ניתוח אינטראקציות חלבון חלבון שיתוף לוקליזציה בין רכיבי פערים, צמודים, ו adherens צמתים Murine בלוטות החלב

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לקבוע אם שני חלבוני צומת בין-תאיים או יותר מתמקמים בתוך התאים ולהעריך עוד יותר את האינטראקציה הפיזית שלהם באמצעות קו-אימונופרספיטציה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה של תחום בלוטות החלב, כולל התפקידים שממלאים צמתים בהתפתחות תקינה ומחלות כמו סרטן השד. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יכולה לספק מידע משמעותי על אינטראקציה בין חלבון לחלבון in vivo בעלות נמוכה יחסית.

כדי לבצע צביעה פלואורסצנטית קו-אימונולוגית, אחזר את השקופיות המיקרוסקופיות המתאימות מהמקפיא. תקן מיד את החלקים על ידי טבילתם בארבעה אחוז פורמלדהיד למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, טבלו את השקופיות במי מלח עם חוצץ פוספט בטמפרטורת החדר.

השאירו את השקופיות שם עד שתמשיכו לשלב הבא. הקיפו כל חלק במגלשה באמצעות מחסום הידרופובי זמין מסחרית או עט מעבדה דוחה מים. הוסף מיד טיפות PBS לרקמה, והנח את השקופית בתא היסטולוגיה אנושי למשך שארית ההליך.

יש לחסום כל קטע רקמה עם 100 עד 200 מיקרוליטר של שלושה אחוז מלח בסרום בקר אלבומין-טריס-בופר, 0.1% פוליסורבט-20, למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. בזמן שהדגימות חוסמות, הכינו את תמיסות הנוגדנים הראשוניות והמשניות על ידי דילול הנוגדנים ב-TBS 0.1% פוליסורבט-20. לאחר הסרת התמיסה החוסמת על ידי שאיפה, דגרו את החלקים ב-100 עד 200 מיקרוליטר של הנוגדן הראשוני המדולל למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן הסר את תמיסת הנוגדנים העיקרית על ידי שאיבה ושטוף את החלקים עם 250 עד 500 מיקרוליטר TBS 0.1% פוליסורבט-20 למשך חמש דקות. הסר את תמיסת הכביסה על ידי שאיפה לפני שתחזור על הכביסה פעמיים. שאפו את תמיסת הכביסה ודגרו את החלקים עם 100 עד 200 מיקרוליטר של הנוגדן המשני המצומד המתאים Fluoro-4 למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר הסרת תמיסת הנוגדנים המשנית על ידי שאיבה יש לשטוף את החלקים עם 250 עד 500 מיקרוליטר TBS 0.1% פוליסורבט-20 למשך חמש דקות. הסר את תמיסת הכביסה וחזור על הפעולה פעמיים. חזור על שלבים אלה באמצעות השילוב המתאים של גופים ראשוניים ומשניים עבור כל החלבונים הבאים המעניינים.

לאחר הסרת הכביסה הסופית, בצע את צביעת הגרעינים על ידי דגירה של החלק עם 100 עד 200 מיקרוליטר של מיליגרם אחד למיליטר DAPI ו-TBS 0.1% פוליסורבט-20 למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את תמיסת ה-DAPI והרכיבו את המגלשות באמצעות אמצעי הרכבה מסיס במים שאינו פלואורסצנטי והחלקות כיסוי. הניחו את המגלשות שטוחות במקרר של ארבע מעלות צלזיוס למשך שמונה שעות לפחות.

המשך להדמיה מיקרוסקופית פלואורסצנטית כמתואר בפרוטוקול הטקסט. אוספים 500 עד 1000 מיקרוגרם מהליזאט ומדללים אותו ב-PBS לכל נפח סופי של 200 מיקרוליטר בכל צינור של 1.5 מיליליטר. הוסף את הנוגדן נגד האנטיגן המעניין לשפופרת הראשונה של הליזאט, ושמור אותו על קרח.

דגרו את הצינורות למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס על מערבל רולר צינורות במהירות נמוכה. למחרת, הוסף 50 מיקרוליטר חרוזים מגנטיים לצינורות חדשים של 1.5 מיליליטר לשטיפה מוקדמת. הנח את הצינורות המכילים את החרוזים על המעמד המגנטי ואפשר לחרוזים לנדוד לכיוון המגנט.

הסר את מאגר האחסון מהחרוזים באמצעות פיפטה של 200 מיקרוליטר. שטפו את החרוזים על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של PBS 0.1% פוליסורבט-20, ומערבלו את הצינורות במרץ במשך 10 שניות. לאחר מכן, החזירו את הצינורות למעמד המגנטי ואפשרו לחרוזים לנדוד לכיוון המגנט.

הסר את מאגר הכביסה העודף על ידי פיפטה עם פיפטה של 200 מיקרוליטר. מוסיפים את קומפלקס תגובת הנוגדנים ליזאט לחרוזים ודוגרים במשך 90 דקות בטמפרטורת החדר על מערבל הרולר. לאחר הדגירה, הניחו את הצינורות על המעמד המגנטי ואפשרו לחרוזים לנדוד לכיוון המגנט.

בעזרת פיפטה של 200 מיקרוליטר, שואבים וזורקים את הליזאט ומניחים את הצינורות על קרח. שטפו את החרוזים פעמיים על ידי הוספת 500 מיקרוליטר PBS, הנחת הצינורות על המעמד המגנטי והוצאת הנוזל כמו קודם. במהלך שלבי הכביסה, הימנע ממערבולת, ושמור את הדגימות על קרח.

