משלוח מערכתית של MicroRNA באמצעות וירוס רקומביננטי Adeno-הקשורים Serotype 9 לטיפול מחלות נוירומוסקולריות אצל מכרסמים
10 באוגוסט 2018
כאן נתאר את המסירה של microRNA באמצעות serotype של וירוס רקומביננטי adeno-הקשורים 9 במודל של עכברים של מחלה עצב-שריר. ניהול היקפיים יחידה בעכברים כתוצאה miRNA מתמשכת ביטוי שריר, מוטורי לגלוקוז, מתן הזדמנות טיפולית פוטנציאל vivo בתוךותפקוד miRNA של המחקר.
המטרה הכוללת של שיטה זו היא לבחור ולספק מיקרו-RNA באמצעות וקטור וירוס רקומביננטי הקשור לאדנו. לאחר מכן העבירו אותו לשרירי השלד ולנוירונים מוטוריים של עכברים, ולהעריך את יעילותם בשיפור פנוטיפים של מחלות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על השאלה החשובה האם ניתן להשתמש באסטרטגיית השתקה מבוססת מיקרו-רנ"א לטיפול במצבים עצביים-שריריים.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא השימוש בנגיף סרוטיפ 9 הקשור לאדנו כדי להעביר מיקרו-RNA דרך מחזור מערכתי לחוט השדרה ולשריר השלד של עכברים, כדי להשתיק ישירות גן מטרה. חלקו את מלאי הפלסמיד AAV-microRNA ל-100 עד 200 מיקרוליטר אליקוטים המכילים עומס ויראלי של עשרה עד מאה טריליון גנומים למיליליטר. לאחר מכן, טען אליקוט אחד לתוך מזרק, וחבר מחט בגודל 27 עד 30.
כעת, באמצעות מסנן עכבר רגיל, אבטח עכבר כשזנבו חשוף. לאחר מכן, נקו את הזנב עם 70% אלכוהול והניחו כרית חמה מתחת לזנב למשך כ-30 שניות כדי להגביר את הרחבת כלי הדם. כעת, בחלק הדיסטלי של הזנב, הכנס את המחט לווריד הזנב כשהשיפוע כלפי מעלה ובזווית רדודה, כ-15 מעלות.
לאחר מכן, הזריק את הנגיף והמתן מספר שניות לפני הסרת המחט. לאחר הסרת המחט, הפעל לחץ מתון באמצעות שתי אצבעות כדי לעצור כל דימום. לאחר מכן, החזירו את החיה לכלוב הביתי שלה.
במהלך הזרקת וריד הזנב, אין זה נדיר לראות הבזק של דם במרכז המחט. בזמן ההזרקה, לא אמורה להיות התנגדות. אם הזנב מתחיל להלבין ולהתנפח, הסר את המחט ונסה שוב קרוב למיקום הכניסה הקודם.
עבור בדיקות אלה העכברים צריכים להיות מבוגרים יותר מארבעה שבועות, ולהקפיד לאסוף מדד בסיסי לפני הטיפול. חדר הבדיקה צריך להיות שקט וחשוך ללא הפרעות. הכניסו את העכברים לחדר לפחות 30 דקות לפני ביצוע בדיקות כלשהן.
אל תפריע לבעלי החיים בתקופת התאקלמות זו. התחל במבחן החוט התלוי. הרם את העכבר בזנבו והנח אותו במרכז רשת החוט.
לאחר מכן, הרם את הרשת 15 עד 20 אינץ' והפוך לאט את המסך כדי לתת לעכבר זמן להתאים את אחיזתו. לאחר שהרשת הפוכה לחלוטין, הפעל את הטיימר ורשום את זמן הנפילה. אפשר לעכבר 60 שניות להיתקע, אם הוא נופל מוקדם יותר, החזר אותו לרשת וחזור על ההליך.
אם העכבר נתקע 60 שניות מלאות, רשום 60 שניות לתוצאה והחזר את העכבר לכלוב שלו. אפשר לכל עכבר שלושה ניסיונות למסור 60 שניות. אחרת, השיגו את זמן ההמתנה הארוך ביותר.
לאחר המתת חסד העכבר, קצרו את חוט השדרה ולאחר מכן קצרו את שריר השלד הארבע ראשי. כדי להקפיא את הרקמות שנקטפו, מלאו חצי קערת נירוסטה ב-2-מתילבוטאן וטבלו את הרבע התחתון של הקערה בחנקן נוזלי. המתן שתי דקות לפני שתמשיך.
לאחר מספר דקות, העבירו את הדגימה ל-2-מתילבוטן. כאשר הדגימה הופכת לבנה, העבירו אותה מיד למיכל המוטבע בקרח יבש. מאוחר יותר, אחסן את הדגימה בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס.
לניתוח ביוכימי וכימות מיקרו-RNA, הניחו את הרקמה שנקטפה בקריוביאל והקפיאו אותה בחנקן נוזלי. לאחר מכן, אחסן אותו בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס. לעכברי SBMA הוזרקו מאה טריליון גנומים של AAV microR-298 בגיל חמישה שבועות.
