Name: העברת בלוטת החלב ביצירת יכולת בין תאי אפיתל בסל החלב תאים לומיני החלב באמצעות שלפוחיות תאיים / אקסוסומות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: למד בידוד ואפיון של בלוטות חוץ-תאיות ואקסוזומים מתאי אפיתל חלב מזנכימליים. שיטה זו מאפשרת העברת יכולות יצירת בלוטת חלב לתאי אפיתל לומינליים ומספקת כלים לחקר תכונות תאי גזע.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי לחקר הבריאות (05A1-CSPP16-014, HJL) וממשרד המדע והטכנולוגיה (MOST 103-2320-B-400-015-MY3, HJL).

כל המחקרים העוסקים בבעלי חיים עמדו בפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים. 1. שלפוחית ​​תאיים / בידוד exosome ו Validation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים NAMECs 4 , עם מדיום טרי, ללא סרום, עשוי 500 מ&quot;ל של MCDB 170, pH 7.4 + 500 מ&quot;ל של DMEM / F12 עם סודיום ביקרבונט (0.2438%); EGF (5 ng / mL); Hydrocoritisone (0.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל); אינסולין (5 מיקרוגרם / מ&quot;ל); תמצית יותרת המוח (BPE, 35 מיקרוגרם / מ&quot;ל); ו GW627368X (1 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ב 15 ס&quot;מ מנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ספירת התאים עם hemocytometer, זרע 1.2 x 10 6 תאים 12 מ&quot;ל של מדיום לכל צלחת 15 ס&quot;מ ביום 0 במשך 4 ימים 4 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 4 ימים בתרבות, צנטריפוגה בינוני תרבות ב XG 300 במשך 5 דקות באמצעות צנטריפוגה שולחן השולחן. מעבירים את supernatant לצינור חרוטי ( איור 1 ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה supernatantב 2000 xg במשך 20 דקות בצנטריפוגה שולחן למעלה. מעבירים את supernatant לצינור ultracentrifuge ולהשאיר את התאים המתים ואת פסולת התא ( איור 1 ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה supernatant ב XG 10,000 במשך 30 דקות ב 4 ° C. מעבירים את supernatant לצינור ultracentrifuge חדש ( איור 1 ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה supernatant ב XG 110,000 עבור 60 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant ו resuspend EV / גלולה exosome ב PBS ( איור 1 ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה supernatant ב XG 110,000 עבור 60 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant. Resuspend EV / גלולה exosome ב PBS ( איור 1 ). Resuspend גלולה מבודד 240-480 מ&quot;ל של המדיום NAMEC מותנה μL 100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את ריכוז החלבון של ההשעיה EV עם assay חלבון BCA. ודא כי הריכוז הוא סביב 20-40 מיקרוגרם / 100 μL. חנות ב -20 מעלות צלזיוס עבורניתוח נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את הריכוז והגודל של EV / exosomes ידי ניתוח nanoparticle מעקב (NTA), כפי שתואר קודם על ידי Gardiner et al. 11 . לדלל את EVs / exosomes (20 מיקרוגרם / 100 μL) עם PBS ל -10,000 לקפל לניתוח NTA. הערה: תוצאה של ניתוח NTA משקף את מספר וגודל שלפוחית ​​ניתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה EVs / exosomes עם מיקרוסקופיה הילוכים אלקטרונית (TEM), כפי שתואר קודם לכן על ידי Lin et al 4 . </li></ol> 2. Exosome טיהור באמצעות שיפוע צפיפות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את גלולה 110,000 גרם משלב 1.7 ב 40% (w / v) iodixanol ב PBS (2 מ&quot;ל). שכבת התערובת ברצף עם aliquots של 30%, 20%, 10%, ו 5% (w / v) iodixanol ב PBS (2 מ&quot;ל כל אחד) כדי ליצור שיפוע צפיפות בצינור ultracentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התערובת ב XG 200,000 עבור 8 שעות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף כל שברי הדרגתי (10 fractiOns; 1 מ&quot;ל / חלק) עם פיפטה מהחלק העליון של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח נוכחות של סמנים exosome ( למשל, CD81, CD9, CD63, ו Tsg101) בכל חלק על ידי SDS-PAGE 12 כתם המערבי. טען 50-μL השעיות של כל חלק על גבי ג&#39;ל 10% המכיל 0.1% (w / V) SDS ולהפריד את החלבונים שברים עם ג&#39;ל אלקטרופורזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את החלבונים מ ג &#39;ל לקרום PVDF ו דגירה של קרום עם נוגדנים נגד סמנים exosome ( למשל, CD81, CD9, CD63, ו Tsg101) וחלבון GAPDH חלבון לילה ( טבלה של חומרים ) ב 4 ° C. הערה: התוצאה מזהה את החלק המכיל אקסוסומות. </li></ol> 3. שלפוחית ​​תאיים / Exosome תיוג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות את EVs / exosomes, שהושג בשלב 1.7, ב 10 מיקרומטר carboxyfluorescein succinimidyl diacetate אסתר (CFSE) ב 20 מיקרוגרם של חלבון אקסוסומלי / 100 μL. הכן משותף מדגם מקבילNene רק CFSE ו PBS, מעובד באותו אופן, כמו שליטה שלילית עבור מבחני EV / evosake מאוחר יותר. השאירו את תערובות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות את EVs / exosomes בנפח 50x של PBS ו צנטריפוגה ההשעיה ב XG 110,000 עבור 60 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant ו resuspend גלולה EV / exosome ב PBS. חזור על שלב 3.2 פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות את EVs / exosomes ב PBS בריכוז של 20 מיקרוגרם של חלבון אקסוסומלי / 100 μL ולאחר מכן לסנן את EVs / exosomes דרך 0.22 מיקרומטר קרום לפני הוספת EVs / exosomes לתאים. </li></ol> 4. שלפוחית ​​תאיים / Exosome Uptake Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך בינוני תרבות, מערבבים 500 מ&quot;ל של MCDB 170, pH 7.4 + 500 מ&quot;ל של DMEM / F12 עם סודיום ביקרבונט (0.2438%); EGF (5 ng / mL); Hydrocoritisone (0.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל); אינסולין (5 מיקרוגרם / מ&quot;ל); ו BPE (35 מיקרוגרם / מ&quot;ל) 4 . פלייט בתאי HMLE אפיתל החלב האנושי במנות 6-היטב (1 x 10 6 &lt;/ Sup&gt; תאים / טוב) יום לפני טיפול EV / exosome. הוסף 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​CFSE הקרינה שכותרתו EVs / exosome, שהושג בשלב 3.3, בינוני התרבות של תאים HMLE עבור 2-6 שעות. טפל בתאי HMLE של קבוצת הביקורת השלילית עם ההכנה המקבילה, המתואר בשלב 3.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה 2-6 שעות, לשטוף את התאים פעמיים עם 4 מ&quot;ל של PBS בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את התאים עם טריפסין 0.25% למשך 10 דקות מחדש להשעות את התאים PBS המכיל 0.2% FBS. למדוד את ספיגה EV / exosome מן עוצמת הקרינה בתאים באמצעות מנתח תא פלואורסצנטי 4 . תמונה התאים שטופלו EVs / exosomes או שליטה שלילית באמצעות מיקרוסקופיה confocal. הערה: הקרינה הירוקה בתאים נגרמת על ידי ספיגת EV / exosome. ראה את האגדה של איור 6 עבור הגדרות מיקרוסקופ. </li></ol> בידוד של תאים עכבר ראשי אפיתל החלב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><lI&gt; הכינו מנות מצופות ג&#39;לטין על ידי הוספת 12 מ&quot;ל של פתרון ג&#39;לטין 0.1% ל 10 מנות ס&quot;מ. מניחים את הצלחות 37 ° C חממה למשך 30 דקות. הסר את הפתרון ג&#39;לטין ולהשאיר את המכסים את הכלים במכסה המנוע זרימה למינרית במשך 4 שעות עד ציפוי ג&#39;לטין התייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את מספר 2, 3, 4, ו 5 בלוטות החלב ( איור 2 ) מ 12 שבועות בת נקבה C57BL נקבה / 6 עכברים באמצעות מספריים לחתוך את הבלוטות לחתיכות קטנות (2 מ&quot;מ 2 ) באמצעות סכין גילוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוד לנתק את slurry של בלוטות החלב (במשך 10 דקות) ב 60 דקות ב 37 ° C, 120 תסיסה סל&quot;ד