Name: הכנת שלפוחית הממברנה פלסמה מן העצם Mesenchymal תאי גזע עבור פוטנציאל החלפת ציטופלזמה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: חקור הכנת שלפוחיות ממברנה פלסמה מתאי גזע מזנכימליים ממח עצם לטיפול החלפת ציטופלזמה. שיטה זו מאפשרת מחקר הפיכת תסמיני הזדקנות בתאים מבוגרים באמצעות ציטופלזמה צעירה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי קרן לי שאנג שינג, פרויקט גואנגדונג ברמה גבוהה אוניברסיטת &quot;ירוק טכנולוגיות לתעשיות ימית&quot;, הקרן למדעי הטבע של סין (http://www.nsfc.gov.cn/ מענק מס &#39;30971665, 81172894, 81370925), ואת מחלקת החינוך של גואנגדונג (http://www.gdhed.edu.cn/ מענק No.cxzd1123).

8 עד 12 שבועות BALB / c עכברים נרכשו מ שנחאי ניסיוני בעלי חיים מרכז (שנחאי, סין) וגדל ב פתוגן ללא מתקן ממוזג ללא תשלום. טיפול בבעלי חיים ונהלים ניסיוניים היו בקנה אחד עם הנחיות לשימוש וטיפול של חיות מעבדה שהוקמה על ידי אוניברסיטת שאנטו. 1. הרכבה של המנגנון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח סטריליות, להדליק את האור UV של ברדס תרבות רקמה במשך 30 דקות לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרק יחידת 25 מ&quot;מ מסנן חד פעמיות להטביע את הכובע ואת החלק התחתון של היחידה לתוך כוס זכוכית 200 מ&quot;ל מלא באתנול 75% במשך 30 דקות. היחידה מורכבת מפוליפרופילן רפואי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרים את הכובע ואת החלק התחתון של המכשיר באמצעות מלקחיים, לנער את האתנול הנותר ביד, ולאפשר את החלקים לאוויר יבש במשך 10 דקות במכסה המנוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רטוב 19 מ&quot;מ קוטר פוליקרבונט ב PBS ומניחים אותו בזהירות על גבי המטריצה ​​התומכת של בוטומ &#39;של היחידה. הסרט פולימר יש משטח חלק, שטוח לעקוב חרוט 3 נקבוביות מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכב מחדש את היחידה על ידי הברגה של הכובע בחוזקה על הקרקעית. ודא כי הממברנה אינה משוחררת מהמרכז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המחט של מזרק 1 מ&quot;ל אינסולין לצייר 1 מ&quot;ל של PBS. צרף את המזרק ליחידת המסנן ולאחר מכן לדחוף PBS דרך היחידה כדי להרטיב את הרכבה כדי לבדוק אם יש דליפה כלשהי. </li></ol> 2. הדור של שלפוחית ​​קרום פלזמה (PMVs) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקים תרבות BMSC, כפי שדווח על ידי Nemeth et al. 15 , במדיום התרבות DMEM המכיל 15% FBS ו 1% פניצילין / סטרפטומיצין. לטפח את התאים בצלחת 6-היטב חממה humidified המכיל 5% CO 2 ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפיץ את התאים, להסיר את המדיום תרבות לשטוף היטב עם 0.5 מ&quot;ל של סידן ללא PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מ&quot;ל של 0.25% טריפסין- EDTA ו דגירה התאים על 37 מעלות צלזיוסבמשך 3 דקות. הקש על צלחת על כף היד כמה פעמים כדי להקל על ניתוק התא. עצור עיכול על ידי הוספת 1 מ&quot;ל של המדיום תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף התאים צינור חרוטי 15 מ&quot;ל ספין ב XG 200 דקות 2 בצנטריפוגה הדף הספסל. Resuspend התאים 4 מ&quot;ל של המדיום תרבות aliquot התאים לתוך שתי בארות של צלחת 6-היטב. הערה: תאים מגיעים בדרך כלל ל -24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לייצר PMVs, קציר התאים מבאר אחד (כ 5 x 10 5 תאים) של צלחת 6-היטב על ידי עיכול טריפסין monodisperse התאים 0.5 מ&quot;ל של המדיום תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את התאים לתוך מזרק האינסולין, לצרף אותו יחידת מסנן, ולדחוף את הבוכנה במהירות כדי לסחוט את התאים דרך המסנן. מחק את המדיום extruded כי צריך להיות רק כמה PMVs בתוכו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 0.5 מ&quot;ל נוספת של המדיום לתוך המזרק במהירות לדחוף אותו דרך המסנן. אסף את המדיום של שחול השני, אשר מכיליםS PMVs בגודל שונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 150 μL של המדיום שנאסף לתוך צלחת זכוכית בתחתית 35 מ&quot;מ ולאפשר PMVs להתיישב לתחתית במשך כ 10 דקות. לבחון את PMVs תחת מיקרוסקופ בניגוד שלב הפוכה מצויד במצלמת CCD באמצעות עדשה אובייקטיבית 20X. </li></ol> 3. בחינת התוכן בתוך PMVs באמצעות מיקרוסקופיה Confocal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבצע transfection ב BMSCs, לדלל 2 מיקרוגרם של DNA פלסמיד supercoiled ו 6 μL של מגיב transfection קטיוני ( למשל, PolyJet) ב 50 μL של DMEM חינם בסרום. מערבולת לערבב היטב ספין בקצרה לאסוף את כל הנוזל מן הצדדים של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את הפתרון מדולל (מ שלב 3.1) dropwise לתוך פתרון DNA מדולל, מערבולת חזקה במשך 1 דקות, ספין בקצרה, ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המדיום הישן על BMSCs, אשר כבר seeded על 30% מפגש לילה, עם 2 מ&quot;ל של מדיום תרבות טרי להוסיף DNתערובת transfection dropwise. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף עם 2 מ&quot;ל של מדיום טרי לאחר 12 שעות של transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעקוב אחר cytoplasmically חלבונים מקומיים, transfect התאים עם פלסמיד המכיל קלטת ביטוי EGFP (pEGFP-N1), כמתואר לעיל. קציר התאים על ידי עיכול טריפסין 48 שעות לאחר transfection עבור הדור PMV, כמתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעקוב אחר המיטוכונדריה, כתם התאים עם צבע המיטוכונדריה (1 מיקרומטר, MitoTracker) במדיום תרבות טרי במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לזהות את הפוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה, כתם את התאים עם צבע cyanine JC-1 (5,5 &#39;, 6,6&#39;-tetrachloro-1,1&#39;, 3,3&#39;-tetraethylbenzimi-dazolylcarbocyanine יודיד) (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל) במדיום תרבות טרי 30 דקות ב 37 ° C. