenic: DMEM (גלוקוז גבוהה) בתוספת 10% אינסולין- transferrin- סלניום פתרון (ITS), 0.1 מיקרומטר dexamethasone, 1 mM חומצה אסקורבית, 1% pyruvate נתרן, ו 10 ng / mL שינוי גורם הצמיחה, בטא 1 (TGF-β1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רענן את המדיום עם 10 מ&quot;ל של המדיום התרבות הבסיסית לאחר 48 שעות. לאחר מכן, לרענן את המדיום כל שלושה ימים עם 10 מ&quot;ל של המדיום התרבות הבסיסית. הערה: לאחר 10 ימים בתרבית, תאי תאים fibroblastic צריך התרחב EBS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמל 100 מנות מ&quot;מ עם 4 מ&quot;ל של ג&#39;לטין 0.1% למשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש. מחק supernatant התא לשטוף את התאים עם Dulbecco של פוספט שנאגרו מלוחים (DPBS) פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכל את התאים עם 3 מ&quot;ל של 0.25% טריפסין / EDTA ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לנטרל עם 4 מ &#39;L בינוני בינוני. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את התאים לתוך תאים בודדים על ידי pipetting מעלה ומטה 5-10 פעמים והעברת אותם דרך רשת ניילון 70 מיקרומטר. צנטריפוגה ההשעיה התא ב XG 200 במשך 5 דקות. Re- זרע התאים על 100 מ&quot;מ חדש, צלחת גלאטין מצופה רקמות תרבות עם 10 מ&quot;ל של המדיום התרבות הבסיסית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רענן את המדיום עם 10 מ&quot;ל של המדיום התרבות הבסיסית לאחר 48 שעות. לאחר מכן, לרענן את המדיום כל שלושה ימים עם 10 מ&quot;ל של המדיום התרבות הבסיסית. הערה: התאים לרכוש מורפולוגיה הומוגנית, דמוי fibroblast. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר ~ 90-100% מפגש הוא הגיע ( כלומר, כ 5-7 ימים), למסוק את התאים עם 3 מ&quot;ל של 0.25% טריפסין / EDTA ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לנטרל עם 4 מ&quot;ל של המדיום התרבות הבסיסית. לנתק את התאים לתוך תאים בודדים על ידי pipetting למעלה ולמטה 5 פעמים. השתמש hemocytometer לספור את מספר התא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 3 x 10 5 תאים בצינור פוליפרופילן 15 מ&quot;ל. צנטריפוגה ב 200 xgבמשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). Re- להשעות את התאים 1 מ&quot;ל של המדידה בידול chondrogenic. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש צנטריפוגה התאים ב XG 300 במשך 3 דקות ולשמור על התאים בצורת גלולה קטנה. שים את הצינור לתוך 37 ° C ו 5% CO 2 חממה במשך 21 ימים. אין לדפוק את המכסה בחוזקה ולאפשר את החלפת הגז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף 3/4 של המדיום תרבות כל שלושה ימים עם בינוני בידול chondrogenic טריים. הערה: לאחר 21 ימים בתרבות, hiPSC-chondrogenic pellets (hiPSC-Chon) צריך להיווצר. תאי גזע mesenchymal האדם, כמו שליטה חיובית, נאספים גם תרבותי במדיום בידול chondrogenic במשך 21 ימים כדי ליצור כדורי chondrogenic (hMSC-Chon). </li></ol> 3. ניתוח של דיפרנציאציה chondrogenic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 מ&quot;ל של 10% נייטרלית שנאגרו פורמלין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50 מ&quot;ל של מגיב כחול alcian 0.1% ו 50 מ&quot;ל של מגיב 1% toluidine כחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יחסי ציבורEpare 1 מ&quot;ל של הנוגדנים העיקריים: נוגדנים פוליקלוניים ארנב נגד קולגן II (1:50) או נוגדנים עכבר מונוקלונליים נגד קולגן X (1:50). כמו כן, להכין אנטי ארנב או נוגדנים משניים העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 1 מ&quot;ל של פתרון papain: 10 U / מ&quot;ל ​​ב PBS עם 0.1 M אצטט אצטט, 2.4 מ&quot;מ EDTA, ו 5 מ&quot;מ L- ציסטאין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 100 מ&quot;ל dimethylmethylene כחול (DMMB) פתרון צבע: 100 μL של 16 מ&quot;ג / L 1,9-dimethylmethylene כחול, 40 מ&quot;מ גליצין, 40 מ&quot;מ NaCl, ו 9.5 מ&quot;מ HCL; PH 3.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכת בידול chondrogenic ידי כתמים כחולים alcian ו toluidine כתמים של קטעים גלולה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן אחד hiPSC-chon גלולה או hMSC-Chon גלולה ב 1 מ&quot;ל של 10% נייטרלי שנאגרו פורמלין במשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את גלולה ל 1 מ&quot;ל של 70% אתנול ב H 2 O. להתייבש גלולה עם 1 מ&quot;ל של סדרת אתנול מדורגים ( כלומר, 25, 50, 75, 90, 95, 100, ו 100%, 3 דקות כל אחד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבהיר את גלולה ב 1 מ&quot;ל של קסילן 100% שלוש פעמים. מסתנןדואר גלולה עם פרפין עבור 1 שעות בתנור 65 מעלות צלזיוס. הטבעת את גלולה בלוקים פרפין עם 7 x 7 x 5 מ&quot;מ 3 עובש הבסיס, לאחר הליכים היסטולוגיים שגרתית 6 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך סעיפים סמוכים על ידי microtome עם עובי של כ 4 מיקרומטר 7 . דבק את החלקים על גבי שקופיות זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש את השקופיות עבור 2 שעות ב 60 מעלות צלזיוס בתנור. Deparaffinize הסעיפים בשלושה מחזורים (3 דקות כל אחד) באמצעות 100% xylene. