Name: טיהור של biotinylated Cell חלבונים משטח מ Rhipicephalus microplus תאים אפיתל גוט (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: חקור שיטה לבידוד תאים אפיתליים מרקמת מעי של Rhipicephalus microplus באמצעות מדרגת Percoll. טיהור חלבוני פני שטח מוביוטיניל באמצעות חרוזים מגנטיים סטרפטאבידין מאפשר ניתוח תפקודי התאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות ל Biosecurity המושבה הטיקאית (מחלקת קווינסלנד לחקלאות ודיג באוסטרליה) על אספקת Rhipicephalus microplus קרציות מנוצל עבור מחקר זה, ו לוקאס Karbanowicz לעזרה עם צילומי וידאו.

1. דיסקציה של אפיתל גוט מ ר microplus <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף קרציות חצי מבושל מן הבקר ביום הניסוי. לנתח מתקתק בתוך 24 שעות לאחר הסרת מן המארח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדבוק רצועת סרט דביק לתחתית של צלחת פטרי 92 מ&quot;מ x 16 מ&quot;מ פטרי. הוסף טיפה של דבק סופר לקלטת. מניחים את סמן, בצד הגחון על הדבק סופר, לאפשר יבש במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 100 מ&quot;ל של פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) לתוך צלחת פטרי, או עד הקופסה הוא שקוע לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניצול בגודל 11 אזמל, לחתוך מן החלק העליון של העיניים אל התחתונים התחתונים, משני צידי הקופסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים סטרילית, להסיר לחלוטין את כיח ואת alloscutum , כדי לחשוף את האיברים הפנימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החוט הלבן כמו אברים (קנה הנשימה) ו ממברנות אחרות כדי למנוע זיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המעיים באמצעות מלקחיים, על ידי צובט את האזור העליון ומשוך מפֶּגֶר. הסר את כל רקמות הבטן הנותרים, להבטיח כי לא רקמות אחרות כבר גזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות gut ב קר קרח קר של תמיסת מלח מאוזן (HBSS) ללא סידן כלורי ו מגנזיום גופרתי עם קוקטייל מעכב proteinase (PIC). הצמד להקפיא את האומץ בקרח יבש לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. הערה: כדי לסייע לנתיחה בטן ופרטים של האיברים הפנימיים של תפר עיין בפרק 3.1 של ד &#39;Sonenshine, &quot;ביולוגיה של קרציות&quot; 19 . </li></ol> 2. דיסוציאציה תא אפיתל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את המעיים גזור על מסנן תא 70 מיקרומטר בתוך צינור 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את רקמת הבטן עם 50 מ&quot;ל קר HBSS קר עם PIC עד הפתרון פועל ברור, ואת האומץ לקחת על המראה לבן / ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re- להשעות האומץ ב 30 מ&quot;ל קר HBSS קר עם PIC, מערבבים בעדינות צנטריפוגה ב XG 500 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי גלולה המעיים. הסר את supernatant וחזור על תהליך לשטוף שלוש פעמים. </li><lI&gt; כדי לעקור תאי המעיים אפיתל, מחדש להשעות את המעיים ב 10 מ&quot;ל של תרבית תאים בינוני בינוני Dulbecco שונה הנשר (DMEM), 2% עגל בסרום (FCS), 0.5 mM ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA), 1 מ&quot;מ טריס (2 Carboxyethyl) פוספין (TCEP), PIC ו דגירה של 60 דקות על 37 מעלות צלזיוס תחת סיבוב איטי באמצעות רולר ב 6 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסנן את ההשעיה באמצעות מסננת תא 250 מיקרומטר, מערבולת הזרימה דרך ומסנן דרך מסננת 70 מיקרומטר התא לאסוף את זרימת הנותרים דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה ב XG 500 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי גלולה תאים בודדים. </li></ol> 3. בידוד של תאים אפיתל יחיד באמצעות שיפוע צנטריפוגה שיפוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צפיפות צנטריפוגה שיפוע ( למשל , Percoll) על ידי סינון באמצעות נייר AP15 מראש מסנן. הכן 40% ו Percoll 20% ב mqH 2 0 (V / V) ו מגניב על 4 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות לפני שכבת שיפוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש peristalticהמשאבה להגדיר את המהירות הנמוכה ביותר, שכבת 3 מ&quot;ל של 40% צפיפות צנטריפוגה צנטריפוגה צינור 16 ultracentrifuge, ומאפשר לה להתיישב על קרח במשך 15 דקות. המהירות של המשאבה צריכה להוביל &lt;1 מ&quot;ל לכל שיעור הזרימה המינימלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטיית הצינור ל זווית 45 °, להשתמש המשאבה peristaltic שכבת 20% צפיפות צנטריפוגה שיפוע על גבי השכבה 40%. מהירות המשאבה צריכה להוביל ל &lt;1 מ&quot;ל לכל שיעור הזרימה המינימלית. אפשר השכבות להתיישב על קרח במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש המשאבה peristaltic ב &lt;1 מ&quot;ל לכל שיעור הזרימה המינימלית לשכבה 3 מ&quot;ל של DMEM בינוני המכיל תאים בטן לתקתק מעל 20-40% צפיפות צנטריפוגה שיפוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכנית צנטריפוגה להאצת מקסימלית האטה מינימלית. צנטריפוגה ב XG 600 במשך 10 דקות. איסוף interphases בין DMEM: 20% צפיפות צנטריפוגה שיפוע, ואת 20%: 40% צפיפות צנטריפוגה gradients לבודד תאים בודדים אפיתל. חנות שנאספו interphases ב 4 מעלות צלזיוס עבור ניתוחים הבאים. </li></ol><html> 4. הערכת בידוד התא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המיאצטומטר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקות את שקופית hemacytometer עם אלכוהול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> . Re- להשעות את התאים על ידי pipetting בעדינות את התאים למעלה ולמטה. פיפטה 100 μL ההשעיה התא במקום צינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 400 μL של 0.4% Trypan כחול. בעדינות לערבב על ידי לחיצה על הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 100 μL של ההשעיה תא כחול Trypan מטופלים לאט למלא שני החדרים של hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את hemocytometer תחת מיקרוסקופ אור, תוך התמקדות קווי הרשת של hemocytometer עם מטרה 10X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מונה ידית יד, לספור את התאים חיים ללא כתם בתוך קבוצה של 16 ריבועים. בתוך אותו ריבוע, ספור את התאים הכחולים המתים. המשך לספור עד שייספרו ארבע קבוצות של 16 ריבועים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב התאים הכולל לכל מ&quot;ל באמצעות הנוסחה: 47eq1.jpg &quot;/&gt; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב אחוז הכדאיות התא באמצעות הנוסחה: <img alt="משוואה 2" src="/files/ftp_upload/55747/55747eq2.jpg" /></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא מבודד ויזואליזציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 1 μL של תאים מבודדים μL 9 של HBSS בצינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל. קפיצי microcentrifuge את הצינור בעדינות כדי לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 5 μL של תאים מבודדים ב HBSS באמצע שקופית זכוכית. החל שלוש טיפות של המדיום גובר עם 