העברת בלוטת החלב ביצירת יכולת בין תאי אפיתל בסל החלב תאים לומיני החלב באמצעות שלפוחיות תאיים / אקסוסומות

המטרות הכלליות של הליך זה הן לבודד גזע המעביר שלפוחיות תאיות ואקסוזומים נוספים מתאי גזע. ולהעריך את יכולת העברת הגזע של ננו-חלקיקים אלה. המזו יכול לענות על שאלות מפתח בתחום תאי הגזע לגבי תאי גזע של מזג אוויר שמקורם בתאי טרנס או שלפוחית.

או שאקסוזום יכול להעביר את רכוש תאי הגזע לתאי גזע שאינם תאי גזע. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שתאי הגזע המושרה נובעים משלפוחית תאי טרנס. וניתן להשתמש באקסוזום כדי לתכנת מחדש ישירות תאי גזע לתאי גזע.

מי שידגים את ההליך יהיה חוקר הדואר למונסייר, עם העוזר הכירורגי פיי-לינג, וון-טין ושי-יין, כולם מהמעבדה שלי. התחל בזריעת נקודה אחת פעמיים כפול עשר לתאי אפיתל החלב השישי שאינם נצמדים/מזנכימליים, או NAMECs ב-12 מיליליטר של מדיום לכל צלחת של 15 סנטימטר לתרבית של ארבעה ימים בחממת תרבית תאים. ביום הרביעי, קצרו את מדיום התרבות לצנטרופיגציה על השולחן.

לאחר מכן העבירו את הסופרנטנט לצינור חרוטי לצנטריפוגה שנייה על השולחן. לאחר מכן, העבירו את הסופרנט לאולטרה-צנטריפוגה חדשה ובצעו אולטרה-צנטריפוגה למשך 30 דקות. בסוף הסיבוב, העבירו את הסופרנטנט לצינור אולטרה-צנטריפוגה חדש ואולטרה-צנטריפוגה את הסופרנטנט שוב.

הסר את הסופרנט והשהה מחדש את החיך האקסוזומי של השלפוחית החוץ-תאית ב-PBS לאולטרה-צנטריפוגה שלישית. לאחר מכן, השעו מחדש את החך ב-PBS טרי ואולטרה-צנטריפוגה את חלקיקי התא בפעם האחרונה. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את החיך האקסוזומי של השלפוחית התאית הנוספת ב-100 מיקרוליטר של PBS.

לאחר מכן, מדוד את ריכוז החלבון של תרחיף השלפוחית החוץ תאית על ידי בדיקת חומצה ביצינצ'ונינית. הריכוז צריך להיות בערך 20 עד 40 מיקרוגרם ל 100 מיקרוליטר. כדי למדוד את הריכוז והגודל של השלפוחיות והאקסוזומים התאיים הנוספים, יש לדלל את חלקיקי התא לשני מיקרוגרם חלבון לכל 100 מיליליטר PBS.

ולנתח את החלקיקים על ידי ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים. כדי לטהר את האקסוזומים על ידי שיפוע צפיפות, לאחר האולטרה-צנטריפוגה השלישית, השעו מחדש את החך בשני מיליליטר של 40 אחוז יודיקסנול ב-PBS. ולכסות את תרחיף התא בנפחים רציפים של שני מיליליטר של 30 אחוז, 20 אחוז, 10 אחוז וחמישה אחוז יודיקסאנול.

הפרד את שבר התא על ידי אולטרה-צנטריפוגה של שיפוע צפיפות באמצעות פיפטה כדי לקצור כל אחת מעשר שכבות השיפוע בסוף הצנטריפוגה. לאחר מכן, נתח את נוכחותם של סמני אקסוזום בכל שבר לפי דף SDS וכתם מערבי על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. שימוש בנוגדנים כנגד סמני האקסוזום המתאימים המעניינים.

כדי לטפל בתאי אפיתל החלב עם השלפוחיות והאקסוזומים הנוספים של התאים תחילה, זרע פעמיים אוהל לזרימה החמישית ממוין epcam hi-CD 49F תאי אפיתל חלב נמוכים לכל צלחת על גבי שש צלחות באר מצופות ג'לטין. לאחר מכן, טפל בכל תרבית תאית בשני מיקרוגרם למיליליטר של שלפוחיות ואקסזומים תאיים נוספים שמקורם ב-NAMEC. החלפת המדיום המתורבת בשלפוחיות תאיות נוספות טריות ואקסוזומים כל יומיים למשך עשרה ימים.