שטפו את החרוזים פעם אחת עם PBS 0.1% פוליסורבט-20 ללא מערבולת והשליכו את מאגר הכביסה האחרון באמצעות קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר. כדי להוציא, הוסיפו 20 מיקרוליטר של 0.2 גליצין חומצי מולרי לצינורות ונערו אותם במשך שבע דקות על מערבל הרולר. לאחר צנטריפוגה במהירות גבוהה במשך כמה שניות, אספו את הסופרנטנט בצינור טרי וקר כקרח.

חזור על שלבי הכביסה והפליטה עבור כל צינור. לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטר של מאגר 4x לדגימה הנפלטת של 40 מיקרוליטר. הוסף מיד טריס טוחנת אחת לדגימות המנופחות, טיפה אחת בכל פעם, עד שצבעו הופך לכחול, ולאחר מכן המשך לצינורות הבאים.

מרתיחים את הדגימות המופשטות בחום של 70 עד 90 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. טען את הליזטים המוכנים ואת הדגימות המשקעות זה לצד זה בג'ל אקרילאמיד SDS-PAGE. הפעל את הג'ל במאגר פועל ב-100 וולט למשך כ-95 דקות, או עד שקצה החלבונים הנודדים מגיע לתחתית הג'ל.

לאחר מכן, העבירו את הג'לים לקרום ניטרוצלולוזה או PVDF באמצעות פרוטוקול סטנדרטי. לאחר מכן, חסום את הממברנה למשך שעה על נדנדה במהירות נמוכה בחמישה אחוז TTBS חלב יבש. כדי לזהות אם המשקעים היו מוצלחים, בדוק את הממברנה באמצעות הנוגדן הראשון כנגד החלבון המשקע.

מדללים אותו בחמישה אחוז חלב יבש TTBS בריכוז המומלץ על ידי היצרן. דגרו את הממברנה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס על משטח נדנדה עם תסיסה איטית. למחרת, שטפו את הממברנה שלוש פעמים למשך חמש דקות כל אחת עם TTBS על פלטפורמת נדנדה עם תסיסה גבוהה.

לאחר מכן, דגרו את הממברנה בנוגדנים המשניים המתאימים המצומדים עם חזרת פרוקסידאז, מדולל ב-TTBS, למשך שעה בטמפרטורת החדר על משטח נדנדה עם תסיסה איטית. בצע שלוש עד שש כביסות, כל אחת למשך חמש דקות, עם TTBS על משטח נדנדה עם תסיסה גבוהה. נתח את האות של הנוגדן המשני על ידי דגירה של הממברנה בתמיסת לומינול זמינה מסחרית ופעל לפי הוראות היצרן.

זיהוי האות באמצעות מערכת הדמיה כימילומינסנציה. כדי לזהות חלבונים הפועלים באינטראקציה, חזור על שלבים אלה באמצעות הנוגדנים המתאימים על אותו כתם. כדי לקבוע אם צומת פערים, צומת היצמדות ורכיבי צומת הדוקים יכולים לקיים אינטראקציה יחד בבלוטת החלב, בוצעו בדיקות קו-אימונופלואורסצנטיות.

בדיקת הקו-אימונופלואורסצנציה מראה כי בטא-קטנין, חלבון אינטגרלי של צומת דבקים, וקונקסין 26, חלבון צומת פער, מתמקמים בקרום התא בבלוטות החלב של עכברים ביום השביעי של ההנקה, כפי שמשתקף מהצבע הצהוב. גרעיני התאים מוצגים עם צביעת DAPI כחולה. חתכים קריו-פלואורסצנטיים מבלוטות החלב ביום ההריון ה-18 נחתכו ונצבעו בצורה אימונו-פלואורסצנטית עבור קלודין 7, חלבון צומת הדוק המוצג בירוק, E-Cadherin, חלבון צומת דבק המוצג באדום, ו-Connexin 26, חלבון צומת פער המוצג בכחול אלמוגים.

הגרעינים היו מוכתמים ב-DAPI כחול. קו-לוקליזציה של E-Cadherin ו-Claudin 7 מוצגת כצבע צהוב עד כתום בהיר, בעוד ש-Connexin 26 עם E-Cadherin ו-Claudin 7 הביאה לצביעה מנוקדת בלבן. כדי לגלות אילו חלבוני צומת מתערבבים ונקשרים פיזית יחד בקרום התא, בוצעה קו-אימונופרספיטציה באמצעות רקמות בלוטת החלב מעכברים מניקות.

התוצאות הראו כי Connexin 43, מרכיב של צומת הפער, מקיים אינטראקציה עם E-Cadherin ו-Claudin 7, אך לא עם Claudin 3. תוצאות אלה אושרו על ידי המשקעים החיסוניים ההדדיים. כאשר E-Cadherin היה משקע חיסוני, הוא קיים אינטראקציה עם Connexin 43 ו-Claudin 7.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך יומיים עבור קו-אימונופלואורסצנציה של ארבע עד שמונה שקופיות, וניתן לצלם שקופיות למחרת אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך הקו-אימונופלואורסצנטי, חשוב לזכור לבחור נוגדנים מצומדים שונים של פלואורו 4 הגדלים בחללים שונים עם אורכי גל לא חופפים ולבחור את החרוזים המגנטיים המתאימים לחלבון A או G התואמים לנוגדנים המשמשים לקו-אימונו-משקעים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של התא לחקור את יחסי הגומלין של צמתים בין-תאיים בבלוטות החלב של עכברים.

אל תשכח שעבודה מסוכנת ביותר ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות בעת ביצוע הליך זה.