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את השקופית בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. בזהירות במקום להחליק להחליק על ההכנה, הימנעות בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו תאים מוכתמים DAPI ב עירור 360 ננומטר פליטה ב 460 ננומטר תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li></ol></li></ol> 5. Cell Cell חלבון Biotinylation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Biotinylate 100 μL של תאים תא אפיתל יחיד באמצעות Biotin (סוג A) הצמידהKit, על יחס טוחנת של 1: 1 חלבון פני השטח כדי מצומד, בהתאם להוראות היצרן </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור תמוגה התא, להוסיף 100 μL של PBS, 1% Triton X-100, גליצרול 10%, 100 מיקרומטר גלוטתיון חמצון PIC לתאים biotinylated. דגירה על קרח במשך 1 שעות עם ערבוב עדין כל 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאים biotinylated ב XG 20,000 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי גלולה חומר מסיס. איסוף supernatant המכיל cytoplasmic, חלבונים הממברנה biotinylated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את ריכוז החלבון באמצעות assay Bradford. </li></ol> 6. בידוד של חלבונים פנימיים Biotinylated <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μL של חרוזים מגנטיים Streptavidin לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור לתוך מעמד מגנטי, איסוף חרוזים כנגד הצד של הצינור. הסר וזורקים את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1000 μL של TBS, 0.1% Tween-20 לצינור. מערבבים בעדינות ולאסוף את החרוזים עם סטן מגנטיד. הסר וזורקים את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב 40 מיקרוגרם של חלבונים משטח התא biotinylated, מדולל μL 300 ב 1x PBS עם חרוזים מגנטיים שטף. לדגור על 2 שעות בטמפרטורת החדר עם תסיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את החרוזים עם מעמד מגנטי, להסיר ולזנוח supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 300 μL של TBS, 0.1% Tween-20 לצינור, בעדינות ערבוב כדי להשעות מחדש את החרוזים. איסוף חרוזים, להסיר ולזנוח supernatant. חזור על צעד זה לשטוף פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μL של 0.1 M גליצין pH 2.0 חרוזים מגנטיים, ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. איסוף חרוזים ולהסיר supernatant המכיל eluted biotinylated חלבונים פני השטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו חלבונים משטח מבודד על ג&#39;ל 4-20% Tris-MOPS SDS-PAGE. </li></ol> 7. הערכה של חלבונים פנימיים Biotinylated <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקודה כתם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים 7 ס&quot;מ x 3 ס&quot;מ רצועה של קרום nitrocellulose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 10 מיקרוגרם סך הכל סמןתוכן (מ 1.8 לעיל), ו 10 מיקרוגרם של חלבון פני השטח biotinylated על הממברנה. אפשר ייבוש במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה למכל ו לצלול ב 100 מ&quot;ל של חיץ חסימה. דגירה בטמפרטורת החדר עם תסיסה במשך שעה. מחק חסימת חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף nitrocellulose קרום μL 100 μL, 0.05% Tween-20 במשך 5 דקות עם תסיסה. בטל לשטוף חיץ לחזור על שוטף שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ב 1/5000 Streptavidin חזרת peroxidase (HRP) ב 100 μL PBS, 0.05% Tween-20 עבור 2 שעות עם תסיסה בטמפרטורת החדר, ולבטל כל פתרון שנותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף nitrocellulose קרום μL 100 של PBS, 0.05% Tween-20 במשך 5 דקות עם תסיסה. מחק חיץ לשטוף וחזור לשטוף שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזיהוי, להמיס 1 טבליה של 4-chloro-1-napthol ב 10 מ&quot;ל של מתנול קר כקרח. הוסף 4 מ&quot;ל של מלאי מתנול ל 20 מ&quot;ל של כפות. הוסף 10 μL של מי חמצן טריים 30% ו immediaTely להחיל על קרום nitrocellulose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם תסיסה בטמפרטורת החדר עד המצע מייצר מוצר סוף כחול מסיס. פעולה זו עשויה להימשך בין 2-15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק פתרון איתור לשטוף את הממברנה שלוש פעמים μl 100 μL 2 O. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסאי ELISA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 200 ng של כל מדגם עם 400 μL של 100 מ&quot;מ חיץ ציפוי קרבונט מעיל 2 נתיבים של השורה הראשונה (A #) של צלחת אליסה (בארות תחתית שטוחה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μL של חיץ ציפוי 100 מ&quot;מ קרבונט לכל בארות המתאימים אחרים בשורות (BH). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת דילולים סדרתי של כל מדגם על ידי pipetting 100 μL מכל טוב בשורה A, והעברת לתוך שורה ב לערבב בעדינות על ידי pipetting ולהימנע בייצור בועות. חזור על דילולים למטה כל שורה, להשליך את 100 μL הסופי מכל טוב בשורה H. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את הצלחת עם parafilm ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את platדואר עם 200 μL PBS, 0.05% Tween-20 לכל טוב שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μL של חיץ חסימת על בארות מצופה, לכסות עם Parafilm ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 1 / 15,000 Streptavidin-HRP לחסום חיץ ולהוסיף 100 μL היטב כל צלחת. כיסוי עם parafilm ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הצלחת 200 μL PBS, 0.05% Tween-20 לכל טוב חמש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לזהות, להוסיף 100 μL של מגיב TMB לכל טוב. לאחר פיתוח צבע מספיק, בדרך כלל בין 10-15 דקות, להוסיף 100 μL של 1 M חומצה זרחתית לעצור את התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרא את ספיגת כל טוב ב λ = 450nm. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Rodriguez-Valle, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+Rhipicephalus+%28Boophilus%29+microplus+Bm86+against+Hyalomma+dromedarii+and+Amblyomma+cajennense+tick+infestations+in+camels+and+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Efficacy of Rhipicephalus (Boophilus) microplus Bm86 against Hyalomma dromedarii and Amblyomma cajennense tick infestations in camels and cattle.</a> Vaccine. 30, 3453-3458 (2012).</li>
<li>De Rose, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bm86+antigen+induces+a+protective+immune-response+against+Boophilus+microplus+following+DNA+and+protein+vaccination+in+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Immunol.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Bm86 antigen induces a protective immune-response against Boophilus microplus following DNA and protein vaccination in sheep.</a> Vet. Immunol. Immunopathol. 71, 151-160 (1999).</li>