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם 0.5 מ&quot;ל של PBS שלוש פעמים ולאחר מכן למסוק את התאים על ידי עיכול טריפסין עבור הדור PMV, כמתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 150 μL של התרופות שנאספוIum לתוך צלחת זכוכית בתחתית 35 מ&quot;מ ולאפשר PMVs להתיישב לתחתית במשך כ 10 דקות. לבחון את PMVs תחת מיקרוסקופ confocal באמצעות העדשה 100X שמן אובייקטיבי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לזהות EGFP או צבע המיטוכונדריה, להפעיל את הלייזר 488 ננומטר ולאסוף את האות ב 505-530 ננומטר. כדי לזהות JC-1, להפעיל את 488 ננומטר ו 543 ננומטר לייזרים ולאסוף אותות ב 505-530 ננומטר 560-615 ננומטר. הגדר את ערך החור ל -1.4. </li></ol> 4. הכנת PMVs מרוכזים על ידי צנטריפוגה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר התאים על ידי עיכול trypsin וליצור PMVs, כמתואר לעיל, ב 0.5 מ&quot;ל של המדיום תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין PMVs ב 1200 xg בצנטריפוגה benchtop במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. בזהירות לשאוב supernatant ו resuspend גלולה μL 100 של המדיום תרבות עם סחרור עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 50 μL של PMVs לתוך צלחת זכוכית בתחתית 35 מ&quot;מ ולאפשר להם להתיישב בטמפרטורת החדר למשך כ 10 דקות. בחן את PMVsתחת מיקרוסקופ confocal באמצעות העדשה 40X שמן אובייקטיבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את הסדרה של polyethylenimine מדולל (PEI) פתרון לתרבות BMSC עבור 1 שעות ולבדוק סימנים של cytotoxicity. הערה: כאן, PEI ב 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​נבחר מאז שום סימן של רעילות זוהה BMSCs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר התאים על ידי עיכול trypsin ולהוסיף PEI ב 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​במשך 1 שעות לחייב את קרום התא כאמצעי למניעת צבירה. ליצור PMVs, כמתואר לעיל, ב 0.5 מ&quot;ל של המדיום תרבות. לרכז את PMVs ולבחון אותם תחת מיקרוסקופ confocal, כמתואר לעיל. </li></ol> 5. הזרקה של PMVs לתוך שריר Gastrocnemius <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי הכתם את הממברנה, להוסיף CM-DII (chloromethyl dialkyl-indocarbocyanine) (10 מיקרומטר) צבע 1 מ&quot;ל של מדיום תרבות טרי BMSCs למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר התאים (על 5 x 10 5 ) על ידי עיכול טריפסין resuspend אותם 0.5 מ&quot;ל של המדיום תרבות. הוסף PEI (2 מיקרוגרם / מ&quot;ל) עבור 1ח. ליצור ולרכז את PMVs μL 100 של המדיום תרבות, כמתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכבר BALB / C על ידי הזרקת סודיום barbital (10 מ&quot;ג / ק&quot;ג) לאחר 12 שעות של צום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את החלק החיצוני של שריר gastrocnemius עם 75% אתנול. לאט לאט להזריק את PMVs (100 μL) לשריר gastrocnemius באמצעות מזרק 30 G אינסולין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מתן ההרדמה, במקום גזה רטוב על העיניים למשך הניסוי ולחמם את העכבר עם אור ליבון עד שהוא מתעורר. בית העכבר לבד בכלוב אוורור הפרט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקצור את שריר gastrocnemius 12 שעות לאחר הניתוח, להרוג את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מפזרים 75% אתנול על שריר gastrocnemius, לפתוח את העור עם מספריים, לחתוך את שריר gastrocnemius כולו בשני הקצוות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את השריר עם PBS ולבחון אותו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות העדשה 20X אובייקטיבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך את השריר עםסכין גילוח חד להסיר את החלקים ללא פלואורסצנטי. חותכים את החלקים עם פלואורסצנטי אדום חזק לתוך כ 9 מ&quot;מ 3 קוביות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבץ כל קובייה במדיום טמפרטורת חיתוך אופטימלי (אוקטובר), לטבול אותו חנקן נוזלי במשך 5 דקות, ולאחסן אותו במקפיא -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את החלקים הקפואים לחתיכות 20 מיקרומטר עבה באמצעות cryostat ו לדבוק כל קטע לשקופית זכוכית. שוטפים את החלק פעם עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר מעגל סביב הקטע עם עט מעגל הכתם ולהוסיף 100 μL של DAPI (1 מיקרוגרם / מ&quot;ל). לשאוב את הפתרון DAPI לאחר 10 דקות הדגירה בטמפרטורת החדר בחושך לשטוף שלוש פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרוק הרכבה שמן על הדגימה, לכסות אותו עם להחליק זכוכית, ואת החותם את השקופית עם לק. לבחון את הקטע תחת מיקרוסקופ confocal באמצעות העדשה 100X שמן אובייקטיבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לזהות CM-DiI, להפעיל את הלייזר 543 ננומטר ולאסוף את האות ב 560-615 ננומטר. כדי לזהות DAPI, הפעל את ה- 405Nm לייזר ולאסוף את האות ב 420-480 ננומטר. הגדר את ערך החור על כ 1.4. </li></ol>

