Glycoengineering מטבולית של חומצה Sialic באמצעות N-acyl השומן-שונה Mannosamines

המטרה הכוללת של טכניקה זו היא ליצור תאים או מוצרים שמקורם בתאים עם ביטוי חומצה סיאלית שונה. לכן, תאים מטופלים במנוסאמינים שעברו שינוי N-acyl אשר עוברים חילוף חומרים לחומצות הסיאליות המתאימות ולאחר מכן מתבטאים על פני התא. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הגליקוביולוגיה, כגון ההשפעה על גליקוקונוגטים על אינטראקציות קולטן-ליגנד.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא קלה ליישום וציטוטוקסית גרידא. כדי להדגים הנדסה מטבולית, נשתמש ב-N-אצטילמנוסאמין, הזמין מסחרית. יתר על כן, נדגים את הסינתזה והשימוש ב-N-propionyl ו-N-butanoylmannosamine.

מוצגת ההשפעות הביולוגיות של גליקוהנדסה מטבולית על ביטוי חומצה פוליסיאלית. ראשית, ממיסים 431.2 מיליגרם של מנוסאמין הידרוכלוריד ב-10 מיליליטר של תמיסת נתרן מתוקסיד של שלושה מילי-מולרי בבקבוק זכוכית של 15 מיליליטר המכיל מוט ערבוב. מצננים את התערובת על קרח לאפס מעלות צלזיוס.

תוך כדי ערבוב, הוסיפו לאט 210 מיקרומטר של פרופיוניל כלוריד טיפה לתמיסה. לאחר מכן, דגרו על תערובת הערבוב באפס מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות. לאחר מכן, העבירו את התמיסה לצינור פלסטיק של 50 מיליליטר ותקעו ארבעה עד 8 חורים במכסה הצינור בעזרת מחט דקה.

הקפיאו במהירות את התמיסה באמצעות חנקן נוזלי. לאחר מכן, ליופיל את הדגימה עד שהיא מתייבשת לחלוטין. לאחר הליופיליזציה, ממיסים את המוצר המיובש באתיל אצטט, מתנול ומים.

בעזרת פיפטה, טען את התמיסה על עמוד סיליקה ג'ל שהוכן בעבר. לאחר הסרת 500 מיליליטר ממס, אספו ארבעה שברי מיליליטר. העבירו את השברים המנופחים לצינור פלסטיק של 15 מיליליטר, ותקעו שלושה עד שישה חורים במכסה הצינור בעזרת מחט דקה.

לאחר הקפאת התמיסה בחנקן נוזלי, יש ליופיליזציה של הדגימה עד לייבוש מלא. תרבית תאי נוירובלסטומה קלי במדיום RPMI ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. לפני יישום המנוסאמינים, נתק את תאי הנוירובלסטומה של קלי על ידי דגירה למשך 10 דקות עם טריפסין ו-EDTA.

לאחר נטרול הטריפסין עם מדיום RPMI, ספרו את התאים באמצעות תא נויבאואר. כדי למדוד חד-סוכרים של חומצה סיאלית, הושיבו את התאים ב-500 מיקרוליטר של מדיום לתוך צלחת תרבית רקמה של 48 בארות. לניתוח חומצות פוליסיאליות, הושיבו את התאים בשלושה מיליליטר של מדיום על צלחת תרבית תאים בקוטר שישה סנטימטרים.

הוסיפו את נגזרות המנוסאמין המתאימות, המומסות ב-RPMI, לתאים המצופים הטריים, בריכוז סופי של 5 מילי-מולרי ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני, והחליפו את המדיום המכיל את ה-N-acyl שעברו שינוי ב-Mannosamines כל 24 שעות. לאחר הטיפול יש לשפוך את המדיום ולשטוף את התאים עם PBS. נתק את התאים על ידי דגירה למשך 10 דקות עם טריפסין ו-EDTA.

נטרל את הטריפסין על ידי הוספת אותו נפח של מדיום תרבית תאים לתאים המנותקים. לאחר מכן, העבירו את התאים המנותקים לצינורות פלסטיק של 15 מיליליטר. צנטריפוגה של הדגימות למשך שלוש דקות בטמפרטורה של 500 פעמים G.לאחר השלכת הסופרנטנט, שטפו את התאים שלוש פעמים עם חמישה מיליליטר PBS.

