טכניקות מעבדה המשמשות לשמירה על ביו-טיפוסים של ויבריו כולרה בידוד קליני ואיכותי

המטרה הכוללת של טכניקה זו היא לספק אוסף של פרוטוקולים פשוטים לביצוע ויכולים לעזור לכל חוקר לאפיין בידוד קליני או סביבתי נתון של Vibrio cholerae. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הבקטריולוגיה כגון המאפיינים הגנוטיפיים והפנוטיפיים הספציפיים של כל ויבריו כולרה מבודד, במיוחד אלה בעלי רלוונטיות קלינית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לכל חוקר להשתמש באוסף בדיקות זה כדי לאפיין ולהבחין באופן אמין בין מבודדי ויבריו כולרה קליניים או סביבתיים.

יחד, בדיקות אלו מספקות גישה שיטתית שתשמש כחלופה או בנוסף לניסויים עתירי עבודה יקרים ואפיון של מבודדים קליניים וסביבתיים של Vibrio cholerae. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי האפיון של ביוטיפים של Vibrio cholerae, ניתן ליישם אותה גם כדי לאפיין את היכולות הביוכימיות והמטבוליות של חיידקי מעיים אחרים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בניהול זמן מכיוון שזמני הדגירה הדרושים להבטחת תוצאות מיטביות שונים בין הבדיקות הביוכימיות.

הדגמות חזותיות של פרוטוקולי האיתור והדקירה הן קריטיות מכיוון שהתזה יכולה לעתים קרובות להוביל לזיהום צולב ונדרש מרווח מקסימלי כדי למנוע מיזוג בין תרבויות. התחל את הפרוטוקול על ידי גלולה של 1.8 מ"ל של תרבית לילה נוזלית למשך שתי דקות על ידי צנטריפוגה במינימום של 8, 600 xG בצינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי של 2 מ"ל. לאחר הצנטריפוגה, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את כדור התא ב-900 מק"ל של מרק לוריא-ברטאני או LB טרי על ידי פיפטינג.

לאחר מכן, הוסף 900 מק"ל של גליצרול סטרילי של 60% נפח לנפח לתרבית וערבב על ידי מערבולת. מעבירים את התערובת לצינור קריוגני סטרילי של 2 מ"ל ומאחסנים את תרבית הציר בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס. כדי להשתמש במלאי, עם לולאת חיסון סטרילית, הסר כמות קטנה של ציר קפוא ופס את החיידקים כדי להשיג מושבות בודדות על צלחות אגר LB.

החזירו מיד את הציר הקפוא ל 80 מעלות צלזיוס לאחר השימוש כדי למנוע הפשרה מוחלטת של תרבויות. דגרו את הצלחות עם המכסה כלפי מטה למשך 12-16 שעות בחום של 37 מעלות צלזיוס. השג צלחת שהוכנה בעבר.

יש לחסן 4 מ"ל של מרק LB נוזלי בצינור תרבית סטרילי של 10 מ"ל עם מושבה אחת על ידי נגיעה במשטח המושבה הבודדת עם לולאה מעוקרת והעברת המושבה למרק הנוזלי. לאחר מכן, דגרו את התרבית עם אוורור בחממת שייקר ב-225 סל"ד למשך 12-16 שעות ב-37 מעלות צלזיוס. מכינים תרבית לילה במרק LB נוזלי.

למחרת, גלולה את התרבית ושטוף את התאים על ידי השעיה מחדש של כדור התא ב-1.8 מ"ל של מי מלח 1x פוספט או PBS. חזור על הליך הכביסה שלוש פעמים. עקוב אחר הכביסה השלישית עם מתלה מחדש סופי ב-1.8 מ"ל של 1x PBS.

לאחר מכן, השתמש בקצה פיפטה כדי לזהות 1 מק"ל של תרבית שטופה על המדיום המתאים. שוטפים את כדור התא המתקבל מתרבית לילה. חיסון צלחות אגר תנועתיות על ידי החדרת דקירה מחסנת לתרבית הנוזל השטוף ודקירת אנכית לתוך המדיה.

ודא שדקירת החיסון אינה מתכופפת בזמן דקירת האגר. בין כל חיסון, יש לעקר את דקירת החוט באמצעות מבער בונסן. דגרו את מכסה הצלחות כלפי מעלה למשך 14-24 שעות בחום של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר 14 שעות, עקוב מקרוב אחר לוחות התנועתיות כדי למנוע צמיחת יתר של תרבויות. יש לחסן 4 מ"ל של מרק מתיל אדום Voges-Proskauer או MR-VP על ידי פיפטינג של 10 מק"ל של תרבית לילה שהוכנה בעבר לתוך 4 מ"ל של מרק MR-VP בצינור תרבית סטרילי ולדגור עם אוורור בחממת שייקר ב-225 סל"ד למשך 12-16 שעות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסף 150 מק"ל של 5% משקל לנפח אלפא-נפתול ו-50 מק"ל של 40% משקל לנפח אשלגן הידרוקסיד ל-1 מ"ל של תרבית לילה MR-VP בצינורות תרבית סטריליים בהתאמה.

לאחר מכן, מערבול לזמן קצר את הצינורות. הניחו לצינורות לעמוד בטמפרטורת החדר עד ארבע שעות עד להתפתחות שינוי צבע. זני ייחוס ביוטיפיים וגרסאות מייצגות של El Tor נכללו במסכים גנטיים של בסיס PCR ובבדיקות פנוטיפיות כדי להבחין בין רקע ביוטיפי של מבודדים קליניים וסביבתיים של V.Cholerae.

O395 קלאסי מסוג פרא הדגים רצפי ctxB ו-tcpA קלאסיים. לעומת זאת, זני El Tor מסוג פרא N16961 ו-C6706 הדגימו רצפי El Tor ctxB ו-tcpA. MQ1795 ו-BAA-2163 מכילים את תת-היחידה הביוטיפית הקלאסית ctxB הדומה ל-0395.

עם זאת, שתי גרסאות El Tor הכילו את ה-tcpA המעיד על הרקע הביוטיפי של El Tor. כאשר גדל על צלחות אגר LB בתוספת פולימיקסין B, זן הביוטיפ הקלאסי מסוג הבר 0395 הראה רגישות לפולימיקסין B בעוד שזן ביוטיפ El Tor מסוג בר הראה עמידות. הזנים המייצגים של וריאנט אל טור הראו עמידות דומה לאנטיביוטיקה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להבחין בין ביוטיפים של Vibrio cholerae באמצעות מערכת זיהוי הבדיקות המרובות המתוארת בכתב יד זה. אל תשכח שעבודה עם פתוגנים BSL-2 עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש לאכוף טיפול וסילוק נכון של כל החומרים ומוצרי הפסולת על פי תקנות מוסדיות, מקומיות, מדינתיות ופדרליות. בנוסף לפרוטוקולים המפורטים בכתב יד זה, ניתן להשיג אפיון נוסף של מבודדי Vibrio cholerae באמצעות חקירת תכונות פנוטיפיות אחרות כגון היווצרות ביופילם ואוטואגלוטינציה.