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בסדרה אלכוהול הפחתת עבור התייבשות ( כלומר, 100, 100, 95, 95, 70, 50, ו 25% H 2 O, 3 דקות כל אחד) ולאחר מכן לבצע שטיפה הסופי עם מים deionized במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם את הסעיפים עם 0.1% alcian כחול מגיב או 1% מכתים toluidine כחול במשך 4-5 שעות ולאחר מכן לשטוף אותם עם מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתייבש עם סדרת אתנול מדורגת ( כלומר, 25, 50, 75, 90, 95, 100, ו 100%, 3 דקות כל אחד) ואחריו שלושה ברציפות רחובEps של הבהרה ב 100% xylene. הרכוב שקופיות לדמיין אותם תחת מיקרוסקופ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע אימונוהיסטוכימיה. הערה: חלקים נוספים גלולה מוערכים נוספת על ידי אימונוהיסטוכימיה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר deparaffinization ו rehydration, להביא את השקופיות לרתיחה ב 1 מ&quot;מ EDTA, pH 8.0 (עמיד למים במים מבושל על ידי החיטוי). תן להם לשבת במשך 8 דקות בטמפרטורה רותחים תת ולאחר מכן לאפשר את השקופיות להתקרר ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את השקופיות עם מים deionized 3 פעמים. דגירה הסעיפים ב 3% H 2 O 2 פתרון מתנול ב RT במשך 15 דקות לחסום פעילות peroxidase אנדוגני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את השקופיות עם מים deionized ו לטבול אותם DPBS במשך 5 דקות. החל 50-100 μL של נוגדן ראשוני בדילול נאות (1:50) העיקרי על החלקים על השקופיות ולאחר מכן דגירה אותם בחדר humidified ב RT עבור 1 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את השקופיות 3 פעמים (5 דקות כל אחד) עם DPBS. דגירה saדגימות עם נוגדנים המשניים המקביל ( כלומר, נגד ארנבת או עכבר) במשך 15 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את השקופיות 3 פעמים (במשך 5 דקות כל אחד) עם DPBS. בצע זיהוי DAB תחת מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את השקופיות עם DPBS 3 פעמים (2 דקות כל אחד). Counterstain גרעיני התא על ידי שקוע את השקופיות hematoxylin במשך 1-2 דקות. להתייבש עם סדרת אתנול מדורגת (25, 50, 75, 90, 95, 100, ו 100%, 3 דקות כל אחד) ואחריו שלושה שלבים רצופים של הבהרה עם קסילן. לבסוף, הר שקופיות לדמיין אותם תחת המיקרוסקופ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי תוכן sGAG. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכל כדורי chondrogenic בפתרון papain ב 60 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת תוכן ה- DNA באמצעות ערכת assay dsDNA ומערכת fluorometer. למדוד את התוכן sGAG על ידי ערבוב זה עם פתרון DMMB צבע תחת מדידה absorbance ב 525 ננומטר 8 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב הריכוז של sGAG נגד עקומת תקן שלכריש גופרית כונדרואיטין. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את ניתוח ה- PCR בזמן אמת של סמנים בידול chondrogenic ב hiPSC-chon pellets. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר 3-4 של כדורי chondrogenic אותו על ידי הוספת 500 μL של מגיב החילוץ הקרה לצינור אחד. וורטקס ביסודיות. דגירה המדגם במשך 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.1 מ&quot;ל של כלורופורם. וורטקס המדגם עבור 15 ים ו לדגור אותו RT למשך 3 דקות. צנטריפוגה המדגם במשך 15 דקות ב XG 12,000 ו 4 ° C. מעבירים את השלב מימית העליון (כ 250 μL) לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 μL של אצטט נתרן ו 1 μL של גליקוגן למדגם. להאיץ את RNA על ידי ערבוב זה עם 250 μL של אלכוהול איזופרופיל. מערבבים היטב. דגירה המדגם ב RT במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 12,000 XG ו 4 ° C. הסר את supernatant לחלוטין. לשטוף את גלולה רנ&quot;א פעמיים עם 500 μL של 75% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 5 דקותב 7,500 XG ו 4 ° C. הסר את כל אתנול שאריות האוויר יבש את גלולה RNA עבור 5-10 דקות. ממיסים את רנ&quot;א 10 μL של מים ללא nuclease. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרת RNA לתוך cDNA באמצעות מערכת transcriptase הפוכה. נושא דגימות cDNA ל- PCR בזמן אמת באמצעות שילוב QPCR מאסטר הורים (2x) ומערכת PCR בזמן אמת 9 . הערה: רצפי הפריימר הם: H AGGRECAN -F: TCGAGGACAGGGAGGCCCC; H AGGRECAN -R: TCGAGGGTTAGTGTTAGAGAGAA; H β- ACTIN -F: TTTGAATGATGAGCCTTCGTCCCC; H β- ACTIN -R: GGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGC; H COL2 -F: TGGACGATCAGGCGAAACC; H COL2 -R: GCTGCGGATGCTCTCAATCT; H SOX9 -F: AGCGAACGACATCAAGAC; H SOX9 -R: CTGTAGGCGATCTGTTGGGG; H COL10- F: ATGCTGCCACAAATACCCTTT; שעה COL10 -R: GGTAGTGGGTTTATGCCT. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Diekman, B. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+tissue+engineering+using+differentiated+and+purified+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Cartilage tissue engineering using differentiated and purified induced pluripotent stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (47), 19172-19177 (2012).</li>
<li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134 (5), 877-886 (2008).</li>
<li>Loh, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human blood.</a> Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).</li>
<li>Zhang, X. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+reprogramming+of+human+peripheral+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Proteomics+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Cellular reprogramming of human peripheral blood cells.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (5), 264-274 (2013).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+blood+cells+into+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+new+cell+source+for+cartilage+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of blood cells into induced pluripotent stem cells as a new cell source for cartilage repair.</a> Stem Cell Res Ther. 7 (31), (2016).</li>
<li>Canene-Adams, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry.</a> Methods Enzymol. 533, 225-233 (2013).</li>