לאחר צנטריפוגה, השעו מחדש את כדורי התאים שנאספו ב-500 מיקרוליטר של מאגר ליזה HPLC קר כקרח. אולטרסאונד את הדגימות עם מחט מעבד קולי שלוש פעמים למשך 30 שניות באמפליטודות בינוניות-גבוהות, וקירור הדגימות על קרח למשך דקה אחת לפחות בין המחזורים. לאחר צנטריפוגה של דגימות התאים הליזים, הפרד את הסופרנטנט משברי הממברנה בצינורות פלסטיק של 1.5 מיליליטר.

להידרוליזה חומצית, הוסף 150 מיקרוליטר של תמיסת TFA טוחנת אחת לשברי הממברנה המופרדים. דגרו את הדגימות במשך ארבע שעות בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס עם טלטול במהירות של 200 עד 600 סל"ד. לאחר מכן, העבירו את הדגימות לצינורות סינון של 0.5 מיליליטר עם שלוש ממברנות הרחקה של קילודלטון.

צנטריפוגה את הדגימות למשך כ-30 דקות ב-20, 000 פעמים G ו-21 מעלות צלזיוס, עד שנפח הפאזה העליונה הוא פחות מ-20 מיקרוליטר. לאחר מכן, השליכו את התוספות ותקעו שניים עד ארבעה חורים במכסי הצינורות המכילים את האולטרה-פילטראט בעזרת מחט דקה. לאחר הקפאת הדגימות בחנקן נוזלי, ליופיל אותן למשך הלילה.

השעו מחדש את הדגימות המיובשות ב-10 מיקרוליטר של תמיסת TFA של 120 מילי-מולרי, והוסיפו 50 מיקרוליטר של תמיסת DMB. העבירו את הדגימות לצינורות כהים של 1.5 מיליליטר כדי להגן עליהם מפני אור אולטרה סגול. דגירה של דגימות קרום התא ותקנים למשך 1.5 שעות בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס.

לאחר הדגירה, הוסף ארבעה מיקרוליטר של תמיסת נתרן הידרוקסיד 400 מילי-מולרית לכל דגימה כדי לעצור את תגובת התיוג. לניתוח HPLC, הגדר את טמפרטורת העמודה ל-40 מעלות צלזיוס והגדר את גלאי הקרינה ל-373 ננומטר לעירור, ו-448 ננומטר להשמטה, בהתאמה. הזרקו 10 מיקרוליטר מנפח הדגימה, והפרידו את הבדיקות למשך 15 דקות בקצב זרימה של 0.5 מיליליטר לדקה עם מתנול, אצטוניטריל ומים כחומר הנוזל.

לניתוח ספקטרומטריית מסה, הזרקו 20 מיקרוליטר מכל דגימת HPLC שנאספה למערכת גלאי סלקטיבי מסה LC. בתוכנת ההערכה של מערכת הגלאי הסלקטיבי של מסה LC, בחר את שיא העניין בכרומטוגרמה הכוללת של היונים. הצג את ספקטרום המסה של השיא שנפתר והצג את יחס המסה למטען החיובי בין 300 ל-700.

הוסף מיליליטר אחד של מאגר ליזה של כתם מערבי לכדורים שהוכנו בעבר של תאים מהונדסים בגליקו, ומערבולת. דגרו את הדגימות במשך 30 דקות על קרח, מערבולת כל חמש דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימות למשך 1.5 שעות בטמפרטורה של 20, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, אספו את הסופרנטנט המכיל את החלבונים מהתאים הליזים לתוך צינורות של 1.5 מיליליטר. הכן את הדגימות לדף SDS על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של מאגר דגימת Laemmli ל-90 מיקרוליטר מכל חלק חלבון. מרתיחים את הדגימות במשך חמש דקות.

לאחר העמסת הדגימות על ג'ל 8%SDS-אקרילאמיד, הפעל את הג'ל ב-25 מיליאמפר למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. בסיום, הסר בזהירות את מכסה הזכוכית מהג'ל וחתוך את החלק העליון של הג'ל המכיל את כיסי הטעינה. לאחר מכן, הניחו את הג'ל על קרום מיקרו ניטרוצלולוז 0.2, שהושרה בעבר במאגר כתמים מערבי.