<li>García-García, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+variations+in+the+Boophilus+microplus+Bm86+locus+and+implications+for+immunoprotection+in+cattle+vaccinated+with+this+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Appl.+Acarol%22%5BJournal%5D)">Sequence variations in the Boophilus microplus Bm86 locus and implications for immunoprotection in cattle vaccinated with this antigen.</a> Exp. Appl. Acarol. 23, 883-895 (1999).</li>
<li>Abbas, R. Z., Zaman, M. A., Colwell, D. D., Gilleard, J., Iqbal, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acaricide+resistance+in+cattle+ticks+and+approaches+to+its+management%3A+The+state+of+play%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Acaricide resistance in cattle ticks and approaches to its management: The state of play.</a> Vet. Parasitol. 203, 6-20 (2014).</li>
<li>Kearney, S. <a target="_blank" href="https://dpir.nt.gov.au/__data/assets/pdf_file/0007/233269/845.pdf">Acaricide (chemical) resistance in cattle ticks</a>. , AgNote No. K58. (2013).</li>
<li>Foil, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+that+influence+the+prevalence+of+acaricide+resistance+and+tick-borne+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Factors that influence the prevalence of acaricide resistance and tick-borne diseases.</a> Vet. Parasitol. 125, 163-181 (2004).</li>
<li>Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+level+expression+of+the+B.+microplus+Bm86+antigen+in+the+yeast+Pichia+pastoris+forming+highly+immunogenic+particles+for+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High level expression of the B. microplus Bm86 antigen in the yeast Pichia pastoris forming highly immunogenic particles for cattle.</a> J Biotechnol. 33, 135-146 (1994).</li>
<li>Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+vaccination+with+a+recombinant+Bm86+antigen+preparation+on+natural+infestations+of+Boophilus+microplus+in+grazing+dairy+and+beef+pure+and+cross-bred+cattle+in+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Effect of vaccination with a recombinant Bm86 antigen preparation on natural infestations of Boophilus microplus in grazing dairy and beef pure and cross-bred cattle in Brazil.</a> Vaccine. 13 (18), 1804-1808 (1995).</li>
<li>Lew-Tabor, A. E., Rodriguez Valle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+reverse+vaccinology+approaches+for+the+development+of+vaccines+against+ticks+and+tick+borne+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Ticks+Tick+Borne+Dis%22%5BJournal%5D)">A review of reverse vaccinology approaches for the development of vaccines against ticks and tick borne diseases.</a> Ticks Tick Borne Dis. 7, 573-585 (2016).</li>
<li>Capella, A. N., Terra, W. R., Ribeiro, A. F., Ferreira, C. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0965174897000611">Cytoskeleton removal and characterization of the microvillar membranes isolated from two midgut regions of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera).</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 793-801 (1997).</li>
<li>Cioffi, M., Wolfersberger, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+separate+apical%2C+lateral+and+basal+plasma+membrane+from+cells+of+an+insect+epithelium.+A+procedure+based+on+tissue+organization+and+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">Isolation of separate apical, lateral and basal plasma membrane from cells of an insect epithelium. A procedure based on tissue organization and ultrastructure.</a> Tissue Cell. 15, 781-803 (1983).</li>
<li>Koefoed, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+mechanical+method+to+isolate+the+basal+lamina+of+insect+midgut+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">A simple mechanical method to isolate the basal lamina of insect midgut epithelial cells.</a> Tissue Cell. 17, 763-768 (1985).</li>
<li>Roche, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+purified+epithelial+cell+population+from+human+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation of a purified epithelial cell population from human colon.</a> Methods Mol. Med. 50, 15-20 (2001).</li>
<li>Terra, W. R., Costa, R. H., Ferreira, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membranes+from+insect+midgut+cells%5BTitle%5D)+AND+%22An.+Acad.+Bras.+Ci%C3%AAnc%22%5BJournal%5D)">Plasma membranes from insect midgut cells.</a> An. Acad. Bras. Ciênc. 78, 255-269 (2006).</li>
<li>Vargas, A. E., Markoski, M. M., Cañedo, A. D., Helena, F., Nardi, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+isolation+and+culture+of+intestinal+epithelial+stem+cells+from+murine+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Identification, isolation and culture of intestinal epithelial stem cells from murine intestine.</a> Stem Cells. 879, 479-490 (2012).</li>
<li>Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+enzymatic+tissue+disintegration+on+the+level+of+surface+molecule+expression+and+immune+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function.</a> Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).</li>
<li>Karhemo, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+isolation+of+biotinylated+cell+surface+proteins+reveals+novel+players+in+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">An optimized isolation of biotinylated cell surface proteins reveals novel players in cancer metastasis.</a> J. Proteomics. 77, 87-100 (2012).</li>
<li>Obenchain, F. R., Galun, R. Physiology of Ticks. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aObenchain%2C+FR+%22Current+Themes+in+Tropical+Science+Volume+1%22">Current Themes in Tropical Science Volume 1</a>. , Pergamon Press. 201-205 (1982).</li>
<li>Sonenshine, D., Roe, R. Chapter 3.1. <a target="_blank" href="https://books.google.com/books?id=ucg4AAAAQBAJ&source=gbs_book_similarbooks">&#34;Biology of Ticks&#34</a>. 1, Two, Oxford University Press. (2014).</li>
<li>Raikhel, A. S., Balashov, Y. S. <a target="_blank" href="http://search.library.utoronto.ca/details?296351&uuid=a608221a-1254-44a3-8e22-b81b799145f5">&#34;An Atlas of Ixodid Tick Ultrastructure&#34 (English Translation)</a>. , Entomology Society of America Entomological Society of America. (1983).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