<ol><li>Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+gene+transfer+with+fusogenic+liposomes+containing+vesicular+stomatitis+virus+G+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Enhanced gene transfer with fusogenic liposomes containing vesicular stomatitis virus G glycoprotein.</a> J Virol. 72 (7), 6159-6163 (1998).</li>
<li>Dolatabadi, J., Valizadeh, H., Hamishehkar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+lipid+nanoparticles+as+efficient+drug+and+gene+delivery+systems%3A+recent+breakthroughs%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Pharm+Bull%22%5BJournal%5D)">Solid lipid nanoparticles as efficient drug and gene delivery systems: recent breakthroughs.</a> Adv Pharm Bull. 5 (2), 151-159 (2015).</li>
<li>Torchilin, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional%2C+stimuli-sensitive+nanoparticulate+systems+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Multifunctional, stimuli-sensitive nanoparticulate systems for drug delivery.</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (11), 813-827 (2014).</li>
<li>Wolf, D. P., Mitalipov, N., Mitalipov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+replacement+therapy+in+reproductive+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial replacement therapy in reproductive medicine.</a> Trends Mol Med. 21 (2), 68-76 (2015).</li>
<li>López-Otin, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/abstract/S0092-8674(13)00645-4">The hallmarks of aging.</a> Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).</li>
<li>Plakkal, J., Paul, A. A., Goo, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplet-associated+proteins+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med+Rep%22%5BJournal%5D)">Lipid droplet-associated proteins in atherosclerosis.</a> Mol Med Rep. 13 (6), 4527-4534 (2016).</li>
<li>Hoppener, J. W. M., Ahren, B., Lips, C. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+amyloid+and+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Islet amyloid and type 2 diabetes mellitus.</a> N Engl J Med. 343 (6), 411-419 (2000).</li>
<li>Jagust, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+amyloid-%CE%B2+harmful+to+the+brain%3F+Insights+from+human+imaging+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Is amyloid-β harmful to the brain? Insights from human imaging studies.</a> Brain. 139 (Pt 1), 23-30 (2016).</li>
<li>Naidoo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endoplasmic+reticulum+stress+response+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The endoplasmic reticulum stress response and aging.</a> Rev Neurosci. 20 (1), 23-37 (2009).</li>
<li>Cuervo, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+aging%3A+keeping+that+old+broom+working%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Autophagy and aging: keeping that old broom working.</a> Trends Genet. 24 (12), 604-612 (2008).</li>
<li>Bratic, A., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23454757">The role of mitochondria in aging.</a> J Clin Invest. 123 (3), 951-957 (2013).</li>
<li>Lin, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+VSV-G+produces+fusogenic+plasma+membrane+vesicles+capable+of+efficient+transfer+of+bioactive+macromolecules+and+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Incorporation of VSV-G produces fusogenic plasma membrane vesicles capable of efficient transfer of bioactive macromolecules and mitochondria.</a> Biomed Microdevices. 18 (3), 41(2016).</li>
<li>Riekstina, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+marker+expression+pattern+in+human+mesenchymal+stem+cells+derived+from+bone+marrow%2C+adipose+tissue%2C+heart+and+dermis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell marker expression pattern in human mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, heart and dermis.</a> Stem Cell Rev. 5 (4), 378-386 (2009).</li>
<li>Purandare, B., Teklemariam, T., Zhao, L. M., Hantash, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+HLA+profiling+and+immunomodulatory+effects+of+human+adult+bone+marrow-+and+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Temporal HLA profiling and immunomodulatory effects of human adult bone marrow- and adipose-derived mesenchymal stem cells.</a> Regen Med. 9 (1), 67-79 (2014).</li>
<li>Nemeth, K., Mayer, B., Sworder, B. J., Kuznetsov, S. A., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+culturing+mouse+and+human+bone+marrow+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">A practical guide to culturing mouse and human bone marrow stromal cells.</a> Curr Protoc Immunol. 102, Unit 22F.12 (2013).</li>
<li>Shahabipour, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+Nanoparticulate+tools+for+RNA+interference+and+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Exosomes: Nanoparticulate tools for RNA interference and drug delivery.</a> J Cell Physiol. , [Epub ahead of print (2017).</li>
<li>Lamichhane, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+for+extracellular+vesicles+in+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+B%22%5BJournal%5D)">Emerging roles for extracellular vesicles in tissue engineering and regenerative medicine.</a> Tissue Eng B. 21 (1), 45-54 (2015).</li>
<li>Baumgart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+fluid%2Ffluid+phase+separation+of+proteins+and+lipids+in+giant+plasma+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles.</a> Proc Natl Acad Sci. 104 (9), 3165-3170 (2007).</li>
<li>Sezgin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+membrane+structure+and+protein+behavior+using+giant+plasma+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Elucidating membrane structure and protein behavior using giant plasma membrane vesicles.</a> Nat Protoc. 7 (6), 1042-1051 (2012).</li>
<li>Lingwood, D., Ries, J., Schwille, P., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membranes+are+poised+for+activation+of+raft+phase+coalescence+at+physiological+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Plasma membranes are poised for activation of raft phase coalescence at physiological temperature.</a> Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10005-10010 (2008).</li>
<li>Pandey, A. P., Sawant, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethylenimine%3A+A+versatile%2C+multifunctional+non-viral+vector+for+nucleic+acid+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Sci+Eng+C+Mater+Biol+Appl%22%5BJournal%5D)">Polyethylenimine: A versatile, multifunctional non-viral vector for nucleic acid delivery.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 68, 904-918 (2016).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