<li>Solchaga, L. A., Penick, K. J., Welter, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenic+differentiation+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells%3A+tips+and+tricks%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chondrogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells: tips and tricks.</a> Methods Mol Biol. 698, 253-278 (2011).</li>
<li>Oldershaw, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+toward+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human embryonic stem cells toward chondrocytes.</a> Nat Biotechnol. 28 (11), 1187-1194 (2010).</li>
<li>Monje, L., Varayoud, J., Luque, E. H., Ramos, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+exposure+to+bisphenol+A+modifies+the+abundance+of+estrogen+receptor+alpha+transcripts+with+alternative+5%27-untranslated+regions+in+the+female+rat+preoptic+area%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Neonatal exposure to bisphenol A modifies the abundance of estrogen receptor alpha transcripts with alternative 5'-untranslated regions in the female rat preoptic area.</a> J Endocrinol. 194 (1), 201-212 (2007).</li>
<li>Teramura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+mesenchymal+progenitor+cells+with+chondrogenic+property+from+mouse-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reprogram%22%5BJournal%5D)">Induction of mesenchymal progenitor cells with chondrogenic property from mouse-induced pluripotent stem cells.</a> Cell Reprogram. 12 (3), 249-261 (2010).</li>
<li>Su, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+integration-free+ips+cells+from+human+adult+peripheral+blood+using+BCL-XL+together+with+Yamanaka+factors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of integration-free ips cells from human adult peripheral blood using BCL-XL together with Yamanaka factors.</a> PLoS One. 8 (5), e64496(2013).</li>
<li>Carey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+factor+stoichiometry+influences+the+epigenetic+state+and+biological+properties+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 9 (6), 588-598 (2011).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+nonviral+method+to+generate+integration-free+human-induced+pluripotent+stem+cells+from+cord+blood+and+peripheral+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells.</a> Stem Cells. 31 (3), 458-466 (2013).</li>
<li>Staerk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+peripheral+blood+cells+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).</li>
<li>Qu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenic+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+in+chondrocyte+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chondrogenic differentiation of human pluripotent stem cells in chondrocyte co-culture.</a> Int J Biochem Cell Biol. 45 (8), 1802-1812 (2013).</li>
<li>Guzzo, R. M., Gibson, J., Xu, R. H., Lee, F. Y., Drissi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+iPSC-derived+mesenchymal+stem+cells+to+chondroprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human iPSC-derived mesenchymal stem cells to chondroprogenitor cells.</a> J Cell Biochem. 114 (2), 480-490 (2013).</li>
<li>Koyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+differentiated+into+chondrogenic+lineage+via+generation+of+mesenchymal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells differentiated into chondrogenic lineage via generation of mesenchymal progenitor cells.</a> Stem Cells Dev. 22 (1), 102-113 (2013).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+insulin-transferrin-selenium+in+auricular+chondrocyte+proliferation+and+engineered+cartilage+formation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of insulin-transferrin-selenium in auricular chondrocyte proliferation and engineered cartilage formation in vitro.</a> Int J Mol Sci. 15 (1), 1525-1537 (2014).</li>
<li>Guzzo, R. M., Scanlon, V., Sanjay, A., Xu, R. H., Drissi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+cell+type-specific+iPS+cells+with+enhanced+chondrogenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Establishment of human cell type-specific iPS cells with enhanced chondrogenic potential.</a> Stem Cell Rev. 10 (6), 820-829 (2014).</li>
<li>Goepfert, C., Slobodianski, A., Schilling, A. F., Adamietz, P., Portner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+engineering+from+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Biochem+Eng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cartilage engineering from mesenchymal stem cells.</a> Adv Biochem Eng Biotechnol. 123, 163-200 (2010).</li>
<li>Ingber, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+and+developmental+biology%3A+going+biomimetic%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering and developmental biology: going biomimetic.</a> Tissue Eng. 12 (12), 3265-3283 (2006).</li>
<li>Yoshida, Y., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+stem+cell+advances%3A+induced+pluripotent+stem+cells+for+disease+modeling+and+stem+cell-based+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration.</a> Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).</li>
</ol>