התפשטות בקר קרים מהווים בעיה רצינית עבור תעשיית הבקר באזורים טרופיים וסובטרופיים של העולם, עם השיטה הנפוצה ביותר של שליטה להסתמך על שימוש אקריצידים 1 , 4 . Bm86 זוהה בעבר בתוך השטח האפיתל במעיים לתקתק כמו אנטיגן המגן נגד ר microplus שריצה 10, עם הצלחה מוגבלת כאסטרטגיה חיסון עקב וריאציה רצף גיאוגרפי Bm86 ואת הדרישה קבוע לחיזוק 4. <p class="jove_content" style=";te...

Rhipicephalus microplus , סמן בקר, הוא ectoparasite משמעותי ביותר במונחים של השפעה כלכלית על תעשיית הבקר של אזורים טרופיים תת טרופיים כפי שהוא נוקט קדחת הבקר קדחת (babesiosis), anaplasmosis ו piroplasmosis סוס 1 , 2 , 3 , 4 . המאמצים הוקדשו לבקרת סמן בקר, כדי להפחית את ההשפעה המזיקה, אולם לשיטות קונבנציונליות כגון שימוש בחומרי אקריצידים כימיים יש חסרונות משתמעים, כגון נוכחות של שאריות כימיות בחלב ובבשר, ועלייה בשכיחות של קרציות עמידות כימית 5 , 6 , 7 . כתוצאה מכך, פיתוח שיטות חלופיות של בקרת טיקים נחקרו, כגון שימוש בבקר התנגדות טבעי, בקרה ביולוגית (biopesticides) וחיסוןInes 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . במרדף אחר חלבונים המסוגלים לשמש מועמדים לחיסונים, המחקר הנוכחי מתמקד במעי הגס. קיר midgut בנוי משכבה אחת של תאים אפיתל מנוחה על לאמידה בסיסית דקה, עם החיצוני של הלמידה הבסיסית להרכיב רשת של שרירים. אור ותצפיות מיקרוסקופ אלקטרונים מציינות כי midgut מורכב משלושה סוגים של תאים: מילואים (לא מובחנים), הפרשה, ומערכת העיכול. מספר סוגי התאים משתנה במידה ניכרת בהתאם לשלב הפיזיולוגי. תאי הפרשה ותאי העיכול מקורם בתאי מילואים 18 , 19 , 20 . בניית ספריות cDNAכדי לבחון את ההרכב של המעיים סמן גרמה לזיהוי של חלבונים אנטיגניים, כגון Bm86, כמו מועמדים חיסונים פוטנציאליים 2 , 3 , 4 . Glycoprotein Bm86 הוא מקומי על פני השטח של תאים מעיים לתקתק וגורם תגובה חיסונית מגן נגד סמן בקר ( ר microplus ) בבקר מחוסן. Anti-Bm86 IgGs המיוצר על ידי המארח החוסן הם ingested על ידי סמן, לזהות אנטיגן זה על פני השטח של תאים מעיים לתקתק, ולאחר מכן להפריע לתפקוד רקמות המעיים ואת היושרה. חיסונים המבוססים על אנטיגנים Bm86 הראו שליטה אפקטיבית של ר &#39; microplus ו Rhipicephalus annulatus, על ידי הקטנת מספר, משקל ויכולת הרבייה של נקבות נקבות, וכתוצאה מכך הפחתת הזחל מופחת בדורות דלקת הבאים 4 . עם זאת, חיסונים המבוססים על Bm86 אינם יעילים כנגד כל שלבי הסימוןהוכיחו יעילות משביעת רצון נגד כמה זנים גיאוגרפיים של ר &#39;microplus , וכתוצאה מכך את בשר בקר תעשיות חלב אימצו כראוי חיסונים אלה 2 , 4 . היכולת לבודד תאים אפיתל מן המעיים סמן הוא חידוש משמעותי אשר יאפשר את התקדמות המחקר כדי לקבוע הרכב חלבון חלבון כולל מורפולוגיה ופיזיולוגיה בתנאים סביבתיים שונים. השיטה המתוארת כאן מנצל את הסוכן chelating ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) ואת הסוכן הפחתת tris (2-carboxyethyl) פוספין (TCEP) לשחרר את האפיתל מן הרקמות תמיכה תת אפיתל שלה 10 . אפיתל הוא התאושש בעקבות שיבוש מכני של הרקמות על ידי רועד, ואחריו צנטריפוגה שיפוע רציפה Percoll. מאמר זה מתאר טכניקה ריאלי ו אפשרי לבידוד של מעי גס epiהתאים. חלבונים משטח התא biotinylated, מבודדים מפני השטח של תאים אלה אפיתל ניתח לאחר מכן ביישומים במורד הזרם כגון FACS ו / או LC-MS / MS- ניתוח.