לטיפול בתחליפי ציטופלזמה כפי שהוצע בכתב יד זה יש יתרונות ייחודיים על פני גישות מדווחות אחרות כגון טיפול גנטי, מולקולרי ותאי. PMVs הנוצרים מ-BMSCs עוטפים לא רק את התוצרים של גנים גזעיים אלא גם אברונים תאיים שלמים, החיוניים לתיקון הפנוטיפים המזדקנים הקשורים להזדקנות. כאשר ציטופלזמה צעירה מועברת לתאים מזדקנים, המנגנונים הלא תקינים עשויים לקבל הקלה קצרה; במקביל, ניתן לתכנת מחדש את האפיגנום ולהמריץ אותו כדי לספק אפקט ארוך טווח. בנוסף, למיטוכונדריה אקסוגנית עשוי להיות קצב התפשטות מהיר יותר, כפי שצוין במחקר הקודם שלנו<sup class...

<html> כמות עצומה של מאמץ הוקדשה להקמת גישות לטיפול בגנים, באנזים ובתאי החלפת תאים. זה הביא פריצות דרך גדולות ואפילו יישומים קליניים 1 , 2 , 3 . לאחרונה, טיפול מחליף מיטוכונדריה שנוי במחלוקת המבוסס על טכנולוגיית העברת גרעין הוחל על הפריה חוץ גופית עבור נשים בגיל מבוגר או נושא מוטציה דנ&quot;א מיטוכונדריאלית קטלנית 4 . פגמים שנמצאו במחלות הקשורות לגיל, כולל טרשת עורקים, סוכרת מסוג 2, מחלת האלצהיימר וסרטן, הם לרוב רב פנים. זה כבר מתועד כי הצטברות של טיפות השומנים; את התצהיר של חלבון עמילואיד; שימור חלבונים שהתגלגלו בתוך הרשת האנדופלסמית; ו פרוטאזום פגום, autophagosome, ו המיטוכונדריה לתרום להתפתחות או להחמרה של מחלות אלה&quot;Xref&quot;&gt; 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . כיום, אין מנגנון זמין שמטרתו תיקון ישיר של תקלה ב cytosol ו organelles, אשר גורם ההזדקנות ו פנוטיפים ההזדקנות. יש לנו בעבר דיווחו על הדור של שלפוחית ​​הממברנה פלזמה (PMVs) באמצעות שחול מכני של תאים יונקים 12 . למעט הגרעין, נמצאו המרכיבים בממברנה או בציטוסול, כולל חלבונים ורנ&quot;א, כמו גם את האברונים, כמו המיטוכונדריה, ב- PMV. בעיקרו של דבר, PMV יכול להיחשב לתא אנקלאציה מיניאטורי. חשוב יותר, היתוך של PMVs עם תאים Rho0 לקוי המיטוכונדריה משוחזרת פעילות מיטוטית בתנאים התרבות הרגילה. זהו הדו&quot;ח הראשון על establiShing גישה יעילה פוטנציאלית לטיפול החלפת ציטופלסמה. תאי גזע מוחיים mesenchymal העצם (BMSCs) הם תאים אב multipotent כי הם נוצרים באופן שגרתי ממח העצם והם מורחבים בקלות בתרבות. תאים עובריים של תאי גזע Oct4, Nanog ו- SOX2 התגלו ברמות נמוכות ב- MSC 13 . פעילות הטלומראז ניתנת למדידה. בנוסף, היעדרם של מולקולות מעוררות-גומלין ומולקולות מחלקה II של לויקוציטים אנושיים (HLA), כמו גם ביטוי נמוך של HLA Class I ב- MSC, הופכים אותם לתאים אידיאליים לשימוש באלוגני או &quot;מדף&quot; רפואה משובי ויישומים אימונומודולטוריים 14 . כאן, אנו מתארים כיצד להכין PMVs מ BMSCs העכבר באמצעות שחול באמצעות קרום פוליקרבונט עם 3 מיקרוגרם הנקבוביות, לקבוע את קיומו של המיטוכונדריה ולבחון את תחזוקת הפוטנציאל הממברנה ב PMVs באמצעות קונפוקאל מיקרוסקופיה, להכין מרוכזים אך לא מצטברים PMVs על ידי צנטריפוגה, ולבצע את הזרקת vivo של PMVs לשריר gastrocnemius של עכברים.

