ניתוח Supercomplexes של Mitochondrial אלקטרונים שרשרת התחבורה עם אלקטרופורזה הילידים, ב-מבחני ג'ל, ו Electroelution
1 ביוני 2017
פרוטוקול זה מתאר את ההפרדה של מיטוכונדריאלי תפקודי שרשרת התחבורה אלקטרונים מתח (Cx) IV ו supercomplexes מהם באמצעות אלקטרופורזה יליד לחשוף מידע על הרכבה שלהם המבנה. ג'ל הילידים יכול להיות נתון immunoblotting, מבחני ג'ל, וטיהור על ידי electroelution כדי לאפיין עוד קומפלקסים בודדים.
המטרה הכוללת של אלקטרופורזה מקומית בשילוב עם מבחני ג'ל, אימונובלוטינג ואלקטרו-אלוציה מקורית היא לשמר ולנתח את ההרכבה של קומפלקסי על מיטוכונדריאליים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על האופן שבו קומפלקסי החלבון של שרשרת הובלת האלקטרונים המיטוכונדריאלית מתאספים לסופר-קומפלקסים בהתאם לגורמים רבים, כולל צרכים ביו-אנרגטיים ותנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאם נעשה כראוי, השלמות הפיזיולוגית והפונקציונליות של קומפלקסי העל המיטוכונדריאלים נשמרת לאורך תהליך הבידוד הארוך.
ניתן ליישם שיטה זו גם כדי לחקור את הדינמיקה של הרכבה סופר-קומפלקסית ולנתח קומפלקסים של חלבונים בקרום הפלזמה, כמו גם בממברנות תוך-תאיות אחרות. כאשר מתכוננים לבדיקות בתוך הג'ל, זה קריטי לחלוטין שכל החלקים המשמשים לאלקטרופורזה מקורית לא יזדהמו על ידי חומרי ניקוי, מכיוון שהם יתרמו להתפוררות של קומפלקסי העל המיטוכונדריים. חותכים נתיב אחד או יותר מג'ל מקורי שקוף ומעבירים אותם למיכל מסומן.
כדי לבצע את בדיקת קומפלקס-1, שלב 10 מיליליטר של מאגר בדיקה עם 25 מיליגרם של טטרזוליום כחול ניטרו ו-100 מיקרוליטר של 10 מיליגרם למיליליטר NADH. הוסף את זה לנתיב הג'ל המקורי השקוף או לאזור העניין. עקוב אחר התפתחות הרצועות הכחולות לאחר תסיסה עדינה על נדנדה למשך שלוש דקות לפחות.
לאחר מכן, יש לתקן את הג'ל ב-10 עד 20 מיליליטר של תמיסת חומצה אצטית או לשטוף ב-5 מילי-מולרי Tris pH 7.4 כדי לעצור את התגובה. צלם תמונות לתיעוד. כדי לבצע את בדיקת קומפלקס-5, השג ג'ל, נתיב או אזור עניין מג'ל מקומי כחול או שקוף.
דגרו את הדגימה למשך שעתיים עם תסיסה עדינה ב-10 עד 20 מיליליטר של מאגר בדיקה, בתוספת או מינוס חמישה מיקרוגרם למיליליטר אוליגומיצין בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, החלף את המאגר ב-14 מיליליטר של מאגר בדיקה טרי. לאחר מכן הוסף, לפי הסדר, 190 מיקרוליטר של מגנזיום גופרתי טוחנת אחת, 27.28 מיליגרם עופרת חנקתית, 60 מיליגרם ATP ו-75 מיקרוליטר אוליגומיצין.
דגירה עם תסיסה עדינה ושימו לב למשקעים לבנים שכן רצועות על הג'לים שטופלו באוליגומיצין יתנו רצועות תלויות לא קומפלקס-5. תקן את הג'ל בקיבוע מבוסס מתנול מכיוון שתמיסות חומציות ימיסו את משקעי העופרת. צלם את התוצאות ועקוב אחר העברת חלבון ואימונובלטינג, כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
ביום האלקטרו-אלוציה, הניחו פריט בתחתית כל צינור זכוכית לשימוש. במידת הצורך, הנח את צינור הזכוכית במאגר פליטה ודחף את הפריט מבפנים לתחתית הצינור. דחוף את צינור הזכוכית עם הפריט לתוך המודול של ה-Electro-Eluter.
הרטיבו את הלולאה עם מאגר פליטה והחליקו את צינור הזכוכית למקומו. ודא שהחלק העליון של צינורות הזכוכית אחיד עם הלולאה. סגור את הלולאות הריקות בעזרת פקקים.