עם 50 מ&quot;ל של DMEM / F12 המכיל 0.2% collagenase סוג IV, 0.2% טריפסין, 5% FBS, 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​gentamycin , ו 1x עט סטרפט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה את האורגנים אפיתל מן התערובת על ידי צנטריפוגה ב XG 350 במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות את האורגנים אפיתל ב 4 מ&quot;ל של DMEM / F12 עם 0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​DNase אני 5 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף 6 מ&quot;ל של DMEM / F12 לגמרנפח של 10 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה ב XG 400 במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר להשליך supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 10 מ&quot;ל של DMEM / F12. צנטריפוגה ההשעיה אבל להכות את הבלם כאשר המהירות מגיעה 400 x גרם. מחק את supernatant. הערה: על ידי להכות את הבלם, אורגנואידים אפיתל במהירות pelleted למטה, בעוד fibroblasts, כמו תאים בודדים, עדיין להישאר supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 5.6 ו -5.7 5-7 פעמים. הוסף ירידה של ההשעיה כדי hemocytometer ולאחר מכן לבדוק את פינוי fibroblasts מן התערובת האורגנואידים תחת מיקרוסקופיה לאחר כל סיבוב של צנטריפוגה ( איור 3 ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת את האורגנונים בצלחת ג&#39;לטין מצופה, שהושג בשלב 5.1, במשך 48 שעות עם DMEM / F12 המכיל 1x ITS, 5% FBS, 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​gentamycin, 10 ng / מ&quot;ל ​​EGF, ו 1x עט סטרפט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 48 שעות, להסיר את התאים הצפים בתרבות על ידי החלפת המדיום בינוני בינוני טרי ללא FBS (DMEM / F12 המכיל 1x ITS, 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​gentamycin, 10 NG / מ&quot;ל ​​EGF, ו 1x עט סטרפט). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי monolayer של תאים אפיתל החלב נודדת וצומח מתוך אורגנואידים epithelial המצורפת ב 3 ימים. </li></ol> 6. ההפרדה של ראשי בזלת העכבר / תאים אפיתל לומינל החלב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 3 ימים התרבות, לנתק את תאי החלב העיקרי העכבר עם תערובת אנזים טבעי עם פעילות אנזים proteolytic ו collagenolytic במשך 20 דקות. לנטרל את פעילות האנזים עם 5% FBS ב PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה ב XG 450 במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר להשליך supernatant. Resuspend גלולה התא ב dispes 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​במשך 20 דקות. לנטרל את פעילות האנזים עם 5% FBS ב PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה ב XG 450 במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר להשליך supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re- מושעה התאים μL 100 μL עם 0.2% FBS בריכוז של 10 7 תאים / מ&quot;ל ​​עם מדוללנוגדן אנטי-CD49f ואנטי-APCAM על קרח במשך שעה אחת בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם PBS ולאחר מכן דגירה התאים עם נוגדן משני fluorophore מצומדות על הקרח במשך 30 דקות בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף מחדש להשעות את התאים PBS עם 0.2% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיין את epcam היי / CD49f lo לומינלית תאים אפיתל החלב על סדרן התא 4 . </li></ol> 7. שלפוחית ​​שלפוחיתית / Exosome טיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעים ממוינים epCAM היי / CD49f לו לומינל החלב תאים אפיתל משלב 6.7 על ג &#39;לטין מצופה 6-גם מנות (2 x 10 5 תאים / טוב) ולאחר מכן לטפל בהם עם PBS או 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​NAMEC הנגזרות EV / exosomes שהתקבלו בשלב 1.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח את היעילות הביולוגית של EVs / exosomes בטיפול תרבות לטווח ארוך, להחליף את המדיום תרבות התא בינוני טרי המכיל PBS או 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​NAMEC הנגזרות EV / exosomes כל יומיים. אין לפצל את פרימה העכברתאים luminal ry במהלך הטיפול 10 יום. </li></ol> 8. שומן Pad הזרקת תאים אפיתל החלב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים נקבה C37BL נקבה בת 3 שבועות עם 6 עכברים עם שאיפה 2-3% isofluorane. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר הרדים על גבו. הסר את הפרווה על הבטן באמצע עם קרם גילוח / שיער לנקות את אתר הניתוח עם שלושה מחזורים לסירוגין של אלכוהול 70% פובידון יוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך אנכי 1.5 ס&quot;מ דרך העור לאורך אזור החזה-המעי הגחון במספריים ולאחר מכן לחילופין לחשוף את ימין ושמאל 4 pads שומן החלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה כל כרית שומן על ידי הסרת parenchyma בלוטת עם מספריים. אתר את הלימפה הצומת פנקס השומן ולאחר מכן להסיר את פרנכימה הבלוטה כולה מתחת הצומת הלימפה. הערה: שני שלישים של משטח שומן צריך להישאר במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את התאים המתקבלים משלב 7.2 עם תערובת אנזים טבעי (ראה טבלה של חומרים ) עם proteolytic אפעילות אנזים קולגניוליטי במשך 10 דקות. לנטרל את פעילות האנזים עם 5% FBS ב PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה ב XG 450 במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר להשליך supernatant. לספור את התאים עם hemocytometer ולהשעות את התאים PBS בריכוז כזה μL 15 מכיל את המינון התא הרצוי (10 4 -10 2 תא / כרית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 15 μL של ההשעיה תא אפיתל החלב לתוך משטח שומן באמצעות מזרק זכוכית 100 μL המצורפת מחט 27G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 8.4-8.7 עבור משטח שומן בצד השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את העור עם קליפים הפצע. </li></ol> 9. בלוטת החלב הר שלם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר עם CO 2 פלוס צוואר הרחם ב 8 שבועות לאחר הזרקת התא (שלב 8.7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך אנכי דרך שכבת העור מאזור החזה לאזור המפשעה באמצעות מספריים ולאחר מכן לחשוף את ימין ושמאל 4 מ &#39;רפידות שומן אמריות. הסר את בלוטות החלב 4 ( איור 2 ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מורחים את רפידות שומן על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית לתקן את רפידות שומן עם מקבע של Kahle (פורמלדהיד 4%, EtOH 30%, ו 2% חומצה אצטית קרח) בטמפרטורת החדר לילה. זהירות: מקבע של Kahle הוא מגרה. בצע שלב זה ברדס כימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את כריות שומן 250 מ&quot;ל של EtOH 70% במשך 15 דקות ולאחר מכן ב 250 מ&quot;ל של DH 2 O במשך 5 דקות. כתם את רפידות שומן עם alum carmine (1 גרם של carmine ו -2.5 גרם של אלומיניום גופרתי אשלגן 500 מ&quot;ל של DH 2 O) בטמפרטורת החדר לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את כריות שומן עם 250 מ&quot;ל של EtOH 70% במשך 15 דקות, 250 מ&quot;ל של EtOH 95% במשך 15 דקות, ו 250 מ&quot;ל של EtOH 100% במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו את כריות השומן בקסילן במשך ימים ועצרו את דגירה של קסילן כאשר רפידות השומן הופכות שקופות. זהירות: קסילן הוא מגרה. בצע שלב זה ברדס כימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר שקופיות wiבינוני גובר ולקחת תמונות (2,400 dpi) של רפידות שומן באמצעות סורק שקופיות דיגיטלי. </li></ol>