<table><tbody><tr><td>0.4% Trypan Blue</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>3322</td><td></td></tr><tr><td>100mM Carbonate Buffer</td><td></td><td></td><td>3.03 גרם Na2CO3, 6.0 גרם NaHCO3 1000 מ"ל מים מזוקקים pH 9.6</td></tr><tr><td>16 מ"ל צינורות צנטריפוגה עם מכסה איטום</td><td>Thermo Scientific</td><td>3138-0016</td><td>מצננים בקרח לפני שיפוע</td></tr><tr><td>250 ומיקרו; מסננת תאים M</td><td>Thermo Fisher</td><td>87791</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;,5,5&prime;-Tetramethylbenzidine (TMB) מערכת מצע נוזלי עבור ELISA</td><td>Sigma</td><td>T0440</td><td>מאוחסן ב-4C</td></tr><tr><td>30% מי חמצן</td><td>Labscene</td><td>BSPA5.500</td><td></td></tr><tr><td>4-20% Tris-MOPS ג'ל</td><td>Gen Script</td><td>M42015</td><td></td></tr><tr><td>4-כלורו-1-נפתול טבליה</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6788</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור פלקון</td><td>כחול קורנינג</td><td></td><td>30 x 115 מ"מ סטייל. צינור חרוטי פוליפרופליין.</td></tr><tr><td>70 ומיקרו; מסננת תאים M</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>AP15 נייר סינון</td><td>Millipore</td><td>AO1504200</td><td></td></tr><tr><td>ביוטין (סוג A) ערכת צימוד</td><td>Abcam</td><td>Ab102865</td><td></td></tr><tr><td>דיסקציה מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>DP Manager&nbsp;</td><td>אולימפוס</td><td>2.2.1.195</td><td>תוכנת הדמיה סלולרית</td></tr><tr><td>סרט דביק</td><td>הנדימן</td><td></td> ביתי <td>48 מ"מ x 25 מ"מ סרט דביק</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>DMEM - קר כקרח לפרוטוקול</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Amresco</td><td>0105-500G</td><td></td></tr><tr><td>F96 Maxisorp Immuno Plate</td><td>Nunc</td><td>439454</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12003C</td><td></td></tr><tr><td>FCS מיקרוסקופ פלואורסצנטי&nbsp;</td><td>&nbsp; אולימפוס&nbsp;</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield עם DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6057-20ML</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>Dumont</td><td></td> <td>#9 Dumont - Switerzland</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>גליצרול לביולוגיה מולקולרית >99%</td></tr> <tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>410225</td><td></td></tr><tr><td>כף יד</td><td>דלפק עבודות משרדיות</td><td>JA0376230</td><td></td></tr><tr><td>האנק' s תמיסת מלח מאוזנת</td><td>סיגמא מדעי החיים</td><td>H9394</td><td>HBSS &ndash; קר כקרח לפרוטוקול</td></tr><tr><td>המציטומטר</td><td>אופטיק לקור</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>L-גלוטתיון מחומצן</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G4376</td><td></td></tr><tr><td>מעמד הפרדה מגנטית</td><td>novagen-4</td><td></td> <td>צינורות מתלה הפרדה מגנטית</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>179337</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q Water</td><td>Millipore</td><td>ZRXQ003WW</td><td>מערכת טיהור מים אינטגרלית למים טהורים במיוחד</td></tr><tr><td>ניטרוצלולוזה ממברנה</td> מדעי <td>החיים</td><td>66485</td><td>30 ס"מ x 3M ממברנת ניטרוצלולוזה טהורה</td></tr><tr><td>PageRuler סולם חלבון צבוע מראש</td><td>Thermo-Fisher</td><td>SM0671</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>1.16 גרם Na2HPO4, 0.1 גרם KCl, 0.1 גרם K3PO4, 4.0 גרם NaCl (500 מ"ל מים מזוקקים) pH 7.4</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1644-500ML</td><td></td></tr><tr><td>משאבה פריסטלטית</td><td>Masterflex</td><td>7518-10</td><td></td></tr><tr><td>חומצה זרחתית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6560</td><td></td></tr><tr><td>פירס ללא חלבון T20 PBS חוסם מאגר</td><td>Thermo-Scientific</td><td>37573</td><td>מאוחסן ב-4C. חסימת</td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז</td><td>מאגר סיגמא-אולדריץ'</td><td>P8215-5ML</td><td>PIC &ndash; מאוחסן בטמפרטורה של -20 &deg; C</td></tr><tr><td>התחלה מהירה מגיב צבע ברדפורד 1x</td><td>Biorad</td><td>500-0205</td><td>לבדיקת ברדפורד</td></tr><tr><td>התחלה מהירה תקני BSA</td><td>Biorad</td><td>500-0207</td><td>תקני BSA למעבדת אזמל ברדפורד</td></tr><tr><td></td><td>. גודל משותף</td><td></td><td>11 ערכת צביעה של אזמל</td></tr><tr><td>SilverQuest TM</td><td>Invitrogen</td><td>LC6070</td><td></td></tr><tr><td>Simply Blue TM כתם בטוח&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall C6+ Ultracentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin (HRP)</td> <td>Abcam</td><td>AB7403</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin חרוזים מגנטיים</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>S1420S</td><td></td></tr><tr><td>סופר גלו - סופר דבק מיני UHU</td><td></td><td></td><td>UHU סופר מהיר במיוחד 1 מ"ג.</td></tr><tr><td>צנטריפוגה מיני</td> מהירה במיוחד <td>Eppendorf</td><td>22331</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Thermo Fisher</td><td>20490</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Biorad</td><td>161-0407</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P2287-500ML</td><td></td></tr><tr><td>מערבל מערבולת</td><td>Ratek</td><td>VM1</td><td></td></tr><tr><td>מענק</td><td>אמבט מים</td><td>GD100</td><td></td></tr></tbody></table>

