טיהור של biotinylated Cell חלבונים משטח מ Rhipicephalus microplus תאים אפיתל גוט

טיהור חלבון פני השטח של התא הביוטינילי מתאי מעי אפיתל Rhipicephalus microplus. במסגרת מחקר זה, נעשה שימוש במתודולוגיה מבוססת שיפוע פרקול שונה כדי לבודד תאי אפיתל בודדים מרקמת המעי Rhipicephalus microplus. חלבונים הקשורים לפני השטח עברו ביוטינילציה וטוהרו באמצעות חרוזים מגנטיים של סטרפטווידין לשימוש ביישומים במורד הזרם.

דיסקציה של אפיתל המעי מ-Rhipicephalus microplus חצי גודש. תזדקק לחומרים הבאים. הדביקו רצועת סרט דביק לתחתית צלחת פטרי.

הוסף טיפה של דבק סופר לקלטת. הניחו את הצד הגחוני של הקרצייה כלפי מטה על הסופר גלו, ואפשרו לו להתייבש. טבלו לחלוטין את הקרצייה ב-100 מ"ל של PBS.

בעזרת אזמל מידה 11, חתוך מהחלק העליון של העיניים ועד לחלק התחתון משני צידי הקרצייה. בעזרת מלקחיים סטריליים, הסר לחלוטין את הסקוטום והאלוסקוטום כדי לחשוף את האיברים הפנימיים. הסר את האיברים דמויי החוט הלבן הדק ושאר הממברנות.

הסר את המעיים באמצעות מלקחיים. אחסן את המעיים ב-HBSS ו-PIC קרים כקרח. ניתוק תאי אפיתל.

תזדקק לחומרים הבאים. יוצקים את המעי המנותח על מסננת תאים של 70 מיקרון בתוך צינור פלקון של 50 מ"ל. מכיוון שעלול להיווצר ואקום בתוך צינור הבז, הרם את המסנן כדי לאפשר זרימת אוויר.

שטפו את רקמת המעי עם HBSS קר כקרח של 50 מ"ל עם PIC. השעו מחדש את המעיים ב-HBSS קר כקרח של 30 מ"ל עם PIC. במידת הצורך, השתמש במגרד סטרילי כדי לסייע בהשעיית המעיים.

צנטריפוגה במשקל 500 גרם. הסר את הסופרנטנט וחזור על תהליך הכביסה שלוש פעמים. השעו מחדש את תאי המעי ב-10 מ"ל של DMEM, 2% FCS, 5 מילי-מולרי EDTA, TCEP מילי-מולרי אחד ו-PIC.

מערבבים בעדינות. דגירה למשך 60 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס בסיבוב איטי באמצעות רולר. סנן את המתלה דרך מסננת תאים של 250 מיקרון.

מערבולת את הזרימה דרך. ולסנן דרך מסננת תאים של 70 מיקרון, לאסוף את הזרימה שנותרה. צנטריפוגה את המתלים.

בידוד של תאי אפיתל בודדים באמצעות שיפוע פרקול. תזדקק לחומרים הבאים. על ידי סינון דרך נייר סינון מקדים AP15, הכינו 40% ו-20% פרקול במי Milli-Q.

טען מזרק סטרילי עם תמיסת פרקול. החל אותו על מתקן המסנן ושחרר לאט את הפרקול. מצננים בארבע מעלות צלזיוס במשך שעה לפני שמניחים את השיפוע.

הגדר את המשאבה הפריסטלטית כפי שמוצג. בעזרת משאבה פריסטלטית המוגדרת במהירות הנמוכה ביותר, שכבה של שלושה מ"ל של 40% פרקול לתוך צינור אולטרה-צנטריפוגה של 16 מ"ל. הניחו לו להתיישב על קרח למשך 15 דקות.

מהירות המשאבה אמורה להוביל לקצב זרימה של פחות ממ"ל אחד לדקה. הטה את הצינור לזווית של 45 מעלות, השתמש במשאבה הפריסטלטית כדי לשכב את ה-20% פרקול על גבי שכבת ה-40%. ודא שצינור הפלט מונח על צינור הצנטריפוגה כדי למנוע ערבוב טיפות עם שכבות תחתונות.

מהירות המשאבה אמורה להוביל לקצב זרימה של פחות ממ"ל אחד לדקה. הניחו לשכבות להתיישב על קרח למשך 15 דקות. שימוש במשאבה פריסטלטית בקצב זרימה של פחות ממ"ל אחד לדקה לשכבה של שלושה מ"ל של תמיסת DMEM המכילה את תאי האפיתל המבודדים על פני שיפוע פרקול של 20 עד 40%.