<ol><li>Simons, M., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes--vesicular+carriers+for+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Exosomes--vesicular carriers for intercellular communication.</a> Curr Opin Cell Biol. 21 (4), 575-581 (2009).</li>
<li>Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).</li>
<li>Boelens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+Transfer+from+Stromal+to+Breast+Cancer+Cells+Regulates+Therapy+Resistance+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exosome Transfer from Stromal to Breast Cancer Cells Regulates Therapy Resistance Pathways.</a> Cell. 159 (3), 499-507 (2014).</li>
<li>Lin, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PGE2+%2FEP4+Signaling+Controls+the+Transfer+of+the+Mammary+Stem+Cell+State+by+Lipid+Rafts+in+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">PGE2 /EP4 Signaling Controls the Transfer of the Mammary Stem Cell State by Lipid Rafts in Extracellular Vesicles.</a> Stem Cells. , (2016).</li>
<li>Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Curr Protoc Cell Biol. , (2006).</li>
<li>György, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles%2C+current+state-of-the-art%3A+emerging+role+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles.</a> Cell Mol Life Sci. 68 (16), 2667-2688 (2011).</li>
<li>Olver, C., Vidal, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007%2F978-1-4020-5943-8_7">Proteomic analysis of secreted exosomes.</a> Subcell Biochem. 43, 99-131 (2007).</li>
<li>Shackleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).</li>
<li>Prater, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+stem+cells+have+myoepithelial+cell+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mammary stem cells have myoepithelial cell properties.</a> Nat Cell Biol. 16 (10), 942-950 (2014).</li>
<li>Stingl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).</li>
<li>Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+sizing+and+enumeration+by+nanoparticle+tracking+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis.</a> J Extracell Vesicles. 2, (2013).</li>
<li>Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+weight+estimation+of+polypeptide+chains+by+electrophoresis+in+SDS-polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels.</a> Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).</li>
<li>Riches, A., Campbell, E., Borger, E., Powis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+exosome+release+from+mammary+epithelial+and+breast+cancer+cells+-+a+new+regulatory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Regulation of exosome release from mammary epithelial and breast cancer cells - a new regulatory pathway.</a> Eur J Cancer. 50 (5), 1025-1034 (2014).</li>
<li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+sample+collection%2C+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> J Extracell Vesicles. 2, (2013).</li>
<li>van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nat Protoc. 7 (7), 1311-1326 (2012).</li>
<li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), E968-E977 (2016).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADVANCED+IMAGING.+Extended-resolution+structured+illumination+imaging+of+endocytic+and+cytoskeletal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">ADVANCED IMAGING. Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics.</a> Science. 349 (6251), (2015).</li>
<li>Outzen, H. C., Custer, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+human+normal+and+neoplastic+mammary+tissues+in+the+cleared+mammary+fat+pad+of+the+nude+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Growth of human normal and neoplastic mammary tissues in the cleared mammary fat pad of the nude mouse.</a> J Natl Cancer Inst. 55 (6), 1461-1466 (1975).</li>
<li>Sheffield, L. G., Welsch, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+human+breast+epithelia+to+mammary-gland-free+fat-pads+of+athymic+nude+mice%3A+influence+of+mammotrophic+hormones+on+growth+of+breast+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Transplantation of human breast epithelia to mammary-gland-free fat-pads of athymic nude mice: influence of mammotrophic hormones on growth of breast epithelia.</a> Int J Cancer. 41 (5), 713-719 (1988).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

