מערכת משולבת להפעיל מרחוק אותות תאיים על-ידי Photoactivation קינאז בתיווך Upconversion ננו-חלקיק

מטרת ניסוי זה היא להדגים את ההיתכנות של פוטו-אקטיבציה של אנזים באמצעות קרינת אינפרא אדום קרובה. חלבון קינאז A בכלוב משותק על משטח זה של ננו-חלקיקי המרה המוזרקים לתאים, ותגובה המושרה על ידי קינאז בתאים חיים נצפית לאחר הקרנת אינפרא אדום קרובה. פוטו-אקטיבציה מסורתית דורשת אור UV פוטוטוקסי ובאופן בלתי נמנע, תגרום במקביל לתגובה כימית לא רצויה ותגובה דומה, עם זאת, באפשרויות הידידותיות שלנו, כמו קרינת אינפרא אדום קרובה אינה יכולה לעורר תגובה בגלל האנרגיה הנמוכה שלה.

ננו-חלקיק ההמרה יכול להמיר ביעילות אנרגיה נמוכה ידידותית ביולוגית ליד פוטון IR לפוטון UV באנרגיה גבוהה כדי לעורר תגובה כימית ליד פני החלקיקים ללא קרינת UV ישירה. קינאז ממלא תפקיד מפתח באונקוגנזה, טכניקה זו יכולה לעזור לנו לבחון יותר מידע על העברת אותות עם רעש מפריע נמוך בהרבה מפוטוטוקסיות UV ותגובת הלוואי שלה. בדרך כלל, אנשים חדשים בתחום זה יתקלו בקשיים בשינוי מכשירים והגדרה אופטית ליישום המרה.

כדי להתחיל, התקן עדשת אובייקטיבית פי 4 ליד מחזיק הקובט של הפלואורוספקטרומטר, כך שניתן יהיה למקד את הלייזר באמצע הקובט. הנח דיודת לייזר מתכווננת של 980 ננומטר 90 מעלות כנגד עדשת האובייקט. התקן מראה רפלקטיבית מלאה ואת צומת נתיב האור של עדשת המטרה והלייזר.

אל תשכח למקם לוחית מתכת אנודייז כדי לחסום את חלון העירור של הספקטרומטר כדי להגן על החלקים הפנימיים. לאחר מכן הנח קובטה של תמיסת ננו-חלקיקי המרה מצופה סיליקה במחזיק. ניתן לדמיין קרן המרה בהירה כאשר הלייזר נדלק.

העבר את הספקטרוסקופיה למצב זוהר, עם מתח PMT הנמוך ביותר במהלך היישור. כוונן את שלבי המראה והלייזר כך שהקרן תהיה דרך אמצע הקובט כדי שה-PMT יקלוט את האות החזק ביותר. לאחר התקנת מראה דיכרואית ומסנן עירור, התקן דיודת לייזר 980 ננומטר בנתיב האור בשכבה התחתונה.

הוסף קולימטור בין הלייזר למראה כדי לעזור לפזר ולהגדיל את אזור הקרנת ה-NIR במישור המוקד. לאחר מכן השתמש בתמיסת ננו-חלקיקי המרה כדי לדמיין את קרן האינפרא אדום הקרובה. כוונן את מיקום הלייזרtagה כדי למרכז את קרן האור האינפרא אדום הקרובה כדי לסיים את היישור.

בצע סינתזת PKA בכלוב ונטרל את ה-PKA/UCNP בכלוב, כדי ליצור PKA/UCNP בכלוב כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי למדוד את הפעילות של שני המבנים לפני פוטוליזה UV, מדוד את הירידה בסופגי NADH בתערובת הבדיקה לאורך זמן לאחר הוספת שני מיקרוליטרים של תמיסת PKA לתערובת הבדיקה. חזור על המדידה עבור PKA/UCNP.

לאחר מכן, בצע פוטוליזה UV ב-200 מילי-וואט לסנטימטר רבוע של PKA בכלוב ו-PKA/UCNP בכלוב, באמבט מי קרח, כדי לוודא שניתן להפעיל PKA. פעילות PKA נקבעת על ידי בדיקת אנזים פירובט קינאז לקטט דהידרוגנאז. עם ירידה בסופגי NADH, נמדד לאורך זמן לאחר הוספת תמיסת PKA.

דגרו את התאים בסרום בקר עוברי 10% המכיל מדיום L15 במהלך תקופת המיקרו-הזרקה לבקרת pH יציבה מחוץ לחממה. הגדר את מושך המחט לקצה בצורת חרוט בקוטר של כ-1.5 מיקרון לפתיחת קצה מאוחרת יותר. לפתיחת הקצה, התקן את המחט על המיקרו-מזרק, הזז את קצה המחט במגע עם קצה השקופית ועקוב עם כפתור עדין על המיקרוסקופtagה.