ודא שצינור הפלט מונח על צינור הצנטריפוגה כדי למנוע ערבוב טיפות עם השכבות התחתונות, מה שמשבש את השיפוע. צנטריפוגה בחום של 600 גרם למשך 10 דקות. אסוף אינטרפאזות בין ה-DMEM, שיפוע פרקול 20% ושיפועי פרקול 20%40% כדי לבודד תאים בודדים אפיתליים.

ביוטינילציה של חלבון פני התא ובידוד חלבוני פני השטח הביוטיניים. תזדקק לחומרים הבאים. ביוטינילט 100 מיקרוליטר של תאי אפיתל חד-תאיים באמצעות ערכת צימוד ביוטין מסוג A לפי הוראות היצרן.

הוסף 100 מיקרוליטר PBS, 1% טריטון X-100, 10% גליצרול, 100 גלוטתיון מחומצן מיקרו-מולרי ו-PIC לתאים הביוטיניים. דוגרים על קרח למשך שעה עם ערבוב עדין כל 10 דקות. צנטריפוגה את תמצית התאים ב -20, 000 גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות ומניחה בצד.

הכן 50 מיקרוליטר חרוזים מגנטיים של סטרפטווידין על ידי שטיפה עם 1,000 מיקרוליטר TBS 1%Tween-20. יש לערבב בעדינות על ידי החלקה עם האצבע. הנח את הצינור במעמד מגנטי, ואסף את החרוזים כנגד דופן הצינור.

הסר והשליך את הסופרנטנט. שלב 300 מיקרוליטר של חלבוני פני תא ביוטיניליים עם חרוזים מגנטיים שטופים. דוגרים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר עם תסיסה.

אסוף את החרוזים עם המעמד המגנטי, הסר והשליך את הסופרנטנט. הוסף 300 מיקרוליטר של TBS 1%Tween-20 לשפופרת, ערבב בעדינות כדי להשעות מחדש את החרוזים. אספו חרוזים, הסירו והשליכו את הסופרנטנט.

חזור על שלב כביסה זה פעמיים. הוסף 100 מיקרוליטר מ-pH גליצין מולארי 1 שניים לחרוזים המגנטיים. ולדגור בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

אסוף חרוזים והסר סופרנטנט המכיל חלבוני שטח ביוטיניליים מולאים. איור 1 הוא ייצוג של הפרוטוקול המשמש לבידוד תאי אפיתל וחלבוני פני השטח שלהם מקרצייה שלמה. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לטהר כ-1.2 על 10 לשבעת התאים למ"ל עם 75 עד 80% כדאיות ו-20 עד 24 מיקרוגרם של חלבוני משטח ביוטיניליים מטוהרים מדיסקציה ראשונית של 50 קרציות.

תמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטיות מייצגות של תאי אפיתל של קרציות שהוכנו באמצעות פרוטוקול זה מוצגות באיור 2A ו-2B. התאים מופיעים כמורפולוגיה של משטח יחיד, כדורי, חלק וגודל עקבי בכל הדגימה. בידודים גרועים מוצגים כמכילים דיסוציאציה לא שלמה של תאי אפיתל בודדים עם אוכלוסיות תאים משתנות המזוהות באמצעות גדלי התאים והמורפולוגיות המשתנות.

ניתן למזער זיהום צולב מחלבונים מארחים, איור 3A, על ידי שטיפה מספקת של מעיים של קרציות כדי לייצר שיפוע פרקול לבן או שקוף, איור 3B. השוואה של חלבונים על ידי SDS-PAGE, איור 4A, כתם כסף, איור 4B, כתם נקודות, איור 5, ו-ELISA, איור 6, מצביעה על כך שהמתודולוגיות המתוארות טיהרו בהצלחה חלבוני פני שטח ביוטיניליים מתאי אפיתל בודדים שבודדו ממעיים של קרציות Rhipicephalus microplus. לסיכום, השיטות ששימשו במחקר זה בודדו בהצלחה תאי אפיתל בודדים מכל המעי של Rhipicephalus microplus.

חלבונים מפני השטח של תאי אפיתל Rhipicephalus microplus התקבלו לצורך ניתוח ומחקרים נוספים. לבסוף, הפרוטוקול שפותח הדגים את התפוקה הפוטנציאלית של תאי אפיתל בודדים ממעיים הקרציות ואת היעילות של חלבוני פני השטח הביוטיניים של התא. ניתן להשתמש בפרוטוקול שפותח בכל מין קרציות בעל חשיבות כלכלית במאמץ לחקור אינטראקציות בין קרציות למארח על ידי חקר הרכב חלבון הממברנה של המעי.