ההשפעות של טסיות דם עשיר Allogeneic פלזמה (PRP) על תהליך ריפוי של אכילס משרטוטי הגידים של חולדות: תיאור מתודולוגיים

המטרה הכוללת של הליך זה היא להתבונן בהשפעות של זריקה בודדת של פלזמה עשירה בטסיות, או PRP, על ההתנגדות ותהליך הריפוי של גידי אכילס של חולדה שנחתכו בניתוח בנקודות זמן שונות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מהירות בתחום השרירים והשלד לגבי נגעי גידים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שההליכים הכירורגיים, הביומכניים וה-PRP מתוקננים היטב.

ההשלכות של טכניקות אלה משתרעות על השימוש ב-PRP בבני אדם, מכיוון שסוגים אלה של נגעים ותהליך ריפוי הגידים דומים בין חולדות לבני אדם. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הכנת PRP לפציעות שרירים ושלד, ניתן ליישם טכניקת הזרקה זו גם על מערכות אחרות, כגון מחלות לב או עור. הדגמה חזותית של השיטה חשובה מאוד, מכיוון ששלבים כירורגיים וביומכניים דורשים שחזור עקבי על מנת להשיג תוצאות מיטביות.

התחל בשקילה ותיוג אוזניים של החולדה. לאחר אישור רמת ההרגעה המתאימה על ידי צביטת הבוהן, יש למרוח טיפות מים על קרניות החיה ולהסיר את השיער מהגפה האחורית השמאלית. יש לחטא את העור החשוף בדילול של 1 עד 10 של תמיסת איזו-בטדין ולהניח את החיה על כרית חימום של 20 מעלות צלזיוס תחת מיקרוסקופ מנתח במצב דקוביטוס לרוחב, כאשר הגפה האחורית השמאלית במצב העליון.

אחזו בכף הגפה האחורית השמאלית בעזרת מלקחיים ובצעו חתך עור רוחבי של 20 עד 25 מילימטר סביב גיד אכילס. בעזרת מספריים עדינים, נתחו את הפאשיה כדי לחשוף את קומפלקס גיד אכילס ולהסיר את גיד הפלנטריס. חותכים את גיד אכילס לרוחב, חמישה מילימטרים פרוקסימליים להחדרתו הקלקנאלית, ומסירים חלק באורך חמישה מילימטרים.

לאחר מכן השתמש בחוט נספג והמשיך עם תפרים כדי לסגור את הפאשיה והעור, והנח את החולדה מתחת למקור חום עם ניטור עד להחלמה מלאה. בזמן שבעלי החיים המקבלים מתאוששים, אספו 20 מיליליטר של דם מלא מלב חולדה תורם אחד לכל חיית ניסוי לתוך צינורות בודדים המכילים 3.2% נתרן ציטראט. כדי להשיג את הפלזמה העשירה בטסיות, צנטריפוגה את הדם והשתמש בפיפטה להעברת פלסטיק כדי לקצור בזהירות את השלב העליון המכיל PRP לתוך צינור פלסטיק שני.

קבע את נפח ה-PRP שנאסף ומדוד את ספירת הטסיות במנתח המטולוגיה. צנטריפוגה שוב את ה-PRP והעבירו בזהירות את ה-supernatant לתוך צינור פלסטיק חדש. הנפח הנותר בצינור ה-PRP צריך להיות בסביבות 2/3 מהנפח הנדרש כדי להשיג 2.5 כפול 10 עד הטסיות השישית למיקרוליטר.

לאחר מכן, השעו מחדש בעדינות את כדור הטסיות בעזרת פיפטינג. מדוד את ספירת הטסיות של פלזמה מרוכזת עשירה בטסיות דם, והוסף בחזרה את הנפח המתאים של פלזמה דלה בטסיות אוטולוגיות כדי להגיע לריכוז היעד לפי הצורך. הפעל את הטסיות עם 50 מיקרוליטר סידן כלורי למיליליטר PRP למשך כשעה בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן טען את הטסיות למזרק של מיליליטר המצויד במחט בגודל 21 והזריק 50 מיקרוליטר מהטסיות ישירות לאתר התפר של כל בעל חיים. בנקודת הסיום הניסוי המתאימה, יש לגלח את הגפה האחורית השמאלית של חיית הניסוי המורדמת, ולמקם את החולדה תחת מיקרוסקופ מנתח כפי שהודגם זה עתה. החזק את הכפה באצבעות, בצע חתך של 10 מילימטר באתר הניתוח כדי לחשוף את סוראליס התלת ראשי.

כדי להסיר את גיד אכילס, חתכו את העצם הקלקנאלית לרוחב, חמישה עד 10 מילימטרים רחוקים מהחיבור שלה ונתחו חתיכה מהסוראליס התלת ראשי גדולה מספיק כדי להתאים ללסת הקריו. השתמש במלקחיים כדי למקם את הדגימה מיד לתוך הלסת העליונה של הלסת הקריו ולסגור את המכשיר. הנח את הלסת הקריו אנכית לתוך מכונת בדיקה אוניברסלית, וקבע את העצם הקלקנאלית בין המהדקים התחתונים.

כדי לחשב את שטח החתך, מקם מצלמות בניצב זו לזו. הוסף חנקן נוזלי לשני אגני הלסת העליונה כדי להקפיא את השריר בסדר גודל נוקשה יותר מהגיד, כך שהוא לא יתעוות במהלך בדיקת המתיחה. כאשר אזור ההקפאה מגיע לגבול מהדק המתכת, הגדר את קצב התזוזה של המכונה במהירות קבועה של מילימטר לשנייה עד לקרע, והתחל בבדיקת המתיחה, באמצעות מחשב כדי לרשום את חוזק המתיחה האולטימטיבי בניוטונים.

כדי להסביר את ההבדלים באזורי החתך של גידי הריפוי, נרמל את חוזק המתיחה האולטימטיבי לאזור יחידה המייצג את הלחץ המכני שחווה הרקמה. לאחר מכן, כאשר הגיד נקרע, הקפיאו את דגימות הגיד הקרועות בחנקן נוזלי ואחסנו אותן בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס עד למיצוי RNA וניתוח RTPCR. בניסוי מייצג זה, נדרש כוח גדול יותר כדי לגרום לקרע בגידים בקבוצה שהוזרקה ל-PRP מאשר בקבוצת הביקורת שטופלה במי מלח בכל נקודת זמן שנבדקה, מה שמרמז על תהליך ריפוי חזק יותר או תכונות מכניות טובות יותר בקרב בעלי החיים שטופלו ב-PRP.

למרות שקבוצת ה-PRP הראתה פיזור תוך-קבוצתי גבוה יותר מאשר קבוצת מי המלח, שטח החתך של הגידים נקבע כגדול יותר בקבוצה שהוזרקה ב-PRP בימים 15 ו-30 לאחר השראת הנגע. יתר על כן, צביעת הטריכרום של מאסון חשפה נוכחות גבוהה יותר של קולגן פיברילרי, מרכיב מרכזי במורפולוגיה ובחוזק של הגידים, בבעלי חיים שטופלו ב-PRP בימים החמישי וה-15, עם עוצמת צביעה דומה שנצפתה בשתי הקבוצות ביום ה-30 לאחר ההזרקה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לגרום לנגעים סטנדרטיים של חולדה, ולדגום את הגיד כדי להעריך את תהליך הריפוי שלהם לאחר הזרקת PRP.