Exosomes לעתים קרובות לשאת מאפיינים של התאים ששחררו אותם, ואת כמות exosomes שוחרר יכול להיגרם על ידי גירויים 4 . המדיום התרבות של תאים ניתן לאסוף ונתונה ultracentrifugation דיפרנציאלי עבור EV / אוסף exosome ( איור 1 ). אין כרגע הסכמה כללית על שיטה אידיאלית לבודד EVS / exosomes. השיטה האופטימלית הנהוגה כאן נקבעה על ידי היישום במורד הזרם 14 . Ultracentrifugation היא שיטה מהירה יחסית לבידוד EV / exosomes, א...

Exosomes יכול לתווך תקשורת סלולרית על ידי העברת חלבונים ממברנה cytosolic, שומנים, ו RNAs בין התאים 1 . תקשורת Exosome בתיווך הוכח להיות מעורב בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים ( כלומר, מצגת אנטיגן, התפתחות סובלנות 2 , התקדמות הגידול 3 ). Exosomes לעתים קרובות יש תוכן דומה לאלה של תאים המקור לשחרר אותם. לפיכך, exosomes יכול לשאת מאפייני תאים ספציפיים מתאי המקור ולהעביר תכונות אלה לתאים לבלוע אותם 4 . Exosomes הם 50 עד 150 ננומטר כפול שכבת קרום שלפוחית ​​ו הנוכחי סמנים ספציפיים ( למשל, CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix, ו TSG101). לפיכך, אקסוסומים חייבים להיות מאופיינים בשיטות שונות להיבטים שונים. מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים ניתן להשתמש כדי לדמיין את שלפוחית ​​הממברנהכגון exosomes 4 , 5 . ניתוח מעקף ננו-חלקיקים (NTA) וניתוח פיזור אור דינמי (DLS) משמשים למדידת גודל ומספר אקוסומות מטוהרות 4 . תוכן קרום השומנים של exosomes ניתן לאמת על ידי שיפוע צפיפות. סמנים Exosomal, כגון CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix, ו TSG101 6 , 7 , ניתן למדוד על ידי סופג המערבי. תאי הבסיס החלב יש את היכולת לייצר בלוטות החלב כאשר מושתלים לתוך רפידות שומן, בעוד תאים לומינליים לא יכול 8 , 9 , 10 . לפיכך, תאי הבסיס החלב מכונים גם יחידות repopulating החלב. על ידי שימוש במודל של תאי הבסיס ותאי לומיני החלב, ניתן לבחון את היכולת של EV / exosomes להעביר מאפייני התא בין אוכלוסיות תאים שונות. העבודה הזומדגים את השיטה של ​​העברת יכולת יצירת בלוטות מן תאים אפיתל הבסיס החלב לתאי אפיתל לומינלי החלב באמצעות EVS / exosomes נגזר תאי אפיתל הבסיס החלב. תאים אפיתל החלב לומיני רכשה תכונות תא הבסיס לאחר בליעה של EVs / exosomes מופרשים מתאי הבסיס ולאחר מכן ניתן ליצור בלוטות החלב 4 .

