הכנת שלפוחית ​​הממברנה פלסמה מן העצם Mesenchymal תאי גזע עבור פוטנציאל החלפת ציטופלזמה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לספק טיפול תחליפי ציטופלזמה חדשני לשריר הגסטרוקנמיוס של עכברים באמצעות שלפוחיות קרום פלזמה, או PMVs שמקורם בתאי גזע מזנכימליים של מח עצם עכבר או BMSCs. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות עם תוספת תאים עם ציטופלזמה צעירה מ-BMSC אחר באמצעות היתוך PMV יכול לשפר או אפילו להפוך את הפנוטיפים האסוציאטיביים של הגיל. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא זה עטיפת PMV של ציטוזול BMSC וניתן להשרות אותו באופן מיידי על ידי שחול מכני.

כאשר אתה מדגים את השיטה הזו זה קריטי מכיוון שאתה מוציא ושלבי בנייה קשה ללמוד על ידי בדיקה לבעלות בפועל. כדי ליצור את ה-PMVs, BMSCs של עכבר תרבית ראשונה במדיום תרבית DMEM שלם בבאר אחת של צלחת שש בארות באינקובטור לח ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. כאשר התאים הגיעו למפגש של 90%, יש לשטוף את הבאר עם 0.5 מיליליטר PBS נטול סידן ולנתק את התאים עם 0.5 מיליליטר של 0.25% טריפסין-EDTA.

לאחר שלוש דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס, הקש על הצלחת בכף היד כמה פעמים כדי להקל על דיסוציאציה של תאים ולעצור את העיכול עם מיליליטר אחד של מדיום תרבית. העבירו את התאים לצינור חרוטי של חמישה מיליליטר לצנטריפוגה והשעו מחדש את הגלולה בארבעה מיליליטר של מדיום תרבית טרי. לאחר מכן חלקו את התאים בין שתי בארות של צלחת חדשה של שש בארות והחזירו את הצלחת לחממת תרבית התאים למשך 24 שעות.

למחרת, קצרו את התאים מבאר אחת על ידי עיכול טריפסין כפי שהודגם זה עתה. השעיית הגלולה ב-0.5 מיליליטר של מדיום תרבית טרי לאחר האיסוף על ידי צנטריפוגה. טען את התאים למזרק אינסולין של מיליליטר אחד והצמד את המזרק ליחידת פילטר.

לחץ במהירות על הבוכנה כדי לסחוט את התאים דרך המסנן, והשליך את המדיום המוחצן. לאחר מכן טען והוציאו 0.5 מיליליטר של מדיום תרבית נוסף דרך המסנן כפי שהודגם זה עתה, ואספו את המדיום מהשחול השני. זרעו 150 מיקרוליטר מהמדיום שנאסף לכלי תחתון זכוכית של 35 מיליליטר והניחו לשלפוחיות להתיישב כ -10 דקות.

לאחר מכן אשר את נוכחותם של PMV תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוך המצויד במצלמת CCD באמצעות עדשה אובייקטיבית פי 20. כדי לעקוב אחר המתחם המיטוכונדריאלי ופוטנציאל הממברנה ב-PMVs, צבעו תרבית BMSC קונפלונטית של 90% עם צבע מיטוכונדריאלי מתאים או בדיקה פוטנציאלית של ממברנה מיטוכונדריאלית בהתאמה במדיום תרבית טרי למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן שטפו את התאים שלוש פעמים עם 0.5 מיליליטר PBS לכל שטיפה וקצרו את התאים על ידי עיכול טריפסין ליצירת PMV כפי שהודגם זה עתה להדמיה שלהם במיקרוסקופיה קונפוקלית.

כדי לעקוב אחר הלוקליזציה הציטופלזמית של חלבוני ה-PMV, יש לדלל תחילה שני מיקרוגרם של DNA פלסמיד מפותל עבור קלטת ביטוי EGFP ושישה מיקרוליטרים של מגיב טרנספקציה קטיוני בצינורות בודדים של 0.5 מיליליטר המכילים 50 מיקרוליטר של DMEM ללא סרום. מערבולת את הצינורות, ואחריה צנטריפוגה קצרה. לאחר מכן הוסף את טיפת מגיב הטרנספקציה לתוך הצינור המכיל את תמיסת ה-DNA המדוללת.

