ההשפעות של טסיות דם עשיר Allogeneic פלזמה (PRP) על תהליך ריפוי של אכילס משרטוטי הגידים של חולדות: תיאור מתודולוגיים

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבחון את ההשפעות של הזרקה אחת של פלזמה עשירה בטבליות, או PRP, על העמידות ותהליך הריפוי של גידי אכילס של חולדות שנקטעו בניתוח בנקודות זמן שונות. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות מהירות לשאלות בתחום השלד והשרירים בנוגע לנגעי גידים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהפרוצדורות הכירורגיות, הביומכניות והתקדמות ה-PRP הן סטנדרטיות ומסודרות היטב.

ההשלכות של טכניקות אלו חולות גם על השימוש ב-PRP בבני אדם, כיוון שסוגי נגעים אלו ותהליך ריפוי הגידים דומים בין חולדות לבני אדם. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הכנת PRP לפגיעות של השלד והשרירים, ניתן להחיל טכניקת הזרקה זו גם על מערכות אחרות, כגון מחלות לב או עור. הדגמה חזותית של השיטה היא חשובה מאוד, מכיוון שהשלבים הכירורגיים והביומכניים דורשים הדירות עקבית כדי להשיג תוצאות אופטימליות.

התחילו בשקילת החולדה וסימון שלה בעזרת תג אוזן. לאחר אישור רמת הסדציה המתאימה באמצעות צביטה של בהונות, טפטפו טיפות מים על קרניות העיניים של בעל החיים והסירו את הפרווה מהגפה האחורית השמאלית. חטאו את העור החשוף עם תמיסת iso-Betadine בדילול של 1:10 והניחו את בעל החיים על משטח חימום בטמפרטורה של 20°C תחת מיקרוסקופ דיססקציה במצב שכיבה צדית, כאשר הגפה האחורית השמאלית נמצאת בעמדה העליונה.

אחזו בכף הרגל האחורית השמאלית באמצעות פינצטה ובצעו חתך עורי צדי באורך 20 עד 25 מילימטר מסביב לגיד אכילס. בעזרת מספריים עדינים, השתחו את הפסציה כדי לחשוף את קומפלקס גיד אכילס והסירו את גיד השריר הפלנטרי (plantaris tendon). חתכו את גיד אכילס באופן רוחבי, חמישה מילימטרים פרוקסימלית להסתמכותו בעקב, והסירו קטע באורך של חמישה מילימטרים.

לאחר מכן, השתמשו בחוט ספיג והמשיכו בתפרים לסגירת הפסציה והעור, והניחו את החולדה תחת מקור חום עם ניטור עד להחלמה מלאה. בזמן שהחיות המקבלות מחלימות, אספו 20 milliliters של דם מלא מלב חולדה תורמת אחת עבור כל חיה ניסוי, לתוך מבחנות נפרדות המכילות 3.2% buffered sodium citrate. כדי להפיק פלזמה עשירה בטבקיות, סבבו את הדם בצנטריפוגה והשתמשו בפיפטת העברה מפלסטיק כדי לאסוף בזהירות את השכבה העליונה המכילה PRP למבחנה פלסטית שנייה.

קבעו את נפח ה-PRP שנאסף ומדדו את ספירת הפלטלטים באמצעות אנלייזר המטולוגי. סובבו את ה-PRP שוב בצנטריפוגה והעבירו בזהירות את העלייה (supernatant) לשפופרת פלסטיק חדשה. הנפח שנותר בשפופרת ה-PRP צריך להיות כ-2/3 מהנפח הדרוש להשגת 2.5 times 10 to the sixth פלטלטים למיקרוליטר.