<table><tbody><tr><td>MCDB 170&nbsp;</td><td>USBiological</td><td>M2162</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>תרמו</td><td>1250062</td><td></td></tr><tr><td>אופטימה L-100K אולטרה-צנטריפוגה</td><td>בקמן</td><td>393253</td><td></td></tr><tr><td>SW28 Ti רוטור</td><td>בקמן</td><td>342204</td><td></td></tr><tr><td>SW41 רוטור</td><td>בקמן</td><td>331306</td><td></td></tr><tr><td>NANOSIGHT LM10</td><td>Malvern</td><td>NANOSIGHT LM10</td><td>לניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA)</td></tr><tr><td>אופטיפרפ&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td>תמיסה של 60% (w/v) של יודיקסנול במים (סטרילי).</td></tr><tr><td>נוגדן CD81</td><td>GeneTex</td><td>GTX101766</td><td>1:1,000 ב-5% w/v חלב יבש ללא שומן, 1x TBS, 0.1% Tween 20 ב-4 & deg; C, לילה&nbsp;</td></tr><tr><td>נוגדן CD9</td><td>GeneTex</td><td>GTX100912</td><td>1:1,000 ב-5% w/v חלב יבש ללא שומן, 1x TBS, 0.1% Tween 20 ב-4 & deg; C, לילה&nbsp;</td></tr><tr><td>נוגדן CD63</td><td>Abcam</td><td>Ab59479</td><td>1:1,000 ב-5% w/v חלב יבש ללא שומן, 1x TBS, 0.1% Tween 20 ב-4 מעלות; C, לילה&nbsp;</td></tr><tr><td>נוגדן TSG101</td><td>GeneTex</td><td>GTX118736</td><td>1:1,000 ב 5% w/v חלב יבש ללא שומן, 1x TBS, 0.1% Tween 20 ב 4 & deg; C, לילה&nbsp;</td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>GeneTex</td><td>GTX100118</td><td>1:6,000 ב 5% w/v חלב יבש ללא שומן, 1x כף, 0.1% טווין 20 ב 4 & מעלות; C, לילה&nbsp;</td></tr><tr><td>CFSE (קרבוקסיפלואורסצין סוקסינימידיל דיאצטט אסטר)</td><td>Thermo</td><td>V12883</td><td></td></tr><tr><td>FACSCalibur</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>מנתח תאים פלואורסצנטיים</td></tr><tr><td>קולגנאז סוג IV&nbsp;</td><td>תרמו</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>תרמו</td><td>27250018</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; ITS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3146</td><td>תערובת של אינסולין אנושי רקומביננטי, טרנספרין אנושי ונתרן סלניט</td></tr><tr><td>אקוטאז</td><td>ebioscience</td><td>00-4555-56</td><td>תערובת אנזימים טבעית עם פעילות אנזימים פרוטאוליטיים וקולגנוליטיים</td></tr><tr><td>dispase&nbsp;</td><td>STEMCELL</td><td>7913</td><td>5 מ"ג/מ"ל = 5 U/mL</td></tr><tr><td>נוגדן נגד CD49f</td><td>Biolegend</td><td></td><td>313611 1:50</td></tr><tr><td>נוגדן נגד EpCAM</td><td>Biolegend</td><td>118213</td><td>1:200</td></tr><tr><td>FACSAria</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>cell sorter</td></tr><tr><td>carmine alum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1022</td><td></td></tr><tr><td>תאי אפיתל של חלב אנושי (תאי HMLE, NAMECs)</td><td></td><td></td><td>מתנות מד"ר רוברט ויינברג</td></tr><tr><td>permount</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>Zymeset&nbsp;</td><td>BSB101</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-015</td><td></td></tr><tr><td>הידרוקוריטיזון</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>SI-H0888</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>SI-I9278</td><td></td></tr><tr><td>BPE (תמצית יותרת המוח של בקר)</td><td>Hammod Cell Tech&nbsp;</td><td>1078-ניו זילנד</td><td></td></tr><tr><td>GW627368X&nbsp;</td><td>קיימן</td><td>10009162</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית 15 ס"מ</td><td>פלקון&nbsp;</td><td></td><td></td>353025</tr><tr><td>צנטריפוגה שולחנית</td><td>Eppendrof&nbsp;</td><td>צינור צנטריפוגה 3415R</td><td></td></tr><tr><td>אולטרה-צנטריפוגה</td><td>בקמן</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>PBS (מי מלח חוצץ פוספט)&nbsp;</td><td>קורנינג</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>BCA בדיקת חלבון</td><td>תרמו פישר מדעי&nbsp;</td><td>23228</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים</td><td>היטאצ'י</td><td>HT7700</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין&nbsp;</td><td>STEMCELL</td><td>7903</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית 10 ס"מ</td><td>בז&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית 353003 6 בארות</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>נקבה C57BL/6 עכברים</td><td>NLAC (המרכז</td><td></td><td></td>הלאומי לחיות מעבדה</tr><tr><td>FBS (סרום בקר עוברי)</td><td>BioWest&nbsp;</td><td>S01520</td><td></td></tr><tr><td>גנטמיצין</td><td>תרמו פישר מדעי&nbsp;</td><td></td><td></td>15710072</tr><tr><td>עט/סטרפטוקוקוס</td><td>קורנינג</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>5PRIMER</td><td>2500120</td><td></td></tr><tr><td>איזופלואורן&nbsp;</td><td>Halocarbon</td><td>NPC12164-002-25</td><td></td></tr><tr><td>פורמלדהיד</td><td>MACRON</td><td>H121-08</td><td></td></tr><tr><td>EtOH (אתנול)</td> <td>J.T. Baker</td><td>800605</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית קרחונית</td><td>Panreac</td><td>131008.1611</td><td></td></tr><tr><td>אלומיניום אשלגן גופרתי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>12625</td><td></td></tr><tr><td>קסילן&nbsp;</td><td>Leica</td><td>3803665</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu; m ממברנות</td><td>Merck Millipore</td><td>Millex-GP</td><td></td></tr><tr><td>AUTOCLIP קליפים פצועים, 9 מ"מ</td><td>BD Biosciences</td><td>427631</td><td></td></tr><tr><td>AUTOCLIP קליפ פצע Applier</td><td>BD Biosciences</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>CellMask&trade; אדום עמוק</td><td>תרמו פישר מדעי&nbsp;</td><td>C10046</td><td>כתם קרום פלזמה</td></tr></tbody></table>

העברת בלוטת החלב ביצירת יכולת בין תאי אפיתל בסל החלב תאים לומיני החלב באמצעות שלפוחיות תאיים / אקסוסומות

Transfer of Mammary Gland-forming Ability Between Mammary Basal Epithelial Cells and Mammary Luminal Cells via Extracellular Vesicles/Exosomes

