הבדל Chondrocytes מ היקפי דם הנגזרות האדם תאים Pluripotent Pluripotent Induced

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור תאי שושלת כונדרוגניים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים שמקורם בדם היקפי אנושי, או תאי IPS. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות המפתח בתחום התחדשות הסחוס לגבי שימוש בתאי דם היקפיים שמקורם בחולה כתאי C ליצירת תאי IPS לתיקון סחוס. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא ניתנת לשחזור בקלות, והתמיינות הכונדרוציטים מתרחשת בסרום ובתנאים נטולי קסנו.

התחל בציפוי תאי IPS אנושיים במדיום IPSC אנושי של ארבעה מיליליטר על צלחת תרבית רקמה בגודל 60 מילימטר המכילה שכבה אחת של תאי הזנה פיברובלסטים עובריים של עכברים מוקרנים. תרבו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחמישה אחוזים של פחמן דו חמצני. כאשר תאי הגזע הם 80 עד 90 אחוז מתלכדים, נתק את התאים עם תמיסת דיספייס לתת-תרבות.

לאחר שניים עד שלושה מעברים, השתמש במחט זכוכית הנמשכת באש כדי לנתח את מושבת ה-IPSC הבלתי מובחנת של 80 עד 90 אחוז לשברים קטנים יותר, ולהעביר לא יותר מ-100 חתיכות תרבית תאים לצלחת פטרי חדשה בגודל 100 מילימטר המכילה 10 מיליליטר של מדיום היווצרות גוף עוברי. דיסוציאציה מכנית עדיפה על עיכול אוטומטי מכיוון שהיא מפחיתה את הנזק לתאים לשברי תאים קטנים שיועברו למיכל התרבית החדש, ומכריזה על סילוק ידני של תאי ההזנה, המדכאים את התמיינות תאי ה-IPS האנושיים. החזר את תאי ה- IPS האנושיים לחממת תרבית התאים.

לאחר יומיים, הטה את המנה כדי לתת לגופי העובר להתייצב, והחלף בזהירות שלושה מיליליטר של מדיום היווצרות הגוף העוברי בארבעה מיליליטר של מדיום תרבית בסיס טרי. לאחר 10 ימים ייווצרו גופים עובריים. מצפים צלחת חדשה של 100 מילימטר בארבעה מיליליטר של 0.1 אחוז ג'לטין למשך 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס.

העבירו את הגופים העובריים עם הסופרנטנט לתוך צינור חרוטי של 15 מיליליטר, ותנו לגופים להתייצב במשך ארבע עד חמש דקות. שאפו את כל המדיום מלבד 0.5 מיליליטר האחרונים, והשעו מחדש את הגופים העובריים ב -10 מיליליטר של מדיום תרבית בסיס טרי. כאשר הג'לטין התמצק, השליכו את הג'לטין.

לאחר מכן זרעו את התאים על התבנית המצופה בג'לטין, והניחו את המנה בחממת תרבית התאים. לאחר 10 ימים בתרבית, הגופים העובריים יתמיינו לצמיחת תאים פיברובלסטיים. כדי לגרום להתמיינות כונדרוציטים, שטפו את התרבית עם DPBS ונתקו את התאים בשלושה מיליליטר של 0.25 אחוז טריפסין EDTA ב-37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

כאשר התאים התרוממו מתחתית הצלחת, נטרלו את התגובה עם ארבעה מיליליטר של מדיום תרבית בסיס טרי, וטיטר בעדינות את התרבית חמש עד 10 פעמים. מסננים את תרחיף התאים דרך מסננת רשת ניילון של 70 מיקרון, ואוספים את התאים באמצעות צנטריפוגה. לאחר מכן זרעו את התאים על צלחת חדשה מצופה ג'לטין בגודל 100 מילימטר ב-10 מיליליטר של מדיום תרבית בסיס טרי.

כאשר התרבית מגיעה ל-90 עד 100 אחוז מפגש, קצרו את התאים עם שלושה מיליליטר של 0.25 אחוז טריפסין EDTA כפי שהודגם זה עתה לספירה. העבירו שלוש פעמים 10 למנה החמישית של התאים לצינור פוליפרופילן של 15 מיליליטר לצנטריפוגה. ולהשעות את הגלולה במיליליטר אחד של מדיום התמיינות כונדרוגני.

לאחר מכן, צנטריפוגה שוב של התאים, והנח את הצינור באינקובטור תרבית התאים למשך 21 יום מבלי להפריע לגלולה. תאים כונדרוגניים עשויים להתאסף במבחנה, ולייצר מדדים חוץ-תאיים אופייניים בתנאי תרבית בצפיפות גבוהה. לאחר 21 יום בתרבית, תיווצר גלולה כונדרוגנית של תא IPS אנושי.

לאחר 21 יום של תרבית, התאים הכונדרוגניים של IPSC האנושיים חיוביים לכחול אלציאן וטולואידין בצביעה כחולה, מה שמעיד על התמיינות כונדרוגנית מוצלחת של גלולת HIPSC. ניתוח אימונוהיסטוכימי של קולגן 2 וקולגן 10 מאשש עוד יותר את הפנוטיפ דמוי הכונדרוציטים שלהם. ניתוח גליקוזאמינוגליקן גופרתי מגלה כי תכולת הגליקוזאמינוגליקן הסולפטית של התאים מווסתת באופן משמעותי בכדורים כונדרוגניים של IPSC אנושיים, בהשוואה לתאים דמויי פיברובלסטיים IPSC אנושיים, גופים עובריים ותאי IPS אנושיים לא מובחנים.

יתר על כן, תאים כונדרוגניים IPSC אנושיים מפגינים רמת ביטוי גנים גבוהה של שושלת כונדרופרוגניטור וסמני כונדרוציטים מובחנים לחלוטין, מה שמרמז על השגת התמיינות כונדרוגנית מוצלחת. שיטת תרבית רב-שלבית המשמשת להבדיל IPSCs אנושיים לכונדרוציטים, כולל התמיינות ספונטנית באמצעות היווצרות EB, צמיחת תאים מ-EBs, תרבית תאים חד-שכבתית לאחר תרבית תאים ותרבית גלולה תלת מימדית. הפנוטיפ של הכונדרוציטים מוערך על ידי ניתוח היסטולוגי, ניתוח ביוכימי וביטוי גנים כונדרוגניים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בשיטת תרבית רב-שלבית להשראת התמיינות תאי IPS אנושיים לכונדרוציטים. טכניקה זו יכולה להיות ספציפית יותר למטופל וחסכונית.