בשלב הבא, השעה בעדינות את משקע הפלטלטים באמצעות פיפטינג. מדוד את מספר הפלטלטים ב-platelet-rich plasma המרוכז, והוסף בחזרה את הנפח המתאים של platelet-poor plasma אוטולוגי כדי להגיע לריכוז היעד במידת הצורך. הפעל את הפלטלטים באמצעות 50 µL של סידן כלוריד לכל מיליליטר של PRP למשך כשעה בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, העבירו את הפלטלטים למזרק של 1 מ"ל המצויד במחט בקוטר 21G, והזריקו 50 µL של הפלטלטים ישירות לאתר התפר של כל חיה. בנקודת הסיום הניסויית המתאימה, גלחו את הגפה האחורית השמאלית של חיית הניסוי המורדמת, והניחו את החולדה תחת מיקרוסקופ dissection כפי שהודגם כעת. בעודכם מחזיקים את כף הרגל באצבעות, בצעו חתך של 10 מ"מ באתר הניתוח כדי לחשוף את ה-triceps suralis.

להסרת גיד העקב, חתכו את עצם העקב (calcaneal bone) באופן רוחבי, 5 עד 10 מילימטרים דיסטלית לנקודת ההיספחות שלו, והפרידו נתח מהשריר התלת-ראשי של השוק (triceps suralis) בגודל המספיק כדי להיכנס לفك הקירורי (cryo-jaw). השתמשו בפינצטה כדי להניח את הדגימה באופן מיידי בלסת העליונה של ה-cryo-jaw וסגרו את המכשיר. מקמו את ה-cryo-jaw בצורה אנכית בתוך מכונת בדיקה אוניברסלית, וקבעו את עצם העקב בין התפסנים התחתונים.

כדי לחשב את שטח החתך, מקם את המצלמות בניצב זו לזו. הוסף חנקן נוזלי לשני גביסי הלסת העליונה כדי להקפיא את השריר לרמה שהיא סדרי גודל קשיחה יותר מהגיד, כך שלא יעבור דפורמציה במהלך בדיקת המתיחה. כאשר אזור ההקפאה מגיע לגבול תפס המתכת, הגדר את קצב ההעתקה של המכשיר למהירות קבועה של 1 mm/sec עד לקריעה, והתחל את בדיקת המתיחה, תוך שימוש במחשב להקלטת חוזק המתיחה הסופי ב-Newtons.

כדי להתחשב בהבדלים בשטחי החתך של הגידים הנרפאים, נרמלו את חוזק המתיחה המקסימלי (ultimate tensile strength) לשטח יחידה המייצג את המאמץ המכני שחווה הרקמה. לאחר מכן, כאשר הגיד נקרע, הקפיאו במהירות (snap freeze) את דגימות הגיד הקרועות בחנקן נוזלי ואחסנו אותן בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס עד לביצוע מיצוי RNA ואנליזת RTPCR. בניסוי מייצג זה, נדרש כוח רב יותר כדי לגרום לקריעת הגיד בקבוצה שהוזרק לה PRP מאשר בקבוצת הביקורת שטופלה בתמיסת מלח (saline) בכל נקודת זמן שנבדקה, דבר המצביע על תהליך ריפוי חסון יותר או תכונות מכניות טובות יותר בקרב בעלי החיים שטופלו ב-PRP.

למרות שקבוצת ה-PRP הראתה פיזור פנים-קבוצתי גבוה יותר מאשר קבוצת הסליין, נקבע כי שטח החתך של הגידים היה גדול יותר בקבוצה שהוזרק לה PRP בימים 15 ו-30 לאחר השראת הנגע. יתרה מכך, צביעת Masson's trichrome חשפה נוכחות גבוהה יותר של קולגן פיברילי, רכיב מפתח במורפולוגיה ובחוזק של הגיד, בבעלי חיים שטופלו ב-PRP בימים 5 ו-15, כאשר בעוצמת צביעה דומה נצפתה בשתי הקבוצות עד יום 30 לאחר ההזרקה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי אופן השראת נגעים סטנדרטיים בחולדה, וכיצד לדגום את הגיד כדי להעריך את תהליך ההחלמה לאחר הזרקת PRP.