תאים יכולים לתקשר באמצעות אקסוסומים, ~ 100 ננומטר שלפוחית ​​תאיים (EVs) המכילים חלבונים, שומנים וחומצות גרעין. Non-חסיד / mesenchymal תא אפיתל החלב (NAMEC), שודד שלפוחית ​​תאיים יכול להיות מבודדים בינוני NAMEC באמצעות ultracentrifugation דיפרנציאלי. בהתבסס על הצפיפות שלהם, EVs ניתן לטהר באמצעות ultracentrifugation ב 110,000 x גרם. ההכנה EV מן ultracentrifugation ניתן להפריד עוד באמצעות שיפוע צפיפות מתמשכת כדי למנוע זיהום עם חלבונים מסיסים. EVs מטוהרים לאחר מכן ניתן להעריך עוד באמצעות ניתוח nanoparticle מעקב, אשר מודד את הגודל ואת מספר שלפוחית ​​בהכנה. שלפוחית ​​תאיים עם גודל הנעים בין 50 ל 150 ננומטר הם exosomes. NAMEC הנגזרות EVs / exosomes ניתן לבלוע על ידי תאים אפיתל החלב, אשר ניתן למדוד על ידי cytometry הזרימה מיקרוסקופיה confocal. כמה תכונות תא גזע החלב ( למשל, יכולת בלוטת החלב יוצרת) יכוליועברו מן NAMECs דמויי גזע לתאי אפיתל החלב באמצעות NAMEC הנגזרות EV / exosomes. מבודד EpCAM היי / CD49f לו תאים luminal החלב epithelial לא יכול ליצור בלוטות החלב לאחר השתלתם לתוך רפידות שומן העכבר, בעוד EpCAM lo / CD49f היי תאים אפיתל החלב הבסיס החלב טופס בלוטות החלב לאחר ההשתלה. ספיגה של NAMEC הנגזרות EV / exosomes על ידי EpCAM היי / CD49f Lo לומינאלי תאים אפיתל החלב מאפשר להם לייצר בלוטות החלב לאחר השתלת לתוך רפידות שומן. ה- EVS / exosomes נגזר כמו תאי גזע כמו אפיתל החלב העברת בלוטת החלב יוצרת יכולת APCAM היי / CD49f lo לומינלית תאים אפיתל החלב.

מאז הוכח כי חסימת PGE 2 / EP 4 איתות מפעילה EV / שחרור exosome מתאי גזע דמויי הבסיס החלבני 4 , עבודה זו מציגה שיטה לבידוד EVs המושרה / exosomes מתרבות תא אפיתל החלב (NAMEC) החלב. מאז NAMECs הם מתורבת בינוני ללא סרום, אין קיימים EV / exosomes נגזר 13 בסרום. עבור תאים מתורבת בינוני המכיל בסרום, exosomes מראש קיים במדיום יש לנקות מראש על ידי ultracentrifugation ב 110,000 xg לפני המד...

פרוטוקול זה מתאר שיטות לטיהור, quantitating, אפיון שלפוחית ​​תאיים (EVs) / exosomes מ שאינם חסיד / mesenchymal תאים אפיתל החלב ועל השימוש בהם כדי להעביר את בלוטת החלב יוצרי היכולת לתאי אפיתל החלב לומינל. EVS / exosomes נגזר גזע כמו תאי אפיתל החלב יכול להעביר תכונה זו התא לתאים לבלוע EVs / exosomes.

Cells can communicate via exosomes, ~100-nm extracellular vesicles (EVs) that contain proteins, lipids, and nucleic acids. Non-adherent/mesenchymal ...