עכברי SBMA נושאים את הטרנסגן של קולטן האנדרוגן האנושי עם מערכת פוליגלוטמין מורחבת באופן חריג. בגיל עשרה שבועות, הם בדרך כלל מפתחים סימנים של מחלה עצבית-שרירית. חוט השדרה המותני ושריר הארבע ראשי נקטפו במספר נקודות זמן לאחר הטיפול לניתוח.
RT-PCR כמותי הראה כי ביטוי המיקרו-R298 הגיע לשיא בשריר השלד לאחר שמונה שבועות, וכי הביטוי הגיע לשיא בחוט השדרה לאחר 12 שבועות. עשרה שבועות לאחר ההזרקה, GFP התגלה בשתי הרקמות. וביטוי GFP במקביל לסמן הנוירונים המוטוריים כולין אצטילטרנספראז.
בניסוי מעקב, העכברים הוזרקו באופן אקראי עם הנגיף, או הרכב, בגיל שבעה שבועות ולאחר מכן נשקלו ונבדקו התנהגותית מדי שבוע, עד גיל 40 שבועות. עשרה שבועות לאחר ההזרקה, העכברים שטופלו החלו לעלות במשקל והחלו להראות ביצועים מוטוריים משופרים. PCR כמותי בזמן אמת גילה כי הטיפול מפחית את רמות תעתיק ה-AR ברקמות הפגועות.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להעביר מיקרו-רנ"א באמצעות וקטור וירוס רקומביננטי הקשור לאדנו באמצעות הזרקת זנב לשווא. וכיצד לבצע בדיקות התנהגותיות שיכולות לעזור להעריך את היעילות של המיקרו-RNA המועבר בשיפור ניוון הגפיים התחתונות וחולשה בעכברים. ההשלכה של טכניקה זו משתרעת על גישות ריפוי גנטי, מכיוון שטיפול גנטי בטוח ויעיל דורש העברה ספציפית של רקמות ממוקדות של הטרנסגן הטיפולי.
הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר הבנו שמחלה הנגרמת על ידי מנגנוני רווח רעילים של תפקוד, כגון SBMA, תועיל על ידי ביטוי יתר של מיקרו-RNA טבעי המכוון במיוחד לתיקון שלושת הראשונים של תעתיק המחלה.
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה להחדרה של microRNA (miRNA) באמצעות וקטור של וירוס אדנו-אסוסיאטי רקומביננטי (rAAV) כדי להגיע לשריר השלד ולנוירונים מוטוריים במודל עכבר של ניוון שרירים ספינלי ובולברי (SBMA). גישה זו נועדה להעריך את היעילות של השתקה גנטית המתווכת על ידי miRNA בשיפור פנוטיפים של מחלות נוירו-מוסקולריות, עם השלכות על טיפול גנטי בהפרעות של תפקוד רעיל שנרכש (toxic gain-of-function).
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- תרפיה גנטית
- מחקר מחלות נוירו-מוסקלריות
- מדעי העצב המולקולריים
רקע
- השתקת RNA באמצעות מסלולי miRNA אנדוגניים מווסתת את ביטוי הגנים באופן פוסט-טרנסקריפציונלי.
- ויסות גנים באמצעות miRNA מהווה אסטרטגיה טיפולית מבטיחה להפרעות נוירולוגיות הנגרמות ממוטציות מסוג "gain-of-function" רעילות.
- הספקה יעילה של miRNAs טיפוליים לרקמות המטרה נותרת אתגר משמעותי.
- SBMA היא מחלה נוירו-שרירית הנגרמת מהתרחבות פוליגלוטמין בגן של רצפטור האנדרוגן (AR).
מטרת המחקר
- לבחון האם ביטוי יתר של miRNA שזוהה לאחרונה כמכוון ל-AR (miR-298) יכול להקל על הפנוטיפים של המחלה בעכברי SBMA.
- להעריך את יעילות ההעברה הסיסטמית של miR-298 באמצעות וקטורי rAAV9.
- להעריך את השפעת miR-298 על רמות התמלול של AR ועל התפקוד הנוירו-מוסקלרי.
שיטות מעבדה שבהן נעשה שימוש
- הכנת וקטורי rAAV9 המקודדים ל-miR-298, המקוצצים להזרקה.
- מתן סיסטמי באמצעות הזרקה לווריד הזנב בעכברי SBMA תוך שימוש במחט בכיול 27–30.
- הערכה התנהגותית באמצעות מבחן תליון החוט להערכת התפקוד המוטורי.
- איסוף רקמות (חוט השדרה ושריר הquadriceps) לצורך אנליזה ביוכימית וכמיות miRNA באמצעות quantitative RT-PCR.
- אימונופלורסצנציה לזיהוי ביטוי GFP ומיקום משותף (co-localization) עם סמני נוירונים מוטוריים.