<table><tbody><tr><td>ממברנות IsoporeTM</td><td>Millipore</td><td>TSTP04700</td><td>3 מ"מ נקבוביות</td></tr><tr><td>יחידת מסנן חד פעמית</td><td>Xinya, שנחאי, סין</td><td>25 מ"מ</td><td>מזרק אינסולין פוליפרופילן בדרגה רפואית</td></tr><tr><td></td><td>BD</td><td>328446</td><td>1 מ"ל</td></tr><tr><td>pN1-EGFP</td><td>Clontech</td><td>&nbsp; 6085-1</td><td></td></tr><tr><td>בדיקות מולקולריות</td><td>MitoTracker</td><td>M7514</td><td>ירוק FM, 1 &mu; M</td></tr><tr><td>JC-1</td><td>Beyotime, היימן, סין</td><td>C2006</td><td>10 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>CM-DiI</td><td>Beyotime, היימן, סין</td><td>C1036</td><td>10 מ"מ</td></tr><tr><td>PEI</td><td>Sigma</td><td>P3143</td><td>Mn = 75,000</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TE 2000</td><td>עם מצלמת CCD</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ Confocol</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 510 Meta</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SigaGen</td><td>SL100688</td><td>לטרנספקציה של תאים</td></tr></tbody></table>

הכנת שלפוחית ​​הממברנה פלסמה מן העצם mesenchymal תאי גזע עבור פוטנציאל החלפת ציטופלזמה

Preparation of Plasma Membrane Vesicles from Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells for Potential Cytoplasm Replacement Therapy

יש לנו בעבר דיווחו על הדור של שלפוחית ​​הממברנה פלזמה (PMVs) באמצעות שחול מכני של תאים יונקים. היתוך של PMVs עם תאים Rho0 לקוי המיטוכונדריה משוחזרת פעילות מיטוטית בתנאים התרבות הרגילה. טרשת עורקים, סוכרת מסוג 2, מחלת האלצהיימר וסרטן הן מחלות הקשורות לגיל, אשר דווחו כי הן קשורות למספר פגמים מכניים ופונקציונליים בציטוזול ובאברונים של מגוון סוגי תאים. תאי גזע מוחיים mesenchymal (BMSCs) מייצגים אוכלוסיית תאים ייחודית ממח העצם, בעלת יכולות התחדשות עצמית, תוך שמירה על ריבוי המרכיבים שלהם. התוספת של תאים ההזדקנות עם cytoplasm צעירים מ BMSCs אוטולוגיים באמצעות היתוך של PMVs מספק גישה מבטיחה כדי לשפר או אפילו הפנוטיפים הקשורים לגיל הקשורים. פרוטוקול זה מתאר כיצד להכין PMVs מ BMSCs באמצעות שחול באמצעות קרום פוליקרבונט עם 31, נקבוביות, לקבוע את קיומה של המיטוכונדריה ולבחון את תחזוקת הפוטנציאל הממברנה בתוך PMVs באמצעות מיקרוסקופ confocal, להתרכז PMVs על ידי צנטריפוגה, ולבצע את הזרקת vivo של PMVs לשריר gastrocnemius של עכברים.

המפתח ההכנה המוצלחת של PMVs תלוי במידה רבה על הרכבה נכונה של יחידת המסנן ( איור 1 ), אשר ניתן לבדוק על ידי דחיפת 1 מ&quot;ל של PBS דרך הממברנה. אם מתרחשת דליפה, חבר מחדש את יחידת המסנן ובדוק שוב. עם זאת, דליפה ניתן רק לבדוק באופן מהימן כאשר תאים נדחפים דרך הממברנה. אם רק כמה PMVs מזוהים תחת מיקרוסקופ רגיל באמצעות המטרה 10X, או אם גודל של PMVs הוא בעיקר סביב 1 מיקרומטר, זה יעיד כי רוב התאים נלכדים בתוך היחידה בשל הרכבה שגוי. PMVs עם...