המטרות הכלליות של הליך זה הן לבודד שלפוחיות חוץ-תאיות ואקסוזומים המעבירים תכונות של גזעיות (stemness) מתאי גזע, ולהעריך את יכולתם של ננו-חלקיקים אלו להעביר תכונות גזעיות. ה-meso יכול להשיב על שאלות מפתח בתחום תאי הגזע בנוגע לשאלה האם תאי גזע מעבירים תכונות דרך תאים או דרך שלפוחיות.או שתוכל אקסוזומה להעביר תכונות של תאי גזע לתא שאינו תא גזע. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שתאי הגזע המונחים נגזרים מווסיקולות של תאי תמסורת. וניתן להשתמש באקסוזומות כדי לבצע תכנות מחדש ישיר של תא שאינו תא גזע לתא גזע.את הפרוצדורה תדגים החוקרת הפוסט-דוקטורלית LeMonsier, יחד עם העוזרים הכירורגיים Pei-Ling, Wen-Tin ו-Shih-Yin, כולם מהמעבדה שלי. התחילו בזריעה של 1.2 × 10⁶ תאי אפיתל של בלוטת העלה מסוג mesenchymal/non-adherent, או NAMECs, ב-12 מיליליטר של מצע לכל צלחת של 15 סנטימטר, לתרבית של ארבעה ימים באינקובטור לתרביות תאים. ביום הרביעי, אספו את מצע התרבית לצורך סבוב בצנטריפוגה שולחנית.לאחר מכן, העבירו את supernatant למבחנה קונית לצורך סבב שני של סנטריפוגציה שולחנית. בשלב הבא, העבירו את ה-supernatent למבחנה חדשה של אולטרה-סנטריפוגה ובצעו ultracentrifugation למשך 30 דקות. בסיום הסבב, העבירו את ה-supernatent למבחנה חדשה של אולטרה-סנטריפוגה ובצעו ultracentrifuge של ה-supernatent פעם נוספת.הסר את הנוזל העליון (supernatant) ותלה מחדש את משקע האקסוזומים של הוויזקולות החוץ-תאיות ב-PBS לצורך סבב שלישי של אולטרה-צנטריפוגציה. לאחר מכן, תלה מחדש את המשקע ב-PBS טרי ובצע אולטרה-צנטריפוגציה לחלקיקי התאים פעם אחת אחרונה. הסר את הנוזל העליון ותלה מחדש את משקע האקסוזומים של הוויזקולות החוץ-תאיות ב-100 µL של PBS.לאחר מכן, מדוד את ריכוז החלבון של תרחיף הוזיקולות החוץ-תאיות באמצעות בדיקת חומצה ביצינכונינית (BCA). הריכוז צריך להיות בערך 20 עד 40 µg ל-100 µL. כדי למדוד את הריכוז ואת הגודל של הוזיקולות החוץ-תאיות והאקסוזומים, דלל את חלקיקי התאים ל-2 µg חלבון ל-100 mL של PBS.נתחו את החלקיקים באמצעות אנליזה של מעקב אחר ננו-חלקיקים (nanoparticle tracking analysis). כדי לטהר את האקסוזומים באמצעות מדרג צפיפות, לאחר העיקרון הצנטריפוגלי השלישי, השביו את המשקע ב-2 mL של 40% iodixanol ב-PBS. לאחר מכן, הניחו מעל תליית התאים נפחים עוקבים של 2 mL של 30%, 20%, 10% ו-5% iodixanol.הפרידו את פראקציית התאים באמצעות אולטרה-צנטריפוגציה במדרג צפיפות, תוך שימוש בפיפט לאיסוף כל אחת מעשר שכבות המדרג בסיום הצנטריפוגציה. לאחר מכן, נתחו את נוכחותם של סמני אקסוזומים בכל פראקציה באמצעות SDS page ו-western blot בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים, תוך שימוש בנוגדנים נגד סמני האקסוזומים הרלוונטיים.כדי לטפל בתאי אפיתל של בלוטת העלה באמצעות שלפוביות חוץ-תאיות ואקסוזומים, זרעו תחילה 2×10⁵ תאי אפיתל לומנליים של בלוטת העלה, המופקים במיון זרימה כ-epcam hi-CD 49F low, לכל באר בלוחות 6 בארות מצופים בג'לטין. לאחר מכן, טפלו בכל תרבית תאים ב-2 µg/mL של שלפוביות חוץ-תאיות ואקסוזומים המופקים מ-NAMEC. החליפו את מצע הגידול בשלפוביות חוץ-תאיות ואקסוזומים טריים מדי יומיים במשך עשרה ימים.בסיום תקופת הטיפול, הניחו עכברת 57 BL6 נקבה בת שלושה שבועות תחת הרדמה במצב שכיבה על הגב (supine), והסירו את הפרווה מאזור מרכז הבטן. חטאו את אתר הניתוח באמצעות שלושה מחזורים לסירוגין של 70% אלכוהול ופובדון יוד. בצעו חתך אנכי של 1.5 סנטימטר דרך העור, לאורך האזור התורסי-אינגינלי הוונטרלי.חשוף לסירוגין את כריות השומן של בלוטות החלב הרביעיות הימנית והשמאלית. אתר את קשרי הלימפה בכל כרית שומן והסר את כל בלוטת ה-perancama שמתחת לקשרי הלימפה. לאחר מכן, השתמש באנזים טבעי בעל פעילות פרו-דיאליטית וקולגנוליטית כדי לנתק את השלפוחיות החוץ-תאיות ואת תאי אפיתל הגב של בלוטות החלב שעובדו באמצעות אקסוזומים.נטרול פעילות האנזים באמצעות 5% FBS ב-PBS לאחר עשר דקות. איסוף התאים באמצעות צנטריפוגה והסרת הנוזל העליון (supernatant). לאחר ספירה, יש לדלל את התאים לריכוז של 1×10² עד 1×10⁴ תאים ל-15 µL של PBS.השתמש במזריק זכוכית של 100 microliter המצויד במחט gauge 27 כדי להזריק 15 microliters של תרחיף תאי אפיתל של בלוטת העלה לכל רפידה שומנית. לאחר מכן, סגור את העור באמצעות סיכות לסגירת פצעים. שמונה שבועות לאחר ההזרקה, בצע חתך אנכי דרך העור מאזור בית החזה לאזור המפשעה וחשוף את הרפידות השומניות של בלוטת העלה הרביעית מימין ומשמאל.הסיר את בלוטת העלה הרביעית ופרס את רפידות השומן על גבי תזריקי זכוכית נפרדים. לאחר מכן, העבר את התזריקים למכסה מסינונים כימית, וקבע את הרפידות באמצעות מקבעים מסוג collies למשך לילה בטמפרטורת החדר. למחרת בבוקר, שטוף את הדגימות ב-250 milliliters של 70% ethanol למשך 15 דקות.לאחר מכן, יש לשטוף ב-250 milliliters של מים מזוקקים למשך חמש דקות. לאחר השטיפה במים מזוקקים, צבע את רפידי השומן ב-carmine alum למשך לילה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן בצע דהידרטציה באמצעות סדרת אינקובציות באתנול בריכוזים עולים, למשך 15 דקות כל אחת.לאחר שלב התייבש האחרון, העבירו את הדגימות ל-zylene בתוך מנדף כימי עד שרפידות השומן יהפכו לשקיפות. לאחר מכן, הצמידו את השקופיות באמצעות מדיום הצמדה, והשתמשו בסורק שקופיות דיגיטלי כדי לדמות את רפידות השומן ברזולוציה של 2,400 dots per inch. גודלן של הוסיקולות המבודדות ושל משקע an ultracentrifuge הוא בדרך כלל כ-100 nanometers, כפי שנמדד באמצעות nano particle tracking analysis.יתרה מכך, ניתוח באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים חודר של פראקציות אולטרסנטריפוגה של מצע מותנה מ-NAMEC חושף נוכחות של שלפוחיות ממברנה בשפע. לאחר הפרדה במדרג צפיפות כפי שהודגם זה עתה, ניתן לזהות סמני אקסוזומים בפראקציה של 20 אחוזי iodixonal. ניתוח ציטומטריית זרימה של תאי אפיתל בלוטתיים גלובולריים אנושיים שטופלו בשלפוחיות חוץ-תאיות ואקסוזומים המופקים מ-namic המסומנים ב-CFSE, חושף אות CFSE גבוה פי עשרה בתרביות שטופלו באקסוזומים.מעיד על ספיגה ספציפית של שלפוחיות חוץ-תאיות ואקסוזומים המסומנים ב-CFSE על ידי תאי אפיתל של בלוטת העלה. יתרה מכך, בעוד שבתאי הבקרה השליליים, תאי אפיתל של בלוטת העלה שטופלו ב-PBS אינם מראים אות CFSE, ניתן להבחין במיקרוסקופיה קונפוקלית גם בעדויות לספיגה של שלפוחיות חוץ-תאיות ואקסוזומים המופקים מ-NAMEC על ידי התאים שטופלו באקסוזומים. ראוי לציין כי רפי דגי השומן של עכברים שהוזרקו להם תאי אפיתל לומנליים של בלוטת העלה מסוג epCAMhi/CD49Flo, אשר מוינו בשיטת flow sorting וטופלו בשלפוחיות חוץ-תאיות ובאקסוזומים המופקים מ-NAMEC למשך עשרה ימים, רכשו את היכולת להקים בלוטות חלב.לאחר פיתוחה, סללה טכנולוגיה זו את הדרך עבור החוקרים שלנו בתחום הביולוגיה של תאי גזע, כדי לבחון את השימוש בתאים תרגוליים (trans cells), בוסיקולות ואקסוזומים המופקים מתאי גזע ברפואה רגנרטיבית ובתכנות מחדש ישיר של תאים.