מעבירים את החלבונים לניטרוצלולוזה על פי המלצת המערכת. לאחר הסרת קרום הניטרוצלולוזה ממערכת הספיגה, יש לצבוע את הכתם באדום פונסו כדי לדמיין את החלבונים ובכך לשלוט באיכות ההעברה. לאחר מכן, העבירו את קרום הניטרוצלולוזה לתא פלסטיק והוסיפו 10 מיליליטר של תמיסת חסימה.

לאחר הדגירה של קרום הניטרוצלולוזה, יש לשפוך את התמיסה החוסמת, ולהוסיף נוגדן חומצה אנטי-פוליסיאלית חד-שבטית 735 ב-PBS. לאחר הדגירה יש לשטוף את הממברנה לפחות שלוש פעמים למשך חמש דקות עם PBS. כעת, הוסף נוגדן משני פוליקלונלי נגד עכבר IgG בשילוב עם חזרת פרוקסידאז, לקרום הניטרוצלולוזה.

לאחר הדגירה ושטיפת הממברנה, העבירו אותה לצלחת של הדמיה מתאימה. לאחר מכן, זהה את האות בהתאם להוראות היצרן. DMB, שכותרתו חומצה נויראמנית N-גליקוליל, נפלט בין שבע לתשע דקות.

בנוסף, DMB שכותרתו חומצה נויראמנית N-אצטיל פולטת בין 10 ל-12 דקות. מספר פסגות קטנות יותר שנצפו בכרומטוגרמה מייצגות DMB ומתווכי תגובה שלא הגיבו. כרומטוגרמות ה-HPLC של הליזטים של התאים מציגות מספר פסגות לא מוגדרות, המייצגות זיהומים פנימיים ותוצרי לוואי של DMB מתגובה עם חומצות אלפא קטו אחרות הקיימות בליזטים של התא.

טיפול ב-N-אצטיל מנוסאמין מוביל לעתים קרובות לדלדול של חומצה N-גליקולילנויראמנית על פני התא. בכרומטוגרמות של תאים שעברו ליזה שטופלו בחומצה נויראמנית N-propionyl או בחומצה נויראמנית N-בוטנויל, נצפים פסגות המצביעות על הופעת החומצות הסיאליות הלא טבעיות המתאימות. התגובה של DMB עם מיני חומצה סיאלית מובילה לעלייה במסה המולקולרית של 116.2 דלטון, בהשוואה למיני החומצה הסיאלית שאינם מסומנים בצבע זה.

מלבד מיני היונים החזקים, נצפים גם תוספות הנתרן. DMB-Neu5Gc נפלט זמן קצר לאחר מיני DMB שלא הגיבו או הגיבו חלקית, מה שמסביר את הופעתם של שיאים לא מוגדרים בספקטרום המסה של DMB-Neu5Gc. טיפול בתאי נוירובלסטומה של קלי עם N-propionylmannosamine או N-butanoylmannosamine מוביל לביטוי מופחת של חומצה פוליסיאטית על פני התא.

טיפול ב-N-אצטילמנוזאמין לעומת זאת, מוביל לביטוי מוגבר של חומצה פוליסיאטית. על ידי יישום טכניקה זו, ניתן ליצור תאים עם סיאלילציה מוחלטת תוך מספר ימים. ניתן להשתמש בתאים גליקו-מהונדסים כאלה בניסויים נוספים.

לדוגמה, לחקור אינטראקציות קולטן-ליגנד או כפי שמוצג כאן, לעכב את הביטוי של חומצה פוליסיאטית. הליך ההנדסה המטבולית המוצג כאן מותאם לניסויים בחומצה סיאלית. עם זאת, ניתן להשתמש באותו הליך גם בניסויים בבעלי חיים.

אנו מקווים שהפרוטוקול שהצגנו והפקת הווידיאו הזו יעזרו למחברים להביא גליקו-הנדסה מטבולית למעבדות כדי לנתח את התפקוד וגם את התפקיד הביולוגי של קולטני חומצה סיאלית וחומצה סיאלית במערכות ביולוגיות. כימאים אורגניים יכולים לסנתז מנוסאמינים שעברו שינוי N-acyl עם מבנים מורכבים יותר ולהשתמש בהם כפי שהוצע בפרוטוקול שלנו. בהתאם לפרוטוקול שלנו, יש לנתח את כל הדגימות מיד לאחר תיוג פלואורסצנטי.

כתוצאה מכך, לא אמור להיות עיכוב בין מנתחי HPLC ו-ACMS.