תוצאות עיקריות
- הזרקה של rAAV9-miR-298 לווריד הזנב הובילה לביטוי-יתר מתמשך ונרחב של miR-298 בשריר השלד ובנוירונים מוטוריים.
- הביטוי של miR-298 הגיע לשיאו בשריר השלד 8 שבועות לאחר ההזרקה ובחוט השדרה 12 שבועות לאחר ההזרקה.
- חלבון הדווח GFP אישר טרנסדוקציה מוצלחת וקו-לוקליזציה עם סמנים של נוירונים מוטוריים.
- עכברי SBMA שטרילו הראו שיפור בעלייה במשקל ובביצועים מוטוריים בהשוואה לקבוצות הביקורת.
- בדיקת Quantitative RT-PCR הדגימה רמות מופחתות של תמלילי AR ברקמות המושפעות לאחר הטיפול.
מסקנות
- מתן סיסטמי של miR-298 באמצעות rAAV9 יעיל במיקוד לשריר השלד ולנוירונים מוטוריים בעכברי SBMA.
- ביטוי יתר של miR-298 משפר פנוטיפים נוירו-שריריים ומפחית את רמות התמלול הפתוגניות של AR.
- גישה זו מדגימה את הפוטנציאל של אסטרטגיות השתקת גנים מבוססות miRNA לטיפול במחלות נוירו-שריריות הנגרמות ממוטציות של תפקוד-רווח רעיל (toxic gain-of-function).
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הגשה סיסטמית של miRNA באמצעות וקטורי rAAV9 מאפשרת השתקה ממוקדת של גנים ברקמות נוירו-משריריות, ובכך נותנת מענה לאתגר מרכזי בהשתקה תרופתית של RNA (RNA interference) עבור הפרעות של gain-of-function רעיל. גישה זו תומכת בביטחון ניבוי לגבי מעורבות המטרה ומדידת התוצאה התפקודית, מה שמשפיע ישירות על החלטות בשלבי הגילוי המוקדמים ובמסלול התרגומי (translational pipeline). יכולתה של השיטה להשיג מודולציה מתמשכת וספציפית לרקמה של גנים גורמי מחלה ממיצה אותה כפלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר לחדשנות בתרפיה גנטית בתיקי מחלות נוירו-משריריות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה ישירה של תפקוד גנים של מחלה באמצעות השתקה מתווכת miRNA in vivo.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הדגמת מעורבות של המטרה ברקמות רלוונטיות.
- מסייע בביטחון חיזוי בבדיקת היפותזות טיפוליות להפרעות נוירו-משריריות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין מודלים של בעלי חיים שעברו תיקוף לבדיקות התנהגותיות ומולקולריות המשך.
- מסטנדרט את ההגשה והכימות של סוכנים להשתקת גנים בין קבוצות ניסוי.
- מאפשר מדידה הדירה של תפקוד מוטורי והפחתה של תמלילים כפלט כמותי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים רלוונטיים למחלה לצורך פיתוח ביומרקרים תרגומיים.
- מספק רצף מגילוי מכניסטי להערכת יעילות פרה-קלינית.
- תומך בקידום מותאם סיכון על ידי קישור בין נקודות קצה מולקולריות ופונקציונליות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטה זו להעברה מערכתית של miRNA מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים, תיקוף המטרה והערכת היעילות הפרה-קלינית במודלים של מחלות נוירומוסקולריות.
- ביולוגיה של הגילוי: מדגים בדיקת היפותזה in vivo והבהרה של מסלולים עבור מטרות עם פגיעה בתפקוד מסוג gain-of-function רעיל.
- סריקה: קובעת את מוכנות הבדיקה והשחזור עבור נקודות קצה התנהגותיות ומולקולריות.
- אנליטיקה: מספקת קריאות RT-PCR כמותיות ונתוני התנהגות להשוואה בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין יעילות השתיקה הגנטית לשיפור תפקודי במערכות הרלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה ניתנת להרחבה להערכה של מועמדי miRNA נוספים או מטרות מחלה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית באסטרטגיות לטיפול גנטי.
- ערך תפעולי: מספק מודולציה גנטית סטנדרטית, ניתנת להרחבה וניתנת לשחזור in vivo.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות לגבי המשך ביצוע (go/no-go) ומשפר את יעילות ההון על ידי קישור בין תוצאות מולקולריות לפנוטיפיות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של מועמדים לטיפול גנטי עבור אינדיקציות נוירו-מוסקולריות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהכנת וקטורים ויראליים ובטכניקות הזרקה in vivo.
- נחוש גישה לתשתיות של בדיקות מולקולריות כמותיות ובדיקות התנהגותיות.
- נדרש סטנדרטיזציה בין-צוותית עבור פרוטוקולי הזרקה, קציר רקמות ואנליזה.
- ייתכן שיהיה צורך בהתאמה עבור רצפי miRNA שונים או מודלים של מחלות.
- מגבלות מעשיות כוללות מינון של הווקטור, ספציפיות לרקמה וניטור ביטוי לטווח ארוך.