לאחר מכן, הנח מכסה ממברנה רטוב בתחתית מתאם הסיליקון ומלא את המתאם במאגר פליטה. פיפטה איטית את המאגר והמתאם למעלה ולמטה כדי להסיר בועות אוויר סביב קרום הדיאליזה. החלק את המתאם המלא במאגר לתחתית צינור הזכוכית.
לאחר מכן, הסר את כל הבועות המופיעות על הפריט בתוך צינור הזכוכית. מלאו כל צינור זכוכית במאגר הפליטה. הנח את הרצועות הכרותות של ה-BN-PAGE לתוך צינורות הזכוכית.
חותכים חתיכות גדולות לחתיכות קטנות יותר. ודא שגובה המילוי בתוך צינור הזכוכית הוא בסביבות סנטימטר אחד. לאחר מכן, הנח את כל המודול לתוך המיכל.
הוסף כ -600 מיליליטר של מאגר פליטה קרה למיכל. ודא שמכסי מתאם הסיליקון שקועים במאגר. הניחו מוט ערבוב בתחתית המיכל לפני הוצאת החלבונים למשך ארבע שעות ב-350 וולט בחדר קר
.לאחר השלמת השטיפה, הסר את מודול ה-Electro-Eluter ממיכל החיץ והנח אותו בכיור או בקערה. אם נעשה שימוש בפקק, הסר אותו כדי לנקז את תא החיץ העליון. הסר את המאגר מכל צינור זכוכית והשליך אותו.
ודא שמתאם הסיליקון נשאר במקומו, ושהנוזל שמתחת לפריט אינו מופרע או מטלטל. לאחר מכן, הסר בזהירות את מתאם הסיליקון, יחד עם מכסה הממברנה מתחתית צינור הזכוכית. הכניסו את תכולת מכסה הסיליקון למיקרו-צינורית.
עם עוד 200 מיקרוליטר של מאגר פליטה, שטפו את מכסה הסיליקון והוסיפו למיקרו-צינור. חזור על תהליך זה עבור כל צינורות הזכוכית. שמרו על מכסי הממברנה הניתנים לשימוש חוזר על ידי הכנסתם למאגר פליטה המכיל 0.5 מיליגרם למיליליטר נתרן אזיד, וקיררו אותם.
קומפלקסים-על ממיטוכונדריה של הלב מוצגים כאן על ידי מבחני ג'ל. נתיבים של הג'ל המקורי השקוף משמשים לבדיקות בתוך הג'ל עבור קומפלקס-1 וקומפלקס-5. ניתן להעריך את הספציפיות של האות על ידי שימוש במעכבים, כמו אוליגומיצין עבור ATP-סינתאז.
מבחני In-gel מספקים מידע לגבי גודלו של קומפלקס חלבונים, עם פעילות קומפלקס-1 או קומפלקס-5, אך לא לגבי הרכבם. הג'ל המקורי הכחול מראה רצועות של קומפלקסים של חלבונים שניתן לכרות לצורך אלקטרו-אלוציה. לאחר אלקטרו-אלוטציה, ה-eluate משמש לניתוח נוסף, כמו בדיקות בתוך ג'ל, צביעת כסף של החלבונים המנופחים על ידי אלקטרופורזה מקורית או דנטורינג, וכתמים מערביים.
לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלושה ימים אם היא מבוצעת כראוי. שלושת הימים הללו כוללים בידוד מיטוכונדריה, ביצוע אלקטרופורזה מקסי מקורית כחולה למשך הלילה ואימונובלוטינג. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד ולזהות קומפלקסים-על מיטוכונדריאלים באמצעות אלקטרופורזה מקורית, מבחני ג'ל ואלקטרו-אלוטוציה.
בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שקומפלקסים-על מיטוכונדריאלים הם שבירים. יש לשמור על הקפאה והפשרה של דגימות למינימום. אלקטרופורזה ואלקטרו-אלוציה מקורית צריכות להיעשות על קרח או בחדר הקירור.