למחברים אין מה לגלות.

כאן, אנו מספקים פרוטוקול כדי ליצור chondrocytes מ PBCs באמצעות iPSCs. מכיוון שתוכניות PBC נפוצות יותר ונמצאות בשימוש נרחב בתחום הקליני, הן מוצגות כחלופה פוטנציאלית לתכנות מחדש. במחקר זה, נוקבים וקטורים (EV) שימשו כדי לתכנת מחדש PBCs לתוך iPSCs, בעקבות השיטה שנקבעה על ידי ג &#39;אנג et al. 11 . גישה זו נטולת אינטגרציה אינה כוללת שילוב של גנוטוקסיטיזם הקשור לנגיף, אשר מאמינים כי יש לו השפעה רחבה בתחום הקליני 12 , <s...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/55722/differentiating-chondrocytes-from-peripheral-blood-derived-human">Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells</a>.
The corresponding author was updated from:
Yueying Li 
yueyinglee2010@hotmail.com 
Key Laboratory of Genomic and Precision Medicine, Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences
The corresponding author is now listed as:
Tie Liu 
waterkins@163.com 
Department of Orthopedics, Beijing Chao-Yang Hospital, Capital Medical University

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/55722/differentiating-chondrocytes-from-peripheral-blood-derived-human">Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells</a>.

Erratum: Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

רקמת הסחוס יש יכולת ירודה מאוד לתיקון עצמי התחדשות. התערבויות כירורגיות שונות וטיפולים ביולוגיים משמשים כדי לשחזר סחוס פונקציה משותפת, עם תוצאות לא מספקות. הפיתוח האחרון של טכנולוגיית תא גזע עשוי לשנות את השדה תיקון סחוס כולו 1 . תאי גזע שונים נחקרו כתאי זרע, אך תאי גזע מושרים אנושיים (hiPSCs) להיראות הבחירה המבטיחה ביותר, כפי שהם יכולים לספק סוגים רבים של תאים ספציפי חולה מבלי לגרום לתגובות דחיית 2. יתר על כן, הם יכולים להתגבר על הטבע השגשוג המוגבל של תאים בוגרים ולשמור על התחדשות עצמית ויכולות pluripotent שלהם. יתר על כן, מיקוד גנטי יכול לשמש כדי לשנות את הגנוטיפ כדי לקבל סוגים מסוימים של chondrocytes. Fibroblasts כבר בשימוש נרחב כדי ליצור iPSCs כי הפוטנציאל שלהם תכנות מחדש יש גם נחקרו היטב.עם זאת, יש עדיין כמה מגבלות שיש להתגבר, כגון ביופסיה כואבת מן המטופלים ואת הצורך הרחבה במבחנה של fibroblasts, אשר עלול לגרום מוטציות גנים 3 . לאחרונה, PBCs נמצאו להיות יתרון עבור תכנות מחדש 4 ; יתר על כן, הם היו בשימוש נפוץ מאוחסן בשפע. זה אפשרי כי הם עשויים להפנות את המחקר להתמקד מן העור. עם זאת, למיטב ידיעתנו, ישנם כמה דוחות על תכנות מחדש PBC ואחריו בידול לתוך chondrocytes. במחקר הנוכחי, אנו משתמשים PBCs כמקור חלופי על ידי תכנות מחדש אותם לתוך iPSCs ולאחר מכן הבדל iPSCs לתוך השושלת chondrogenic באמצעות מערכת התרבות גלולה על מנת לחקות היווצרות chondrocyte.