כוח רטט זה מספיק בכדי לשבור מעט את הקצה ולהגדיל את הפתח. בדוק את פתח המחט כדי לוודא שיש לו קוטר חיצוני בין 1.3 ל-1.5 מיקרון, אותו ניתן לאשש על ידי תמונות מיקרוסקופ באמצעות עדשת אובייקטיבית פי 40. לאחר מכן, הגדר את לחץ ההזרקה בין 50 ל-75 הקטופסקלים במרווח לחץ של 200 עד 300 מילישניות והגדר את לחץ הפיצוי הקבוע על 15 עד 30 הקטופסקאל כדי למנוע זרימה חוזרת בינונית לתוך המחט.

טען את קומפלקס ה-PKA/UCNP בכלוב בצבע TAMRA במיקום האחורי של המחט. לאחר מכן המחט הטעונה מוגדרת על מיקרומניפולטור הידראולי ציר אחד, עם זווית של 30 מעלות עד 45 מעלות. בדוק את המחט במיקרוסקופ כדי לוודא שלא נוצרה בועה לאחר טעינת הדגימה.

לאחר טבילת המחט במדיום, עבור למצב פלואורסצנטי, כדי לאשר שחרור פרץ של צבע כאשר מופעל לחץ הזרקה ושחרור איטי של צבע כאשר לחץ פיצוי הופעל כל הזמן. לאחר מכן עבור למצב שדה בהיר מנוגד פאזה, כדי להתחיל במיקרו-הזרקת תאים. ניתן לראות את גל ההלם של הממברנה בהזרקות מוצלחות.

שטפו את התאים פעמיים ובדקו את התאים המוזרקים לאיתור פלואורסצנטי TAMRA בהזרקה משותפת כדי לאתר תאים שהוזרקו בהצלחה. תא עם קבלת UCNP אך ללא אות צבע בהזרקה משותפת, מצביעים על כך שקרום התא נקרע במהלך ההזרקה ויש להוציא אותו מניסויים נוספים. הקרין את התאים עם דיודת לייזר של 980 ננומטר בנתיב האור התחתון הממוקד על ידי עדשת אובייקטיבית פי 10 למשך 15 דקות.

אפשר מרווח כהה של חמש דקות לאחר כל חמש דקות של הקרנה כדי למנוע חימום. אם יש צורך בזמן הפעלה קצר יותר, כגון שניות או אפילו תת-שניות, פשוט עבור לעדשת אובייקטיבית פי 40 לצפיפות פוטון מיקוד גבוהה יותר. לאחר פוטוליזה והתאוששות תאים, יש לתקן את התאים במיליליטר אחד או 4% פרפורמלדהיד ב-PBS למשך 20 דקות, לפני שאלקסה 594 נוספת עוקבת אחר הצביעה.

לבסוף, דמיין את התפוררות סיבי המתח הנגרמת על ידי NIR. לאחר הקרנת NIR, תאים שהוזרקו במיקרו-PKA/UCNP בכלוב כפי שמצוין על ידי חיצים לבנים, מראים פליטת המרה כלפי מעלה. התפוררות סיבי מתח הנגרמת על ידי פוטו-אקטיבציה מוצלחת של PKA NIR, חושפת יותר f אקטין וכתוצאה מכך גורמת לכתמים ירוקים חזקים ליד UCNP.

בקרה שלילית שבה התאים מוזרקים אך נשארים בחושך, אינה מראה התפוררות של סיבי הלחץ. ניתן לצבוע את רמת החשיפה ל-f actin לאחר פוטו-אקטיבציה של NIR עם אלקסה 594 ואחריה ולכמת על ידי תמונה J. עקומות עוצמה של צביעת f אקטין לאורך החץ האדום שורטטו, וסיפקו מידע כמותי על התפוררות סיבי מתח שניתן לתאם לפעילות PKA המושרה על ידי NIR. לאחר היכרות עם מיקרו-הזרקה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך יום אחד, כולל הכנה ובקרת איכות של PKA/UCNP בכלוב.

עם ההוראות שלנו לשינויים במכשיר שלנו ולניסויים, התגובה הרצויה יכולה להיות מופעלת על ידי IR קרוב, ברזולוציה זמנית מרחבית גבוהה כמו UV מסורתי לשיטות טיטרציה, אך ללא הפוטוטוקסיות, זה לא מדבק. לאחר צפייה בסרטון זה, מקווה שיש לך הבנה טובה כיצד להעביר קומפלקס ננו-חלקיקי אנזים לתא על ידי מיקרו-הזרקה ופוטו-אקטיבציה של האנזים, באמצעות תואם פעמון ליד אור IR. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה הכימית, שצריכים להשתמש באור כדי לעורר תגובה אנזימטית רצויה בתאים חיים לרזולוציה זמנית מרחבית כאשר התא אינו יכול לסבול פוטוטוקסיות UV.

בעקבות הליך זה, ניתן לשייך אפקטורים ביולוגיים אחרים לננו-חלקיקי המרה, כדי לענות על שאלות נוספות הדורשות פוטו-אקטיבציה זמנית מרחבית. אם הביו-אפקטור פועל מחוץ לתא, אין אפילו צורך במיקרו-הזרקה. פלטפורמת הפוטו-אקטיבציה הקרובה ל-IR יכולה גם לספק עומק חדירה רב יותר ברקמה ולכן ניתן ליישם אותה בבעלי חיים קטנים כדי לעורר תגובות רצויות בזמן ובמיקום הנתון.