מחלות הקשורות לגיל קשורות למספר פגמים במרכיבי הציטופלזמה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול להכנת שלפוחית ​​הממברנה פלזמה מתאי גזע העצם mesenchymal. טכניקה זו יכולה לשמש כאמצעי טיפולי החלפת ציטופלסמה כדי לשפר או אפילו הפנוטיפים הקשורים לגיל הקשורים.

הכנת שלפוחית ​​הממברנה פלסמה מן העצם Mesenchymal תאי גזע עבור פוטנציאל החלפת ציטופלזמה

We have previously reported on the generation of plasma membrane vesicles (PMVs) through the mechanical extrusion of mammalian cells. The fusion of PMVs ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להעביר טיפול חדש להחלפת ציטופלזמה לשריר הגסטרוקנמיאוס (gastrocnemius) של עכברים באמצעות וסיקולות של ממברנת הפלזמה, או PMVs, המופקות מתאי גזע מזנכימליים של מח עצם עכבר, או BMSCs. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות האם תוספת של ציטופלזמה צעירה מתאי BMSC אחרים באמצעות היתוך PMV יכולה לשפר או אפילו להפוך פנוטיפים הקשורים לגיל. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לבצע כיסוי של ציטזול של BMSC בתוך PMV, וניתן להשרות זאת באופן מיידי באמצעות דחיפה מכנית.בעת הדגמת שיטה זו, קריטי להדגים את שלבי הבליטה והבנייה, שכן קשה ללמוד אותם בניסויים בלבד ללא שליטה מלאה בביצועם. כדי לייצר את ה-PMVs, תרבתו תחילה תאי BMSCs של עכבר במצע תרבית DMEM מלא בבאר אחת של פלטת שש בארות, בתוך אינקובטור לח בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide. כאשר התאים יגיעו ל-90% confluency, שטפו את הבאר עם 0.5 milliliters של PBS נטול סידן ונתקו את התאים באמצעות 0.5 milliliters של 0.25% trypsin-EDTA.לאחר שלוש דקות בטמפרטורה של 37 °C, הקישו על הפלטה מספר פעמים באמצעות כף היד כדי להקל על התנתקות התאים, ועצרו את העיכול באמצעות 1 mL של מצע תרבית. העבירו את התאים לשפופרת קונית של 5 mL לצורך סנטריפוגה, ותלו את המשקע ב-4 mL של מצע תרבית טרי. לאחר מכן, חלקו את התאים בין שתי בארות של פלטת 6 בארות חדשה, והחזירו את הפלטה לאינקובטור לתרבית תאים למשך 24 שעות.ביום למחרת, קצרו את התאים מבאר אחת באמצעות עיכול בטריפסין כפי שהודגם זה עתה. השביו את המשקע ב-0.5 milliliters של מצע גידול טרי לאחר איסוף על ידי סרכזגית. העבירו את התאים למזרק אינסולין של one milliliter וחברו את המזרק ליחידת סינון.לחצו במהירות על הבוכנה כדי לסחוט את התאים דרך המסנן, והשליכו את המצע שנסחט. לאחר מכן, טענו והעבירו 0.5 milliliters של מצע גידול נוסף דרך המסנן כפי שהודגם כעת, ואספו את המצע מהסחיטה השנייה. זרעו 150 microliters מהמצע שנאסף לתוך צלחת עם תחתית זכוכית של 35 milliliter והמתינו כ-10 דקות עד שהשלפוחיות ישקעו.לאחר מכן, אשר את נוכחות ה-PMVs תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה (phase contrast) הפוך המצויד במצלמת CCD, תוך שימוש בעדשה אובייקטיבית של 20 פעמים. כדי לעקוב אחר המעטפת המיטוכונדריאלית ופוטנציאל הממברנה ב-PMVs, צבע תרבית BMSC בהספקה (confluency) של 90% בצבע מיטוכונדריאלי מתאים או בגשש לפוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלית, בהתאמה, בתוך מצע גידול טרי למשך 30 דקות ב-37 degrees Celsius. לאחר מכן, שטוף את התאים שלוש פעמים עם 0.5 milliliters של PBS לכל שטיפה ואסוף את התאים באמצעות עיכול בטריפסין ליצירת PMV, כפי שהודגם זה עתה לצורך הדמייתם במיקרוסקופיה קונפוקלית.כדי לעקוב אחר הלוקליזציה הציטופלזמית של חלבוני ה-PMV, ראשית דללו 2 µg של DNA פלסמידי supercoiled עבור קסאט ביטוי של EGFP ו-6 µL של ריאגנט טרנספקציה קטיוני בשפופרות נפרדות של 0.5 mL המכילות 50 µL של DMEM ללא סרום. ערבבו את השפופרות ב-Vortex, ולאחר מכן בצעו סנטריפוגה קצרה. לאחר מכן, הוסיפו את ריאגנט הטרנספקציה בטיפות לשפופרה המכילה את תמיסת ה-DNA המדוללת.