<table><tbody><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829018</td><td>מדיום בסיסי המשמש לתרבית hiPSC ומדיום היווצרות EB</td></tr><tr><td>החלפת סרום נוקאאוט (KSR)</td> <td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td>תוסף בינוני מוגדר יותר, נטול FBS, המשמש לתרבית hiPSC ומדיום היווצרות EB</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td> <td>Hyclone</td><td>sh30070.03</td><td>משמש לתרבית hiPSC ומדיום היווצרות EB, מציע ערך מצוין לתאים תרבית</td></tr><tr><td>חומצות אמינו לא חיוניות</td><td>Chemicon</td><td>TMS-001-C</td><td>משמש כתוסף גדילה בכל מדיום תרבית התאים, להגברת צמיחת התאים וחיוניותם</td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Invitrogen</td><td>TMS-002-C</td><td>חומצת אמינו הנדרשת לתרבית תאים</td></tr><tr><td>גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>A ציטוקין המשמש לשמירה על הפלוריפוטנטיות והחידוש העצמי של hiPSCs</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Invitrogen</td><td>17105041</td><td>משמש לדיסוציאציה של hiPSC לתת-תרבות</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>C11960</td><td>מדיום בסיסי המשמש לתרבית MSC</td></tr><tr><td>מדיום 0.1% ג'לטין</td><td>Millipore</td><td>ES-006-B</td><td>משמש לחיבור תאים על הכלים</td></tr><tr><td>0.25% טריפסין/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td>משמש לדיסוציאציה של</td></tr><tr><td>תאים DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td>תמיסת מלח מאוזנת המשמשת לשטיפת תאים או ריאגנט להכנת</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>invitrogen</td><td>21985023</td><td>משמש כתוסף גדילה בכל מדיום תרבית התאים.</td></tr><tr><td>ITS</td><td>invitrogen</td><td>41400045</td><td>תמיסת אינסולין, טרנספרין, סלניום.משמש להתמיינות כונדרוגנית.</td></tr><tr><td>חומצה אסקורבית</td><td>Sigma</td><td>4403</td><td>ידוע בשם ויטמין C. זה עוזר בצמיחה פעילה ובעל תכונות נוגדות חמצון.</td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>גיבקו</td><td>11360070</td><td>נוסף למדיום תרבית תאים כמקור אנרגיה בנוסף לגלוקוז.</td></tr><tr><td>גורם גדילה טרנספורמטיבי-בטא 1</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-21C</td><td>A ציטוקין המווסת את התפשטות התאים, צמיחה והתמיינות כונדרוגנית.</td></tr><tr><td>נוגדנים רב-שבטיים של ארנב נגד קולגן II</td><td>Abcam</td><td>ab34712</td><td>נוגדן זה מגיב עם קולגנים מסוג II, שהוא ספציפי לרקמות סחוסיות.</td></tr><tr><td>נוגדנים חד שבטיים של עכבר לקולגן X</td><td>Abcam</td><td>ab49945</td><td>נוגדן זה מגיב עם קולגן מסוג X, שהוא תוצר של כונדרוטוציטים היפרתרופיים.</td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td>להרכבה ואחסון לטווח ארוך של שקופיות</td></tr><tr><td>Toluidine blue</td><td>Sigma</td><td>89640</td><td>משמש לזיהוי פרוטאוגליקנים.</td></tr><tr><td>Alcian blue</td><td>Amresco</td><td>#0298</td><td>משמש לזיהוי גלוקוזאמינוגליקנים.</td></tr><tr><td>פפאין</td><td>סיגמא</td><td>P4762-25MG</td><td>משמש לעיכול כדורים כונדרוגניים.</td></tr><tr><td>דימתילן כחול</td><td>סיגמא</td><td>341088-1G</td><td>משמש לכימות גליקוזאמינוגליאנים</td></tr><tr><td>כונדרויטין סולפט מלח נתרן מסחוס כריש</td><td>סיגמא</td><td>C4384-250MG</td><td>משמש לשרטוט העקומה הסטנדרטית למדידת תכולת sGAG.</td></tr><tr><td>ערכת בדיקת Qubit dsDNA HS</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851 (100)</td><td>משמש לקביעת תכולת ה-DNA</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>משמש לבידוד RNA מתאים</td></tr><tr><td>מערכת טרנסקריפטאז הפוך</td><td>Promega</td><td>A3500</td><td>משמש להמרת RNA ל-cDNA</td></tr><tr><td>SYBR FAST ערכת qPCR Master Mix</td><td>Kapa</td><td>KK4601</td><td>משמש ל-PCR בזמן אמת</td></tr></tbody></table>