טיהור של biotinylated cell חלבונים משטח מ<em&gt; rhipicephalus microplus</em&gt; תאים אפיתל גוט

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Rhipicephalus microplus - תווית בקר - הוא ectoparasite משמעותי ביותר במונחים של השפעה כלכלית על בעלי חיים כמו וקטור של מספר פתוגנים. המאמצים הוקדשו לשלוט בקר בקר כדי להפחית את ההשפעות המזיקות שלה, עם דגש על גילוי של מועמדים חיסון, כגון BM86, הממוקם על פני השטח של תאים מעיים לתאי אפיתל. המחקר הנוכחי מתמקד בשימוש של cDNA וגנום ספריות, כדי המסך עבור מועמדים חיסון אחרים. הבידוד של תאים מעיים לתקתק מהווה יתרון חשוב בחקירת הרכב של חלבונים פני השטח על קרום תאים בטן קרום. מאמר זה מהווה שיטה חדשנית וראוי לבידוד של תאי אפיתל, מן התוכן מעיים לתקתק של מיקרופלוס חצי רתומה למחצה . פרוטוקול זה מנצל TCEP ו EDTA לשחרר את התאים אפיתל מן הרקמות תמיכה subepithelial ו צפיפות רציפה צנטריפוגה gradieNt לתאי אפיתל נפרדים מסוגי תאים אחרים. חלבונים משטח התא היו biotinylated ומבודדים מן התאים בטן אפיתל בטן, באמצעות חרוזים מגנטיים streptavidin מקושר המאפשר עבור יישומים במורד FACS או LC-MS / MS- ניתוח.

תאים אפיתל היו מבודדים מרקמות המעיים של ר microplus לפי סכימה הציג באיור 1 . נציג מיקרוסקופ פלואורסצנטי הקרינה של תאים מעיים לתאי אפיתל מוכן באמצעות פרוטוקול זה מוצגים בתרשים 2A ו 2 ב. כמו בידוד התא מתבצע על רבעי מחורץ מיקרופלוס חצי , תאים מופיעים כמו יחיד, כדורית, משטח מורפולוגיה ...

צפיפות שונה צנטריפוגה מבוססי מתודולוגיה שיפוע מבוסס נוצל לבודד תאים אפיתל מ רקמה Rhipicephalus רקמת microplus . משטח חלבונים הקשורים היו biotinylated ו מטוהרים באמצעות חרוזים מגנטיים streptavidin עבור יישומים במורד הזרם.

טיהור של biotinylated Cell חלבונים משטח מ<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; תאים אפיתל גוט