ערבבו את תערובת הטרנספקציה של ה-DNA ב-Vortex בעוצמה למשך דקה אחת, ולאחר מכן בצעו ספין קצר ודגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הזינו תרבית BMSC בנשיאות של 30% בפלטה של שישה בארות בשני מיליליטר של מצע גידול טרי, והוסיפו את תערובת ה-DNA לתאים בטפטוף. 48 שעות לאחר הטרנספקציה, קצרו את ה-BMSC באמצעות עיכול בטריפסין והכינו PMVs כפי שהודגם הרגע.ניתן לנתח את ה-PMVs באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית עם עדשת שמן בפי 100. לפני הזרקת ה-PMVs, סמנו תרבית BMSC באמצעות צבע פלואורסצנטי למעקב אחר תאים לצביעת ממברנה ב-1 ml של מצע תרבית טרי ב-37 °C למשך 30 דקות, ואספו את התאים באמצעות עיכול בטריפסין. השהו מחדש את התאים המסומנים ב-0.5 ml של מצע תרבית טרי בתוספת 1 µg של polyethylene amine והכינו PMVs כפי שהודגם.לאחר מכן, רכז את ה-PMVs באמצעות סנטריפוגציה והשב את המשקע ב-100 µL של מצע גידול טרי תוך כדי ערבוב עדין. לאחר מכן, טען את התאים למזרק אינסולין של 1 mL המצויד במחט gauge 30, וחטא את החלק החיצוני של שריר ה-gastrocnemius של עכבר BALB/c בהרדמה באמצעות 75% ethanol. לאחר מכן, הזרק לאט את כל נפח ה-PMVs אל תוך השריר והשאר את בעל החיים להתאושש תחת מנורת חימום.לאחר 12 שעות, פזר את ה-75% ethanol על השריר, פתח את העור בעזרת מספריים, וגזור את שריר ה-gastrocnemius במלואו משני קצותיו. שטוף את השריר ב-PBS והנח אותו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה. באמצעות עדשה אובייקטיבית של 20 פעמים, הסר את חלקי רקמת השריר שאינם פלואורסצנטיים בעזרת להב תער חד, וקצץ את החלקים שנותרו, המפגינים פלואורסצנציה אדומה חזקה, לקוביות של כ-9 מילימטר מעוקב.טמיעו כל קובייה בתווך OCT (optimal cutting temperature medium). לאחר מכן, טבלו את הקוביות בחנקן נוזלי למשך חמש דקות. שמרו את דגימות הרקמה בטמפרטורה של 20- °C עד למועד ניתוחן.PMVs שהופקו מ-BMSCs, כפי שהודגם, מראים בעיקר גודל בטווח של כ-3 מיקרומטרים בקוטר, כפי שנבדק תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה באמצעות עדשה של 20x. טרנספקציה של BMSC עם קסטה לביטוי פלואורסצנטי למשך 48 שעות ממחישה את הכלילה הציטופלזמית של חלבון EGFP על ידי ה-PMVs. יתרה מכך, צביעה עם צבע מיטוכונדרי פלואורסצנטי חושפת שחלק גדול מה-PMVs מכילים מיטוכונדריה.מרביתם נצבעים באופן חיובי בצבע לפוטנציאל ממברנת המיטוכונדריה, דבר המעיד על תפקוד המיטוכונדריה. טיפול ב-Polyethylene amine לפני מתן in vivo מונע אגרגציה של PMV במהלך ריכוזם בצנטריפוגה לצורך הסרת רכיבים תאיים. סימון במ membrance dye של ה-BMSCs לפני יצירת ה-PMV מקל על יצירת PMVs הניתנים למעקב פלואורסצנטי.למעשה, הדמיה של חתכים קפואים של שריר הגסטרוקנמיוס (gastrocnemius) לאחר הזרקה תוך-שרירית של PMVs מסומנים מעידה על העברת ה-PMVs לציטופלזמה של תאי השריר, ככל הנראה באמצעות אנדוציטוזה. בעת ביצוע הליך ייצור ה-PMVs, חשוב לזכור למלא את המזרק במספר התאים המתאים כדי ללחוץ על הבוכנה במהירות בעת שטיפת התאים דרך המסנן. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הטיפול בתאי גזע לחקור טיפול במחלות הקשורות לגיל בעכברים.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הכנת PMV מ-BMSC לצורך העברת ציטופלזמה אל שריר ה-gastrocnemius של עכברים.

preparation-plasma-membrane-vesicles-from-bone-marrow-mesenchymal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

טכניקה ניסויית לטיפול בפגמי osteochondral במפרק הברך של הארנב מתוארת. ההשתלה של תאי גזע מזנכימיים אלוגניות לפגמי osteochondral מספקת פיתוח מבטיח בתחום הנדסת רקמות. הכנת הפיברין-תא...

טיפול במומי Osteochondral במפרק הברך של הארנב על ידי השתלה של תאי גזע mesenchymal אלוגנאית בקרישי הפיברין

סרטון זה מדגים שיטה ליצירת בועיות קרום פלזמה מתאי גזע של מח עצם על ידי העברתן במהירות דרך מסנן ממברנה. PMV אלה מראים פוטנציאל לטיפול בתחליפי ציטופלסמה.