הבדל chondrocytes מ היקפי דם הנגזרות האדם תאים pluripotent pluripotent induced

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

במחקר זה, השתמשנו בתאי דם היקפיים (PBCs) כתאי זרע כדי לייצר chondrocytes באמצעות תאי גזע pluripotent המושרה (iPSCs) בשיטה ללא אינטגרציה. לאחר גדילה של הגוף (EB) והתפשטות תאים fibroblastic, iPSCs הם המושרה עבור בידול chondrogenic במשך 21 ימים תחת סרום ללא תנאים ללא xeno. לאחר אינדוקציה chondrocyte, פנוטיפים של התאים מוערכים על ידי ניתוח מורפולוגי, immunohistochemical, וביוכימי, כמו גם על ידי כמותי בזמן אמת PCR בדיקה של סמנים בידול chondrogenic. את chondrogenic pellets להראות חיובי alcian כחול כחול toluidine מכתים. אימונוהיסטוכימיה של קולגן II ו- X מכתים הוא גם חיובי. תכולת ה- glycosaminoglycan (sGAG) וה- chondrogenic differentiation markers, COLLAGEN 2 ( COL2 ), COLLAGEN 10 ( COL10 ), SOX9 ו- AGGRECAN מוגברות באופן משמעותי ב- chondכדורי rogenic לעומת hiPSCs ותאי fibroblastic. תוצאות אלו מראות כי PBCs ניתן להשתמש בתאי זרע כדי ליצור iPSCs עבור תיקון הסחוס, שהוא החולה ספציפי וחסכוני.

בידול Chondrogenic של hiPSCs: EB בינוני בינוני בינוני בינוני שימשו כדי להבדיל את hiPSCs לתוך השושלת mesenchymal. שיטה רב תרבותית שלב שימש ( איור 1 ). ראשית, hiPSCs נבדלו באופן ספונטני באמצעות היווצרות EB במשך 10 ימים (D10, איור 2 א ). שנית, תאים נעלמו מן EBS עוד 10 ימים (D10 + 10). במהלך שני ...

אנו מציגים פרוטוקול ליצירת השושלת chondrogenic מן הדם ההיקפי האנושי (PB) באמצעות תאי גזע pluripotent המושרה (iPSCs) בשיטה ללא אינטגרציה, הכוללת גבריות הגוף (EB) היווצרות, הרחבת תאים fibroblastic, אינדוקציה chondrogenic.