ההשלכות של טכניקות אלה חורגות מעבר להגדרת ההרכב הפיזי של כל קומפלקס-על. מכיוון שמתחמי העל נלכדים בצורתם המקורית, ניתן לבצע בדיקות פונקציונליות. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה המיטוכונדריאלית להעריך מחדש את ההבנה של פעילות הובלת האלקטרונים המיטוכונדריאלית והשלכותיה על חולים במחלות מיטוכונדריאליות.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו HPLC, ספקטרוסקופיה מסה, מיקרוסקופ אלקטרונים או הידוק טלאי כדי לענות על שאלות נוספות כמו ההרכב המולקולרי, המבנה או התכונות האלקטרופיזיולוגיות של קומפלקסי החלבון המבודדים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
פרוטוקול זה מתאר את השימוש באלקטרופורזה טבעית להפרדת קומפלקסים של שרשרת העברת האלקטרונים המיטוכונדריאלית והסופר-קומפלקסים שלהם. שיטה זו משמרת את השלמות הפיזיולוגית של הקומפלקסים, ומאפשרת ניתוח מפורט של ההרכבה והמבנה שלהם.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- ביוכימיה
רקע
- סופר-קומפלקסים מיטוכונדריאליים ממלאים תפקיד מכריע במטבוליזם האנרגטי התאי.
- הבנת ההרכבה שלהם יכולה לספק תובנות לגבי צרכי הביואנרגיה ומצבי מחלה.
- אלקטרופורזה טבעית מסייעת בשמירה על הפונקציונליות של קומפלקסים אלו במהלך הניתוח.
- זיהום בחומרי ניקוי יכול לשבש את שלמות הסופר-קומפלקסים.
מטרת המחקר
- לנתח את ההרכבה של סופר-קומפלקסים מיטוכונדריאליים.
- לחקור את הגורמים המשפיעים על יצירת קומפלקסים.
- לחקור את הדינמיקה של הרכבת סופר-קומפלקסים בתנאים שונים.
שיטות בשימוש
- אלקטרופורזה טבעית להפרדת קומפלקסים.
- בדיקות בג'ל לניתוח פונקציונלי.
- אימונובלוט לזיהוי חלבונים.
- אלקטרו-אלוציה לטיהור קומפלקסים בודדים.
תוצאות עיקריות
- שימור מוצלח של סופר-קומפלקסים מיטוכונדריאליים במהלך הבידוד.
- תובנות לגבי מנגנוני ההרכבה של קומפלקסים של שרשרת העברת האלקטרונים.
- הוכחת יישומיות השיטה לממברנות תוך-תאיות אחרות.
- זיהוי גורמים קריטיים המשפיעים על יציבות הסופר-קומפלקסים.
מסקנות
- אלקטרופורזה טבעית היא כלי חשוב לחקר סופר-קומפלקסים מיטוכונדריאליים.
- השיטה יכולה לשפר את הבנתנו את תפקוד המיטוכונדריה בבריאות ובמחלה.
- מחקר נוסף יכול להרחיב את יישומי השיטה למבנים תאיים אחרים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Understanding mitochondrial supercomplex assembly provides mechanistic insights into cellular bioenergetics, supporting target validation in metabolic disease research. This method enables functional analysis of electron transport chain complexes in their native state, improving predictive confidence in preclinical models. It supports hypothesis testing and pathway clarification in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by resolving supercomplex assembly under varying bioenergetic conditions.
- Operational Value: Preserves physiological integrity of mitochondrial complexes, reducing mechanistic ambiguity in target validation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by linking complex dynamics to disease-relevant phenotypes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated biological systems for downstream functional screening of compounds affecting mitochondrial function.
- Operational Value: Standardizes assay readiness through reproducible native gel separation and in-gel activity detection.
- Scalability: Facilitates platform reuse across mitochondrial and other intracellular membrane systems.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase supercomplex analysis to preclinical validation via functional readouts.
- Biomarker Alignment: Supports identification of translational biomarkers tied to supercomplex stability and activity.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by clarifying mechanistic de-risking of mitochondrial targets.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, enabling mechanistic de-risking before compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving supercomplex assembly dynamics.
- Screening: Enables assay readiness through quantitative in-gel assays that report complex-specific activity.
- Analytics: Provides functional readouts and structural data that help compare experimental conditions and genetic perturbations.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through disease-relevant supercomplex phenotypes.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for studying membrane protein complexes beyond mitochondria.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in mitochondrial biology.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of supercomplex isolation and analysis.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in metabolic disease programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on supercomplex stability and function.
Implementation Considerations
- Requires expertise in native protein electrophoresis and mitochondrial isolation.
- Demands detergent-free instrumentation and analytical infrastructure to preserve supercomplex integrity.
- Necessitates cross-team standardization for consistent sample handling and gel processing.
- Involves adaptation considerations when applying to non-mitochondrial membrane systems.
- Limited by sample fragility; requires cold handling and minimal freeze-thaw cycles to maintain functionality.