יצירת בועיות קרום פלזמה מתאי גזע מח עצם

לתאי גזע מזנכימליים (MSCs) יש פוטנציאל התמיינות לקראת שושלת אוסטאובלסטית כאשר הם מגורים עם גורמים מסיסים או ביו-חומרים ספציפיים. עבודה זו מציגה אפשרות חדשה להעברת MSCs מקרום מי השפיר האנושי (AM-hMSCs) המעסיק את מטריצת עצם הבקר Nukbone (NKB) כפיגום.

בידוד של תאי גזע mesenchymal האדם והטיפוח שלהם על עצם מטריקס הנקבובי

תאי גזע מזנכימליים מתקבלים בדרך כלל ממח עצם ודורשים תרבית הרחבה. כאשר דגימות נקרשות לפני העיבוד, ניתן ליישם פרוטוקול המשתמש בתרופה הטרומבוליטית (האנזימטית) אורוקינאז כדי לפרק את הקריש. לפיכך, תאים משתחררים וזמינים לתרבית הרחבה. פרוטוקול זה מספק אלטרנטיבה מהירה וזולה לדגימה מחדש.

שיטה אנזימתי להציל תאי גזע mesenchymal מדוגמאות קרשו מח העצם

כאן אנו מתארים פרוטוקול אופטימלי וניתן לשחזור מאוד לבידוד תאי אב מזודרמליים (MPCs) ממח עצם אנושי (hBM). MPCs אופיינו בזרימה ציטומטרית וביטוי נסטין. הם הראו את היכולת להוליד תרביות תאים דמויות MSC הגדלות באופן אקספוננציאלי תוך שמירה על הפוטנציאל האנגיוגני שלהן.

תאי בידוד ובתאי Mesangiogenic (MPCs) מן האדם מח עצם

Culturing תאי mesenchymal סטרומה אדם (hMSCs) עם סרום אוטולוגי, מפחית את הסיכונים של דחייה על ידי חומר xenogeneic והשפעות שליליות אחרות. זה גם מאפשר ההתאוששות של תת-קבוצה של אבות mesodermal, אשר יכול לספק hMSCs הטרי. Embedding hMSCs ב קריש הפיברין עצמי מאפשר טיפול קל והשתלת כירורגים יעילה.

תרבות משלוח Cell mesenchymal סטרומה ב עצמי תנאים: גישה חכמה עבור יישומים אורתופדיות

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הצנטריפוגה הדיפרנציאלית לבידוד ואפיון כלי רכב חשמליים מייצגים (אקסוזומים ומיקרובוסיקלים) מתאי MSC אנושיים מתורבתים. יישומים נוספים של כלי רכב חשמליים אלה מוסברים גם במאמר זה.

בידוד, אפיון ויישום טיפולי של שלפוחיות חוץ-תאיות מתאי גזע מזנכימליים אנושיים בתרבית

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה חסכונית לטיהור, הרחבה ואפיון תאי גזע מזנכימליים הומוגניים ביותר של מח עצם (BMSCs) מעכברים. גישה זו מאפשרת רכישה של כמויות גדולות של BMSCs עם פוטנציאל התפשטות והתמיינות גבוה, תמיכה במודלים של עכברים וקידום מחקר פרה-קליני.

טיהור, הרחבה ופנוטיפ מבוסס ציטומטריה של תאי גזע מזנכימליים במח עצם שמקורם בעכבר

פרוטוקול זה נועד להציג שיטה לייצור וטיהור ביומימטיקה של וזיקולה חוץ-תאית שמקורם בתאי גזע מזנכימיים (MSC) לטיפול גנטי. הננווסיקולה מוגבלת לשכבות ליפידים שמקורן ב-MSC ומכילה AAVs רקומביננטיים הנושאים את הגן המעניין בלומן. ננו-ווסיקולה זו מספקת וקטור משופר להעברת גנים ב-in vivo .

פיתוח ננוביסיקולות עטופות בממברנה של תאי גזע מזנכימיים לשיפור העברת הגנים

בזאת אנו מתארים שיטות לנתיחה של רקמות יולדות ועובר מן שלית מונח אנושית, ואחריו בידוד והרחבת גזע mesenchymal / בתאי סטרומה (MSC) מרקמות אלה.

בידוד הרחבת גזע mesenchymal / תאי סטרומה נגזרו רקמה אנושית שליה

חקור הכנת שלפוחיות ממברנה פלסמה מתאי גזע מזנכימליים ממח עצם לטיפול החלפת ציטופלזמה. שיטה זו מאפשרת מחקר הפיכת תסמיני הזדקנות בתאים מבוגרים באמצעות ציטופלזמה צעירה.

הכנת שלפוחית ​​הממברנה פלסמה מן העצם Mesenchymal תאי גזע עבור פוטנציאל החלפת ציטופלזמה

גלה סרטונים נוספים

הכנת שלפוחית הממברנה פלסמה מן העצם Mesenchymal תאי גזע עבור פוטנציאל החלפת ציטופלזמה