במבחנה הבידול של גזע Mesenchymal אנושי לתוך תאים דמויי Cardiomyocyte תפקודית

המטרה הכוללת של הליך ניסיוני זה היא לגרום ולצפות באינדוקציה קרדיומיוגנית של תאי גזע מזנכימליים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום תאי הגזע המזנכימליים כגון, אילו תרופות ניתן לגרום על ידי אותות סביבתיים ליצירת קרדיומיוציטים פונקציונליים. היתרון העיקרי של טכניקה זו, הוא שהיא מיישמת היווצרות מצטברת ושכבות עובריות לבביות, במקום חומרים פרמקולוגיים או חומר גנטי.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול במחלות לב וכלי דם מכיוון שהיא מרחיבה את הפוטנציאל הקרדיומיוגני של תאי גזע מזנכימליים. מי שידגים איתי את ההליך הזה יהיו גברת פרווה איקבאל, דוקטורנטית במעבדה שלנו, מקס ליברך ונדב גסנר, שניהם מתמחים במעבדה שלנו. לאחר בידוד חלקי גור חולדות על פי פרוטוקול הטקסט, חותכים את החדרים לשניים ומעבירים אותם לכלי של 10 סנטימטר עם 10 מיליליטר PBS ופס על קרח, כדי לתת לדם להישטף החוצה.

לאחר מכן בעזרת מספריים מעוקלים, חותכים את קירות החדרים לחתיכות קטנות בקוטר של שניים עד שלושה מילימטרים. בעזרת פיפטה סרולוגית, העבירו את חלקי הלב מ-10 עד 12 בעלי חיים לצינור של 50 מיליליטר ותנו להם להתייצב. הסר כמה שיותר PBS P/S, מבלי להסיר חתיכות לב.

לאחר מכן הוסף 10 מילימטרים של PBS P/S טרי. כדי לבודד את הקרדיומיוציטים, לאחר שחלקי הלב מתייצבים, השתמש ב-0.15% טריפסין ב-PBS, כדי להחליף את PBS P/S ולדגור את הרקמה ב-37 מעלות צלזיוס עם טלטול, למשך 10 דקות. השליכו את הסופרנטנט.

לאחר מכן, חזור על עיכול הטריפסין שלוש פעמים נוספות, למעט, קנקן סופרנטנטים לצינורות איסוף של 50 מיליליטר המכילים 10 מיליליטר של 100% FBS. לאחר מכן, צנטריפוגה את צינורות התאים ושואב את הסופרנטנט. לאחר מכן השתמש ב-DMEM-F12 עם 10% FBS ו-1% P/S כדי להשעות מחדש את התאים ולזרוע אותם על צלחת שש בארות.

לאחר שהתאים התחברו, החלף את המדיום בשני מיליליטר של מדיום טרי. להכנת MSCs מוכתמים מראש, הסר את המדיום מתרביות MSC שהגיעו למפגש של 70% עד 80% בכלים של 10 סנטימטר והוסף שלושה מיליליטר של תמיסת דיסוציאציה של תאים. דגרו את הכלים בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך חמש דקות.

העבירו את התאים המנותקים לצינור של 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב-400 x G למשך חמש דקות. שאפו את הסופרנטנט מבלי לשבש את כדור התא והשעו מחדש את התאים. לאחר מכן השתמש במונה תאים אוטומטי כדי לספור את התאים.

לדלל את התאים לריכוז של 1 x 10 עד MSCs השישי למיליליטר, ב-DMEM-F12 המכיל 10% FBS ו-1% P/S. לאחר מכן, לתאים בצינורות צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, הוסיפו צבע פלואורסצנטי בר-קיימא שאינו ניתן להעברה ודגרו על ה-MSCs למשך חצי שעה. לאחר צנטריפוגה של הצינורות ב-400 x G למשך חמש דקות, יש לשאוב את הסופרנטנט ולהשעות מחדש את הגלולה בריכוז של 1 x 10 ל-MSCs השישי למיליליטר.

לאחר מכן העבירו את ה-MSCs לקרדיומיוציטים בריכוז של 10 x 10 לתאים הרביעיים לכל באר מתוך צלחת שש הבארות. כדי ליצור תרביות משותפות מצטברות, הכינו תרחיף תא בודד של MSCs באלפא MEM, בתוספת 10% FBS ו-1% P/S. התחל היווצרות אגרגטים, על ידי הנחת 25 טיפות מיקרוליטר של תרחיף תאים על המשטח הפנימי של העפעפיים של כלי תרבית רקמה של 10 סנטימטרים.