מערבולת את תערובת טרנספקציית ה-DNA בחוזקה במשך דקה אחת, ולאחר מכן סיבוב קצר בדגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, האכילו תרבית BMSC משולבת של 30% בצלחת שש בארות עם שני מיליליטר של מדיום תרבית טרי והוסיפו את תערובת ה-DNA בחוכמה לתאים. 48 שעות לאחר הטרנספקציה שלהם, קצרו את ה-BMSC על ידי עיכול טריפסין והכינו PMV כפי שהודגם זה עתה.

לאחר מכן ניתן לנתח את ה-PMV על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית באמצעות יעד שמן פי 100. לפני הזרקת ה-PMV, סמן תרבית BMSC עם צבע מעקב אחר תאים פלואורסצנטיים המכתים ממברנה במיליליטר אחד של מדיום תרבית טרי ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות וקצור את התאים על ידי עיכול טריפסין. השעו מחדש את התאים המסומנים ב-0.5 מיליליטר של מדיום תרבית טרי בתוספת מיקרוגרם אחד של פוליאתילן אמין והכינו PMV כפי שהודגם.

לאחר מכן רכזו את ה-PMV על ידי צנטריפוגה והשעו מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר של מדיום תרבית טרי עם מערבולת עדינה. לאחר מכן, טען את התאים למזרק אינסולין של מיליליטר אחד המצויד במחט בגודל 30 וחטא את החלק החיצוני של שריר הגסטרוקנמיוס של עכבר BALB/c מורדם עם 75% אתנול. לאחר מכן הזריקו לאט את כל נפח ה-PMV לשריר ואפשרו לבעל החיים להתאושש תחת מנורת חום.

לאחר 12 שעות, מפזרים אתנול 75% על השריר, פותחים את העור במספריים וקוצרים את כל שריר הגסטרוקנמיוס בשני קצותיו. שטפו את השריר עם PBS והניחו אותו מתחת למיקרוסקופ פלואורסצנטי. באמצעות עדשת האובייקטיביות פי 20, הסר את חלקי רקמת השריר שאינם פלואורסצנטיים בעזרת סכין גילוח חד וטחנו את חלקי הפלואורסצנט האדומים החזקים הנותרים לכ-9 קוביות מילימטר מעוקב.

הטמע כל קוביה במדיום טמפרטורת חיתוך אופטימלית. לאחר מכן טבלו את הקוביות בחנקן נוזלי למשך חמש דקות. ולאחסן את דגימות הרקמה במינוס 20 מעלות צלזיוס עד לניתוחן.

PMVs שנוצרו מ-BMSCs כפי שהודגם מציגים בעיקר גודל בטווח של כשלושה מיקרומטר בקוטר כפי שנבדק במיקרוסקופ ניגודיות פאזה תוך שימוש במטרה פי 20. טרנספקציה של BMSC עם קלטת ביטוי פלואורסצנטית למשך 48 שעות ממחישה את האנקפסולציה הציטופלזמית של חלבון ה-EGFP על ידי ה-PMVs. יתר על כן, עמידה עם צבע מיטוכונדריאלי פלואורסצנטי מגלה שחלק גדול מה-PMV מכילים מיטוכונדריה.

רובם מכתימים חיובי לצבע פוטנציאלי של קרום מיטוכונדריה, מה שמעיד על הפונקציונליות של המיטוכונדריה. טיפול בפוליאתילן אמין לפני מתן ה-en vivo מונע צבירת PMV במהלך הריכוז הצנטריפוגלי שלהם להסרת רכיבים תאיים. תיוג צבע ממברנה של ה-BMSCs לפני יצירת PMV מקל על יצירת PMV הניתנים למעקב פלואורסצנטי.

ואכן, הדמיה של חלקים קפואים של שריר הגסטרוקנמיוס לאחר אספקה תוך שרירית של PMVs מסומנים מצביעה על העברת PMV לציטופלזמה של תאי השריר כנראה באמצעות אנדוציטוזיס. כאשר מנסים את הליך יצירת ה-PMV, חשוב לזכור להעמיס את המזרק במספר התאים המתאים כדי ללחוץ על הבוכנה במהירות בעת שטיפת התאים דרך המסנן. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הטיפול בתאי גזע לחקור את הטיפול במחלות הקשורות לגיל בעכברים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין PMV מ- BMSC להעברת ציטופלזמה לשריר הגסטרוקנמיוס של עכברים.