הבדל Chondrocytes מ היקפי דם הנגזרות האדם תאים Pluripotent Pluripotent Induced

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להפיק תאי שושרה כונדרוגנית מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושראים (IPS cells) שנגזרו מדם פריפריאלי אנושי. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום רגנרציית הסחוס בנוגע לשימוש בתאי דם פריפריאליים מהחולה כתאים מקור עבור הפקת תאי IPS לתיקון סחוס. היתרונות המרכזיים של טכניקה זו הם שהיא ניתנת לשחזור בקלות, והדיפרנציאציה של הכונדרוציטים מתרחשת בתנאים נטולי סרום וגורמים זרים (xeno-free).התחילו בפיזור תאי IPS אנושיים ב-4 milliliters של מצע human IPSC על צלחת תרבית רקמות של 60 millimeter המכילה שכבה אחת של תאי מזינים של פיברובלסטים עובריים של עכבר שהוקרנו. תרבתו את התאים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius וב-5% carbon dioxide. כאשר תאי הגזע מגיעים ל-80 עד 90 אחוזי התמזגות (confluency), הפרידו את התאים באמצעות תמיסת dispace לצורך תת-תרבית.לאחר שני עד שלושה מעברים, השתמשו במחט זכוכית שנמשכה באש כדי להפריד את מושבת ה-IPSC הבלתי מובחנת, בעלת התמזגות (confluency) של 80 עד 90 אחוזים, לרסיסים קטנים יותר, והעבירו לא יותר מ-100 חתיכות של תרבית תאים לכלי פטרי חדש, לא-נדבק, בנפח 100 מילימטר, המכיל 10 מיליליטר של מצע להיווצרות גופי עובר (embryoid body formation medium). דיסוציאציה מכנית עדיפה על עיכול אוטומטי כיוון שהיא מפחיתה את הנזק לתאים ברסיסים הקטנים המועברים למכלי התרבית החדש, ומבטיחה סילוק ידני של תאי המזינים (feeder cells), המדכאים את בידולה של תאי IPS אנושיים. החזירו את תאי ה-IPS האנושיים לאנקובטור לתרבית תאים.לאחר יומיים, הגה את הצלחת כדי לאפשר לגופי העובר (embryoid bodies) לשקוע, והחלש בזהירות שלושה מיליליטר של מדיום ליצירת גופי עובר בארבעה מיליליטר של מדיום תרבית בסיסי טרי. לאחר 10 ימים, גופי העובר ייווצרו. צפה צלחת חדשה של 100 מילימטר בארבעה מיליליטר של 0.1 אחוז ג'לטין למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.העבירו את הגופי העובריים (embryoid bodies) יחד עם הנוזל העליון למבחנה קונית של 15 מיליליטר, והמתינו ארבע עד חמש דקות עד שהגופים ישקעו. שאבו את כל התוך מלבד 0.5 מיליליטר האחרונים, ושספו מחדש את הגופים העובריים ב-10 מיליליטר של תוך גידול בסיסי טרי. כאשר הג'לטין התגבש, השליכו את הג'לטין.לאחר מכן, זרע את התאים על הצלחת המצופה ג'לטין, והכנס את הצלחת לאינקובטור לתרבית תאים. לאחר 10 ימים בתרבית, הגופים העובריים (embryoid bodies) יבדילו לשלוחות של תאים פיברובלסטיים. כדי להשרות בידול לתאי סחוס (chondrocytes), שטוף את התרבית ב-DPBS ונתק את התאים באמצעות 3 mL של 0.25% trypsin EDTA בטמפרטורה של 37 °C למשך חמש דקות.כאשר התאים התנתקו מהתחתית של הפיתה, נטרלו את התגובה בעזרת 4 milliliters של מצע גידול בסיסי טרי, ובצעו טיטרציה עדינה של התרבית 5 עד 10 פעמים. סננו את תרחף התאים דרך מסננת רשת ניילון של 70-micron, ואספו את התאים על ידי סבב צנטריפוגה. לאחר מכן, זרעו את התאים על פיתה חדשה של 100 millimeter מצופה ג'לטין, ב-10 milliliters של מצע גידול בסיסי טרי.כאשר התרבית מגיעה ל-90 עד 100 אחוזים של התמזגות (confluency), קצרו את התאים באמצעות 3 mL של 0.25% trypsin EDTA, כפי שהודגם קודם לכן לצורך ספירה. העבירו מנה של 3×10⁵ תאים לתוך מבחנה פוליפרופילן של 15 mL לצורך סבב צנטריפוגה. השעיקו מחדש את המשקע ב-1 mL של מצע בידול כונדרוגני.לאחר מכן, סבב את התאים שוב בצנטריפוגה, והנח את המבחנה באינקובטור לתרביות תאים למשך 21 ימים מבלי להפריע למשקע. תאים כונדרוגניים עשויים להתארגן in vitro ולהפיק מטריצות חוץ-תאיות אופייניות כאשר הם נמצאים בתנאי תרבית בצפיפות גבוהה. לאחר 21 ימים בתרבית, ייווצר משקע כונדרוגני של תאי IPS אנושיים.לאחר 21 ימי תרבית, תאי ה-IPSC האנושיים בעלי הפוטנציאל לכונדרוגנזה הם חיוביים לצביעות alcian blue ו-toluidine blue, דבר המעיד עלהצלחתה של דיפרנציאציה כונדרוגנית של כדורית (pellet) ה-HIPSC. אנליזה אימונוהיסטוכימית עבור collagen two ו-collagen 10 מאשרת עוד יותר את הפנוטיפ דמוי-כונדרוציט שלהם. אנליזה של glycosaminoglycan מסולפט רשמית כי תכני ה-glycosaminoglycan המסולפטים של התאים מועלים באופן משמעותי בכדוריות כונדרוגניות של IPSC אנושי, בהשוואה לתאי IPSC אנושיים דמויי פיברובלסטים, גופי Embryoid ותאי IPS אנושיים לא מובחנים.יתרה מכך, תאי סחפון גזורים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (human IPSC) מראים רמה גבוהה של ביטוי גנים של שושלת תאי מקור לסחפון ומסמנים של כונדרוציטים מובחנים במלואם, מה שמעיד על השגת בידוד כונדרוגני מוצלח. שיטת תרבית רב-שלבית המשמשת להבחנה של human IPSCs לכונדרוציטים, הכוללת הבחנה ספונטנית באמצעות היווצרות גופי גומי (EB), צמיחת תאים מ-EBs, תרבית תאים בשכבה אחת (monolayer) לאחר תרבית תאים, ותרבית פלט (pellet) תלת-ממדית. הפנוטיפ של הכונדרוציטים מוערך באמצעות אנליזה היסטולוגית, אנליזה ביוכימית וביטוי גנים כונדרוגני.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי אופן השימוש בשיטת תרבית רב-שלבית להשראת גבול של תאי IPS אנושיים לכנדרוציטים. טכניקה זו עשויה להיות מותאמת יותר למטופל וכלכלית יותר.

differentiating-chondrocytes-from-peripheral-blood-derived-human

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

המאמר מתאר את המתודולוגיה מפורטת להבחין ביעילות תאי גזע pluripotent אנושיים לשריר לב על ידי באופן סלקטיבי ויסות מסלול Wnt, ואחרי ניתוח cytometry זרימה של סמני התייחסות להעריך הומוגניות וזהותה של האוכלוסייה.