הניחו את המכסים על עמיתיהם התחתונים המכילים PBS P/S. דגרו את הכלים בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. תחת מיקרוסקופ סטריאו, התבונן בהיווצרות מצטבר בטיפות לאחר שלושה ימים.

אם למעלה מ-80% מהטיפות הכילו אגרגטים שנוצרו, השתמש במיקרו-פיפטה של מיליליטר אחד כדי לאסוף את הטיפות מהמכסים ולהעביר את האגרגטים ישירות לחד-שכבות קרדיומיוציטים ראשוניות של חולדות. דגרו על התרביות המשותפות המצטברות עד שבועיים. החלפת עוצמת הקול המלאה של המדיום כל 72 שעות.

על בסיס יומיומי, השתמש במיקרוסקופ שדה בהיר כדי לצפות באגרגטים הנצמדים לשכבות תאי העובר. רשום אגרגטים חוזיים כאשר נצפים. האגרגטים הפעילים מתכווצים בצורה מסונכרנת, אנו מציעים מוליכות ביניהם בכל השכבה העוברית, שאין בה פעילות גופנית.

שואבים את המדיום ומוסיפים שני מיליליטר PBS לבאר מכלי שש הבארות. לאחר מכן הסר את ה- PBS והוסף שני מיליליטר תמיסת דיסוציאציה לכל באר. דגרו את הכלים בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך שלוש דקות.

כפי שמוצג כאן, HMSCs משלושה סוגים שונים הציגו שפע ומראה דומים בתרבויות משותפות ישירות. יומיים עד שלושה לאחר העברת טיפות תלויות לתאי לב בתרביות משותפות מצטברות, FTMs ו-PBCs לטווח הופיעו באגרגטים גדולים יותר בהשוואה לאלו שנראו מ-BMSCs. בניסוי זה, ניתוח זרימה ציטומטרי של ביטוי CD49F ב-MSCs לא מובחנים הראה כי 96% מה-PBCs של האק FTM, המכונים 89% מה-PBCs של האק ו-53% מה-BMSCs, היו חיוביים ל-CD49F על פני התא.

זרימה ציטומטרית ב-TRA זכתה ב-85 תאים, הראתה את הוויסות המוגבר של הסמן הקשור לקרדיומיוציטים, SIRPA ב-PBCs של האק FTM ו-PBCs של האק, אך לא ב-BMSCs מתרביות קרדיומיוציטים ישירות. כפי שניתן לראות כאן, העלאת רגולציה cx43 הייתה גבוהה משמעותית ב-FTM huck PBCs בהשוואה ל-PBC או BMSCs בתרבויות משותפות ישירות. ניתוח מיקרוסקופיה פלואורסצנטית גילה כי הבחנה בין FTM ל-PBCs למונחים, שניהם מווסתים cx43.

עם PBCs לטווח האק בחלק גבוה יותר מאשר FTM. עם זאת, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית גילתה כי פונקטה חיובית cx43 נצפו בקרום התא של PBCs של FTM huck והם היו בעיקר ציטופלזמיים בתאי המונח. לבסוף, כפי שניתן לראות כאן, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בהגדלה גבוהה בוצעה על תאים אנושיים ממוינים, לאחר תרבית משותפת ואושר השפע הגבוה של cx43 בקרום הפלזמה.

לאחר השליטה, ניתן לבצע את שלבי המפתח של הליך זה בשעה אחת כל אחד, אם הם מבוצעים כראוי. כאשר מנסים הליך זה, חשוב לשמור על אמצעי זהירות אספטיים. רקמות ראשוניות של בעלי חיים מעורבות שעלולות לגרום לזיהום, אם לא מטפלים בהן כראוי.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו תרבית נוספת של אגרגטים מתכווצים כדי לענות על שאלות נוספות כגון, אורך החיים של מבנים אלה. לאחר פיתוחה, טכניקה זו מאפשרת לחוקרים בתחום MSCs לחקור את פוטנציאל ההתמיינות של מקורות צעירים יותר של תאי גזע מזנכימליים כגון רקמות עובריות נוספות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין אגרגטים של MSC ולשלב אותם עם שכבות עובריות רקמות ראשוניות ישירות, באופן המספק אינדוקציה נכונה להתמיינות קרדיומיוגנית.

אל תשכח, שעבודה עם BRDU יכולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון טיפול נכון בפסולת ציטוטוקסית, בעת ביצוע הליך זה.