transfer-mammary-gland-forming-ability-between-mammary-basal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

HC11 בידול lactogenic יכול להיות מאופיין על ידי היווצרות של מבנים כיפה המכונה mammospheres. מבנים ניתן המנויים על ידי מיקרוסקופ לעומת שלב כדי לסייע לכימות בידול lactogenic.

תאים אפיתל עכבר החלב טופס Mammospheres במהלך התמיינות Lactogenic

מאמר זה מדגים את נוהל שפותח על ידי DeOme...

החלב להשתלות אפיתל נוהל

בדו"ח זה, אנחנו מדגימים מערכת לבודד התורם התרבות תאים מבלוטת החלב העכבר, ו orthotopically השתלת תאים אלה בעכברים הנמען לנתח סטרומה: אינטראקציות אפיתל במהלך התפתחות הגידול החלב.

השתלה של תאים סטרומה החלב ותאי קרצינומה של עכברים C57BL/6J

שיטה זו מתארת ​​כיצד לנתח ולהעריך התפתחות תפקוד בלוטת החלב ומן העכברים. בלוטות החלב נכרת מוערכים לתואר הפיתוח באמצעות הר שלם תוך פליטה החלב מוערך באמצעות אוקסיטוצין מבוססי assay myoepithelial התכווצות התא.

הערכת התפתחות בלוטת החלב פונקציה ועל מודלים עכבר

פרוטוקול immunofluorescence העקיף המתואר במאמר זה מאפשר זיהוי והלוקליזציה של חלבונים בבלוטת החלב עכבר. שיטה שלמה ניתן להכין דגימות בלוטת החלב, לבצע אימונוהיסטוכימיה, לתמונת סעיפי רקמות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ולשחזר תמונות.

Immunofluorescence עקיף על סעיפים קפואים של עכבר בלוטת החלב

עבודה זו מדגימה גישה חדשנית להעריך את התפשטות, הבחנה, ואת היכולת להרכיב פוטנציאל של תאי גזע אנדותל כלי הדם (VESCs) באמצעות השתלת כרית שומן החלב ואחריו הכנת רקמות הר שלם עבור תצפית מיקרוסקופית. א השושלת מעקב אחר אסטרטגיה לחקור את ההתנהגות של VESCs in vivo מוצג גם.

רומן חדש פאט שומן טכניקת השתלת לדמיין את כלי השיט הדור של כלי הדם בתאי גזע אנדותל

מאמר זה מתאר שיטת השתלת להשתיל השתל בפטמות האפיתל התאים לתוך משטח שומן לבן של בעלי חיים הנמען. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לבחון את השפעות המארחים ו/או התורמים בהתפתחות האפיתל של הפטמות ומבטלת את הצורך בניקוי מראש, ובכך מרחיב את התועלת שבטכניקה זו.

חולדה השתלת תא האפיתל לתוך משטח שומן לבן הגלימה

בלוטת החלב היא מבנה מחודד, המורכב מיואפיתל חיצוני ותאי אפיתל הפנים הפנימיים. המוצג הוא פרוטוקול להכין אורגנואידים. באמצעות טריסיזציה דיפרנציאלית שיטה יעילה זו מאפשרת לחוקרים לטפל באופן נפרד בשני סוגי תאים אלה כדי לחקור שאלות הנוגעות לתפקידם בצורת בלוטת החלב ובתפקוד.

הדור של הפסיפס של חלב באמצעות טריסיזציה דיפרנציאלית

הצלבה בין תאי אפיתל חלביים לתאי אנדותל תורמת חשובה להתקדמות סרטן השד, לצמיחת הגידול ולגרורות. במחקר זה, כדוריות נעשו מתאי סרטן השד יחד עם תאי אנדותל כלי דם ו/או לימפתיים ולהדגים את ישימותם כמערכת במבחנה לחקר סרטן השד.

כדורי תא אפיתל ואנדותל של חלבי כמודל הפריה תפקודי פוטנציאלי לחקר סרטן השד

הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקה קלה להדמיה תוך-חיונית של בלוטת החלב של עכבר מניק, באמצעות סריקת לייזר, מיקרוסקופ קונפוקלי ומולטיפוטון.

מיקרוסקופיה תת-תאית תוך חיונית של בלוטת החלב

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הזרקה אינטרדוקטלית של וקטורים נגיפיים דרך הטיט כדי להעביר גנים מעניינים לתאי אפיתל החלב.

ב Vivo העברת גנים לתאי אפיתל חלב עכבר באמצעות הזרקה intraductal חלב

למד בידוד ואפיון של בלוטות חוץ-תאיות ואקסוזומים מתאי אפיתל חלב מזנכימליים. שיטה זו מאפשרת העברת יכולות יצירת בלוטת חלב לתאי אפיתל לומינליים ומספקת כלים לחקר תכונות תאי גזע.

העברת בלוטת החלב ביצירת יכולת בין תאי אפיתל בסל החלב תאים לומיני החלב באמצעות שלפוחיות תאיים / אקסוסומות

גלה סרטונים נוספים