בתום תקופת הטיפול, הניחו נקבה בת שלושה שבועות מורדמת 57 BL6 במצב שכיבה, והסירו את הפרווה באמצע הבטן. יש לחטא את מקום הניתוח בשלושה מחזורים מתחלפים של 70 אחוז אלכוהול ופובודון. ובצע חתך אנכי של נקודה וחמישה סנטימטרים דרך העור, לאורך אזור המפשעה של בית החזה הגחוני.

חשוף לסירוגין את רפידות השומן הימניות והרביעיות של החלב. אתר את בלוטת הלימפה בכל כרית שומן והסר את כל פרנקמה הבלוטה מתחת לבלוטת הלימפה. לאחר מכן, השתמש באנזים טבעי בעל פעילות פרודיאליטית וקולונליטית כדי לנתק את תאי האפיתל של החלב הלומינלי המטופל באקסום.

נטרול פעילות האנזים, עם חמישה אחוז FBS ב-PBS לאחר עשר דקות. אסוף את התאים על ידי צנטריפוגה והשליך את הסופרנטנט. לאחר הספירה, יש לדלל את התאים לאחת כפול עשר לשנייה לאחת כפול עשרה עד הרביעית לכל 15 מיקרוליטר של ריכוז PBS.

והשתמש במזרק זכוכית של 100 ליטר מיקרוליטר המצויד במחט בגודל 27 כדי להזריק 15 מיקרוליטר מתרחיף תאי האפיתל של החלב לכל כרית שומן. לאחר מכן, סגור את העור עם קליפסים לפצעים. שמונה שבועות לאחר ההזרקה, בצע חתך אנכי דרך העור מאזור בית החזה לאזור המעיכה וחשוף את כריות השומן הימנית והרביעית הימנית והשמאלית.

הסר את עטרת החלב הרביעית ופזר את רפידות השומן על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית בודדות. לאחר מכן, העבירו את השקופיות למכסה מנוע כימי, וקבעו את הרפידות עם מקבעים קולי למשך הלילה בטמפרטורת החדר. למחרת בבוקר יש לשטוף את הדגימות ב -250 מיליליטר של 70 אחוז אתנול למשך 15 דקות.

ואחריו 250 מיליליטר מים מזוקקים למשך חמש דקות. לאחר שטיפת המים המזוקקים, יש להכתים את רפידות השומן באלום קרמין למשך הלילה בטמפרטורת החדר. ואחריו התייבשות בדגירה עולה של אתנול של 15 דקות.

לאחר ההתייבשות האחרונה, העבירו את הדגימות לזילן במכסה כימי עד שכריות השומן הופכות שקופות. לאחר מכן, הרכיבו את השקופיות עם מדיום הרכבה, והשתמשו בסורק שקופיות דיגיטלי כדי לדמות את רפידות השומן ב-2,400 נקודות לאינץ'. גודל השלפוחיות המבודדות והחך האולטרה-צנטריפוגה הוא בדרך כלל כ-100 ננומטר, כפי שנמדד על ידי ניתוח מעקב אחר חלקיקי ננו.

יתר על כן, ניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים של שברי אולטרה-צנטריפוגה של מדיום מותנה NAMEC חושף נוכחות של שלפוחיות ממברנה בשפע. לאחר הפרדת שיפוע צפיפות כפי שהודגם זה עתה, ניתן לזהות סמני אקסוזום בשבר היודיקסונלי של 20 אחוז. ניתוח אמטרי בצד הזרימה של תאי אפיתל חלב לומינליים אנושיים הנסחרים עם שלפוחיות ואקסזומים תאיים נוספים המסומנים ב-CFSE מגלה אות CFSE גבוה פי עשרה בתרביות שטופלו באקסוזום.

מציין את הספיגה הספציפית של CFSE המסומנת שלפוחיות תאיות נוספות ואקסוזומים, על ידי תאי האפיתל של החלב. יתר על כן, בעוד שתאי אפיתל החלב שטופלו ב-PBS אינם מציגים סינגל CFSE, ניתן לראות עדויות לספיגה שלפוחית ואקסוזום אקסוזומית שמקורן בנמיק על ידי התאים שטופלו באקסוזום גם על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. יש לציין כי כריות השומן של עכברים שהוזרקו עם תאי אפיתל חלביים לומינליים epCAMhi/CD49Flo שטופלו בשלפוחיות ואקסוזומים נוספים שמקורם ב-NAMEC במשך עשרה ימים רכשו את היכולת ליצור בלוטות חלב.

לאחר פיתוחה, טכנולוגיה זו סללה את הדרך לחוקר שלנו בתחום הביולוגיה של תאי גזע. לחקור את השימוש בתאי הגזע שמקורם בתאי גזע ושלפוחית ואקסוזום ברפואת רגנרציה ותכנות מחדש ישיר של תאים.