בידול יעילות גבוה של תאי גזע pluripotent האדם לשריר לב ואפיון על ידי cytometry הזרימה

לחץ מכני יכול לגרום להתמיינות כונדרוגנית של תאי גזע, ולספק גישה טיפולית פוטנציאלית לתיקון סחוס פגום. אנו מציגים פרוטוקול לגרימת התמיינות כונדרוגנית של תאי גזע שמקורם בשומן (ASCs) באמצעות כבידה צנטריפוגלית (CG). ויסות מוגבר המושרה על ידי CG של SOX9 מביא להתפתחות פנוטיפים כונדרוגניים.

Chondrogenic בידול האינדוקציה של תאי גזע שמקורם שומן על ידי הכביד צנטריפוגלי

כאן, אנו מציגים pluripotent האנושי פרוטוקולים התרבות תאי גזע (hPSC), נהגו להבדיל hPSCs לתוך CD34+ אבות hematopoietic. שיטה זו משתמשת ספציפיות שלב מניפולציה של חגיגת הקנוני איתות לציין תאים באופן בלעדי לתוכנית או סופית או פרימיטיבי hematopoietic.

ביים הבידול של אבות Hematopoietic פרימיטיבי, מהווים הסופית מתאי גזע Pluripotent אנושי

כאן, אנו מציעים פרוטוקול לבידול chondrogenic מ דם טבורי mononuclear תאים נגזר האדם המושרה בתאי גזע pluripotent.

Chondrogenic גלולה היווצרות דם טבורי הנגזרות Pluripotent תאים גזעיים

אנו מציעים פרוטוקול זה מראה כיצד להבדיל keratinocytes נגזר תאי גזע pluripotent המושרה ו fibroblasts וליצור תא צורב של העור תלת-ממד באמצעות אלה keratinocytes ו fibroblasts. פרוטוקול זה מכיל צעד נוסף של יצירת מודל humanized עכברים. הטכניקה המובאת כאן תשפר את המחקר דרמטולוגית.

דור של תא צורב עור תלת-ממד של כבל דם-derived המושרה בתאי גזע Pluripotent

המטרה של פרוטוקול זה היא לבחון את היכולת של ובתאים נגזר רקמת שומן perivascular האדם להתמיין שושלות תאים מרובים. בידול היה לעומת גזע mesenchymal הנגזרות מח אנושי, אשר ידועה להבדיל לתוך adipocyte, osteocyte ו- chondrocyte שושלות.

בידול קיבולת של האדם-אבי העורקים Perivascular שומן ובתאים

מוצג כאן פרוטוקול פשוט להתמיינות מכוונת של תאי אנדותל המוגני מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים תוך כשבוע.

התמיינות מכוונת של תאי אנדותל המוגניים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

פרוטוקול זה מתאר ומשווה שתי שיטות מייצגות להבחנה של hiPSCs לתאי סטרומה מזנכימליים (MSCs). השיטה החד-שכבתית מאופיינת בעלות נמוכה יותר, תפעול פשוט יותר ובידול אוסטאוגני קל יותר. שיטת הגופים העובריים (EBs) מאופיינת בצריכת זמן נמוכה יותר.

השוואה בין שתי שיטות מייצגות להתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם לתאי סטרומה מזנכימליים

פרוטוקול זה מציג את ההתמיינות של אוסטאוקלסטים אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) ומתאר שיטות לאפיון אוסטאוקלסטים ומבשרי אוסטאוקלסט.

התמיינות ואפיון אוסטאוקלסטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

פרוטוקול זה מפרט את הבידוד של כונדרוציטים, כונדרופרוגניטורים שמקורם בבדיקת הידבקות פיברונקטין (FAA-CPs), וכונדרופרוגניטורים נודדים (MCPs) מסחוס מפרקי אנושי. הוא מכסה עיכול אנזימטי, הידבקות פיברונקטין ומבחנים מבוססי נדידה לבידוד ואפיון תאים אלה.

בידוד כונדרוציטים וכונדרופרוגניטורים באמצעות הידבקות פיברונקטין ובדיקת נדידה

מחקר זה מתאר שיטה לייצור ספרואידים כונדרוציטיים על ידי צבירת תאים לספרואידים בתנאי הדבקה נמוכה באמצעות כוח הכבידה, ולאחר מכן תרבית את הספרואידים המתקבלים במיני-ביוריאקטורים.

יצירת ספרואידים מכונדרוציטים שונים בתנאי הדבקה נמוכה תחת כוח הכבידה ומיני ביוריאקטורים תוצרת בית

למדו פרוטוקול ליצירת כונדרוציטים מתאי דם היקפי אנושיים דרך iPSCs. השיטה כוללת יצירת גופי עובריים, התפשטות תאים פיברובלסטיים והבדלות כונדרוגנית בתנאי ללא סרום וללא קסנו.

הבדל Chondrocytes מ היקפי דם הנגזרות האדם תאים Pluripotent Pluripotent Induced

גלה סרטונים נוספים