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

טיהור של חלבון קשיר-ביוטין מפני השטח של תאי אפיתל של מעי Rhipicephalus microplus. במסגרת מחקר זה, נעשה שימוש במתודולוגיה מותאמת המבוססת על מדרג Percoll כדי לבודד תאי אפיתל בודדים מרקמת מעי של Rhipicephalus microplus. חלבונים הקשורים לפני השטח עברו ביוטינולציה וטוהרו באמצעות חרוזי מגנט של סטראפטאבידין לצורך שימוש ביישומים המשכיים.ניתוח של אפיתל המעי מקרצי *Rhipicephalus microplus* במצב של שבעון חלקי. תזדקקו לחומרים הבאים. הדביקו רצועת דבק דביק (duct tape) לתחתית של צלחת פטרי.הוסף טיפה של Super Glue לסרט ההדבקה. הנח את הקרציה כאשר הצד הבטני פונה כלפי מטה על ה-Super Glue, והמתן לייבוש. טבול את הקרציה באופן מלא ב-100 mL של PBS.באמצעות סכין מנתחים בגודל 11, חתכו מהחלק העליון של העיניים ועד לפסטונים (festoons) התחתונים בשני צדי הקרציה. בעזרת פינצטה סטרילית, הסירו לחלוטין את הסקוטום (scutum) ואת האלוסקוטום (alloscutum) כדי לחשוף את האיברים הפנימיים. הסירו את האיברים הדקים הדמויים לחוטים לבנים וממברנות אחרות.הסר את המעי באמצעות פינצטה. אחסן את המעי ב-HBSS ו-PIC קרים בקרח. דיסוציאציה של תאי אפיתל.יהיו דרושים לכם החומרים הבאים. שפכו את המעי המנו dissect לתוך מסנן תאים של 70 מיקרון בתוך מבחנה מסוג Falcon של 50 mL. מכיוון שעלול להיווצר ואקום בתוך מבחנת ה-Falcon, הרימו את המסנן כדי לאפשר סירקולציית אוויר.שטפו את רקמת המעי עם 50 mL של HBSS קר בקרח עם PIC. השעיקו מחדש את המעיים ב-30 mL של HBSS קר בקרח עם PIC. במידת הצורך, השתמשו במגרד סטרילי כדי לסייע בשעיקה מחדש של המעיים.סבבו בצנטריפוגה ב-500 g. הסירו את הנוזל העליון וחזרו על תהליך השטיפה שלוש פעמים. השעיקו מחדש את תאי המעי ב-10 mL של DMEM, 2%FCS, 5 millimolar EDTA, one millimolar TCEP ו-PIC.ערבבו בעדינות. דגרו למשך 60 דקות בטמפרטורה של 37 °C תחת סיבוב איטי באמצעות גלגל סיבוב (roller). סננו את התרחף דרך מסנן תאים של 250 micron.ערבבו את הנוזל שסינונו (flow through) באמצעות וורטקס. סננו דרך מסננת תאים של 70 מיקרון, ואספו את הנוזל שסינונו שנותר. צנטריפוגו את התרחיף.בידוד תאי אפיתל בודדים באמצעות מדרג Percoll. תצטרכו את החומרים הבאים. הכינו Percoll בריכוזים של 40% ו-20% במים מזוקקים מסוג Milli-Q, באמצעות סינון דרך נייר סינון מקדים מסוג AP15.מלאו מזרק סטרילי בתמיסת Percoll. החילו אותו על מתקן הסינון ושחררו את ה-Percoll באיטיות. קררו בטמפרטורה של 4 °C למשך שעה לפני יצירת שכבות הגרדיאנט.הגדירו את משאבת הפריסטאלטיקה כפי שמוצג. באמצעות משאבה פריסטאלטית המכוונת למהירות הנמוכה ביותר, שכבדו 3 mL של 40% Percoll לתוך מבחנה לאולטרסנטריפוגה בנפח 16 mL. השאירו את התמיסה להתייצב על קרח למשך 15 דקות.מהירות המשאבה צריכה להוביל לקצב זרימה של פחות מ-1 mL לדקה. לאחר הטיית המבחנה בזווית של 45 מעלות, השתמשו במשאבה הפריסטלטית כדי לשכבד את ה-20% Percoll מעל השכבה של 40%. ודאו שצינור הפלט נשען על מבחנת הצנטריפוגה כדי למנוע טיפות מה להתערבב עם השכבות התחתונות.מהירות המשאבה צריכה להוביל לקצב זרימה של פחות מ-1 mL לדקה. יש להניח לשכבות לשקוע על קרח למשך 15 דקות. השתמש במשאבה הפריסטלטית בקצב זרימה של פחות מ-1 mL לדקה כדי להוסיף כשכבה 3 mL של תמיסת DMEM המכילה את התאים האפיתליאליים המבודדים מעל למדרג ה-Percoll של 20 עד 40%.ודאו ששפופרת הפלט נשענת על שפופרת הצנטריפוגה כדי למנוע מערבוב של טיפות עם השכבות התחתונות, דבר שיפריע למדרג. סבבו בצנטריפוגה ב-600 g למשך 10 דקות. אספו את הממשקים (interphases) שבין ה-DMEM, מדרג ה-20%Percoll ומדרגי ה-20%40%Percoll כדי לבודד תאי אפיתל בודדים.ביוטינילציה של חלבוני פני השטח של התא ובידוד של חלבוני פני שטח שביוטינילו. תזדקקו לחומרים הבאים. בצעו ביוטינילציה ל-100 µL של תאי אפיתל בודדים באמצעות Biotin Type A Conjugation Kit לפי הוראות היצרן.הוסף 100 µL של PBS, 1% Triton X-100, 10% glycerol, 100 µM oxidized glutathione ו-PIC לתאים הביוטיניליים. הדגר על קרח למשך שעה עם ערבוב עדין כל 10 דקות. סבב במרכזית (centrifuge) את תמצית התאים ב-20,000 g בטמפרטורה של 4 °C למשך 20 דקות ושמור בצד.הכינו 50 µL של חרוזי סטרפטאווידין מגנטיים על ידי שטיפה עם 1,000 µL של TBS 1%Tween-20. ערבבו בעדינות באמצעות נקישה קלה של האצבע. הניחו את המבחנה במעמד מגנטי, כדי לרכז את החרוזים לצד המבחנה.הסר והשלך את הנוזל העליון (supernatant). ערבב 300 µL של חלבוני פני שטח של תאים בביוטיניציה עם חרוזי מגנט שטופים. דגרי במשך שעתיים בטמפרטורת החדר תוך כדי ערבוב.אספו את החרוצים באמצעות המעמד המגנטי, הסירו והשליכו את הנוזל העליון (supernatant). הוסיפו למבחנה 300 microliters של TBS 1%Tween-20, תוך ערבוב עדין כדי לתלה מחדש את החרוצים. אספו את החרוצים, הסירו והשליכו את הנוזל העליון.חזור על שלב שטיפה זה פעמיים. הוסף 100 µL של glycine 1 M ב-pH 2 אל החרו지를 המגנטיים, והדגר בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.אספו את החרוזים והסירו את העילוי המכיל חלבוני פנים מבוטילציה שנסרחו. איור one הוא ייצוג של הפרוטוקול שבו נעשה שימוש כדי לבודד תאי אפיתל ואת חלבוני הפנים שלהם מקרצייה שלמה. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לטהר כ-1.2 * 10⁷ תאים ל-mL עם חיוניות של 75% עד 80%, ו-20 עד 24 µg של חלבוני פנים מבוטילציה מטהרים מניסוח ראשוני של 50 קרציות.דוגמאות של דימויי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של תאי אפיתל מקרש קרצים שהוכנו באמצעות פרוטוקול זה מוצגות באיור 2A ו-2B. התאים נראים כמורפולוגיה של משטחים חלקים, כדוריים ובודדים, ובעלי גודל עקבי לאורך כל הדגימה. בידודים דלים נראים ככאלה המכילים דיסוציאציה חלקית של תאי אפיתל בודדים, עם אוכלוסיות תאים משתנות שזוהו באמצעות גדלי תאים ומורפולוגיות משתנות.ניתן לצמצם זיהום צולב מחלבוני המאכס, איור 3A, על ידי שטיפה מספקת של מעי הקרציות כדי להפיק גרדיאנט Percoll לבן או שקוף, איור 3B. השוואת חלבונים באמצעות SDS-PAGE, איור 4A, צביעת כסף, איור 4B, dot blot, איור 5, ו-ELISA, איור 6, מעידה כי המתודולוגיות המתוארות טיהרו בהצלחה חלבונים פנישאיים ביוטיניליים מתאי אפיתל בודדים שבודדו ממעי קרציות מסוג Rhipicephalus microplus. לסיכום, השיטות שנעשה בהן שימוש במחקר זה בידלו בהצלחה תאי אפיתל בודדים מכלל המעי של Rhipicephalus microplus.חלבונים מפני השטח של תאי אפיתל של Rhipicephalus microplus הופקו לצורך ניתוחים ומחקרים נוספים. לסיכום, הפרוטוקול שפותח הדגים את תנובת הפוטנציאלית של תאי אפיתל בודדים ממעי הקרציה ואת היעילות של חלבון פני שטח ביוטינילי של התא. ניתן להשתמש בפרוטוקול שפותח בכל מין של קרציה בעל חשיבות כלכלית, במטרה לחקור אינטראקציות בין קרציות למארח באמצעות בחינת הרכב חלבוני הממברנה של המעי.

purification-biotinylated-cell-surface-proteins-from-rhipicephalus

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

אנדוציטוזה מוסדרים מסדיר את שטח פני התא רמות הביטוי של רוב חלבונים בממברנה. כאן אנו מנצלים פריק, impermeant קרום biotinylation ריאגנטים למדוד את קצב endocytic של טרנספורטר דופאמין (DAT), חלבון הממברנה polytopic. השיטה מאפשרת גישה פשוטה למדידת קצב endocytic של רוב החלבונים פלזמה הממברנה.

מדידת חלבון ממברנה פלזמה חליפין Endocytic ידי Biotinylation הפיך

סרטון זה מדגים שיטה להערכת הפנמת חלבון המטרה באסטרוציטים בקליפת המוח של עכברים באמצעות ביוטינילציה, ואחריה ליזה של תאים, מיצוי חלבון מבוסס סטרפטווידין, דנטורציה וניתוח כתמים מערביים כדי לאשר הפנמה מוצלחת.

הערכת הפנמה של חלבוני פני השטח של המטרה באמצעות נגזרת ביוטין

סחר בממברנה כרוך בהובלה של חלבונים מקרום הפלזמה לפנים התא (כלומר אנדוציטוזיס) ואחריו סחר לליזוזומים לפירוק או לקרום הפלזמה למיחזור. השיטות המתוארות במאמר זה נועדו לחקור אנדוציטוזיס ומיחזור של חלבוני ממברנת פלזמה.

מבחני הגנת L-גלוטתיון מבוססי תאים לחקר אנדוציטוזיס ומיחזור של חלבוני ממברנת פלזמה

שיטה מתוארת לניקוי יעיל של חלבוני תאום סטרפטוקוקוס מתויג היתוך והמתחמים הספציפיים שלהם על streptavidin הותאם שרף (סטרפטוקוקוס-Tactin) קוולנטית צולבים עם Bis suberate (sulfosuccinimidyl) (BS3). יש שיטת היתרונות של מהירות מהירה, התאוששות חלבון מטרה טובה וטוהר גבוהים, והוא תואם את ניתוח שלאחר מכן על ידי ספקטרומטריית מסה.

טיהור צעד אחד של חלבונים מתויגים-Twin-סטרפטוקוקוס והמתחמים שלהם בSuberate (BS3) שרף סטרפטוקוקוס-Tactin הצולב עם Bis (sulfosuccinimidyl)

אנו מספקים שיטה לסינון בו-זמנית של ספרייה של שברי נוגדנים לזיקה קשירה ומסיסות ציטופלזמית על ידי שימוש במסלול הטרנסלוקציה של Escherichia coli Twin-arginine, שיש לו מנגנון בקרת איכות מובנה לקיפול חלבון תוך תאי, כדי להציג את שברי הנוגדנים על הממברנה הפנימית.

Inner-קרום חיידקי תצוגה להקרנת ספרייה של שברי נוגדן

שתי שיטות biotinylation מבוססות, שנועדו לקביעת ביטוי פני התא ואת שיעור endocytic של חלבונים לידי ביטוי בקרום פלזמה, מוצגים בדוח זה.

קביעת הביטוי משטח תאים ושיעור אנדוציטי של חלבונים בתרבויות אסטרוציטיות ראשוניות באמצעות Biotinylation

כאן אנו מציגים פרוטוקול קליפ-seq שונה בשם FBIoקליפ-seq עם טיהור דגל-ביוטין טנדם כדי לקבוע את מטרות RNA של חלבונים מחייבים RNA (RBPs) בתאים יונקים.

פרופיל תמלול רחב של אינטראקציות חלבון-RNA על ידי קישור צולב וחיסונים בתיווך על ידי טיהור דגל-ביוטין טנדם

כתב יד זה מתאר גישה מבוססת הגנום בקנה מידה מבוססי לזהות קולטן מסחטות-ליגניות ואינטראקציות.

זיהוי של פני שטח התא באמצעות הגנום בקנה מידה CRISPR/Cas9 מסכים גנטיים

ALIBi (ALIBi) היא שיטה חדשה שמופעלת אופטוגנטית שפותחה לתיוג וטיהור אוכלוסיות תת-תאיות של ריבוזומים לצורך ריצוף וניתוח פרוטאומי במורד הזרם וניתוח פרוטאומי.

בידוד תת-אוכלוסיות ריבוזום תת-תאיות בהתבסס על ביוטינילציה מוגברת במיקום ספציפי לתג פפטיד רקומביננטי - תאורה מוגבלת -

הפרוטוקול מציג שיטה להצמדה קוולנטית in vivo של ביוטין לחלבונים על סמך קרבתם לביוטין ליגאז המותך לחלבון מעניין. שינוי זה מאפשר העשרה סלקטיבית של החלבונים באמצעות חרוזי סטרפטווידין לפי הצורך במחקרי אינטראקציה עם חלבונים.

ב Vivo ביוטינילציה של קרבה למחקרי אינטראקציה בין חלבונים ב-Paramecium tetraurelia

חקור שיטה לבידוד תאים אפיתליים מרקמת מעי של Rhipicephalus microplus באמצעות מדרגת Percoll. טיהור חלבוני פני שטח מוביוטיניל באמצעות חרוזים מגנטיים סטרפטאבידין מאפשר ניתוח תפקודי התאים.

טיהור של biotinylated Cell חלבונים משטח מ

גלה סרטונים נוספים