Name: פרוטוקולים עבור C- לבנים DNA הרכבה רגילה באמצעות Cpf1 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: למדו את שיטת ההרכבה C-Brick באמצעות חלבון Cpf1 ליצירת מעגלים גנטיים מורכבים בביולוגיה סינתטית. פרוטוקול זה מאפשר הרכבה איטרטיבית ובלתי תלויה ברצף של DNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים שנחאי טולו ביוטק על סיוע טכני שלהם במהלך הפיתוח של תקן C לבנים. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי תוכנית עדיפות אסטרטגית מחקר של האקדמיה הסינית למדעים (מענק מס &#39;XDB19040200).

<ol><li>Canton, B., Labno, A., Endy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refinement+and+standardization+of+synthetic+biological+parts+and+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Refinement and standardization of synthetic biological parts and devices.</a> Nat Biotechnol. 26 (7), 787-793 (2008).</li>
<li>Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+BioBrick+vectors+from+BioBrick+parts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Eng%22%5BJournal%5D)">Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts.</a> J Biol Eng. 2, (2008).</li>
<li>Knight, T. <a target="_blank" href="https://dspace.mit.edu/handle/1721.1/21168">Idempotent Vector Design for Standard Assembly of Biobricks</a>. , MIT Artificial Intelligence Laboratory; MIT Synthetic Biology Working Group. 1-11 (2003).</li>
<li>Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-Brick%3A+A+New+Standard+for+Assembly+of+Biological+Parts+Using+Cpf1%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">C-Brick: A New Standard for Assembly of Biological Parts Using Cpf1.</a> ACS Synth Biol. 5 (12), 1383-1388 (2016).</li>
<li>Anderson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BglBricks%3A+A+flexible+standard+for+biological+part+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Eng%22%5BJournal%5D)">BglBricks: A flexible standard for biological part assembly.</a> J Biol Eng. 4 (1), (2010).</li>
<li>Liu, J. K., Chen, W. H., Ren, S. X., Zhao, G. P., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iBrick%3A+a+new+standard+for+iterative+assembly+of+biological+parts+with+homing+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">iBrick: a new standard for iterative assembly of biological parts with homing endonucleases.</a> PLoS One. 9 (10), e110852(2014).</li>
<li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).</li>
<li>Wright, A. V., Nunez, J. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+and+Applications+of+CRISPR+Systems%3A+Harnessing+Nature%27s+Toolbox+for+Genome+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Biology and Applications of CRISPR Systems: Harnessing Nature's Toolbox for Genome Engineering.</a> Cell. 164 (1-2), 29-44 (2016).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li>
<li>Shanghai Tolo Biotechnology Company Limited. , Shanghai 200233, China. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.tolobio.com/">http://www.tolobio.com/</a> (2017).</li>
<li>Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one+pot%2C+one+step%2C+precision+cloning+method%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A one pot, one step, precision cloning method.</a> PLoS One. 3 (11), e3647(2008).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Casini, A., Storch, M., Baldwin, G. S., Ellis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bricks+and+blueprints%3A+methods+and+standards+for+DNA+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bricks and blueprints: methods and standards for DNA assembly.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 568-576 (2015).</li>
<li>Cameron, D. E., Bashor, C. J., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+history+of+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A brief history of synthetic biology.</a> Nat Rev Microbiol. 12 (5), 381-390 (2014).</li>
<li>Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biology+for+synthetic+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic biology for synthetic chemistry.</a> ACS Chem Biol. 3 (1), 64-76 (2008).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

פרוטוקול זה מתאר הליך עבור תקן ה- DNA הרכבה C-Brick. השלב החשוב ביותר בפרוטוקול זה הוא לינאריזציה של וקטור סטנדרטי לבנים; מחסור שלם של וקטור יכול להשפיע על שיעור ההצלחה. בנוסף, למרות Cpf1 בעיקר cleaves היעד רצפי DNA דפוס &quot;18-23&quot; מחשוף, מחשוף מדויק ליד שני בסיסים התגלה גם 4 , אשר יכול לגרום למספר קטן של מוטציות לאחר הרכבה דנ&quot;א. לכן, רצף סנגר יש צורך לאמת את המבנה התאספו. היעי...

סטנדרטיזציה של חלקים ביולוגיים DNA חשוב לפיתוח של ביולוגיה סינתטית 1 . פיתוח של תהליך הרכבה דנ&quot;א יכול להחליף עיצובים ניסיוניים אד הוק ולהסיר רבים של תוצאות בלתי צפויות המתעוררות במהלך הרכבה של רכיבים גנטיים לתוך מערכות גדולות. תקן ה- BioBrick (BBF RFC 10) היה אחד התקני ה- DNA הראשונים שהוצעו. הוא משתמש ברצף קידומת (המכיל EcoRI ו XBAI חיתוך אתרים) ואת רצף הסיומת (המכיל Spei ו PSTI חיתוך אתרים) 2 , 3 . כי XbaI ו SpeI יש משלים מלוכדת משלימים, BioBrick חלקים DNA שנחתכים עם XbaI ו SpeI ניתן לחבר יחד, יצירת BioBrick חדש להרכבה איטרטיבי נוסף. פגמים מסוימים זוהו עם השימוש של תקן BioBrick 4 . לדוגמה, הוא מייצר צלקת 8-bpבין חלקי ה- DNA, אשר אינו מאפשר בניית חלבונים בתוך היתוך. חוץ מזה, ארבעה סוגי הנ&quot;ל של אתרים 6-bp הגבלה יש להסיר את החלקים DNA, וזה מאוד לא נוח. תקן BglBrick הוקמה כדי לפתור את הבעיה הראשונה 5 . זה יוצר 6 &quot;BP&quot; GGATCT &quot;צלקת, לייצר Gly-Ser ומאפשר היתוך של חלבונים מרובים או תחומים חלבון. IBrick פותחה כדי להתמודד עם הבעיה השנייה 6 . היא משתמשת endonucleases ביתית (HE) כי לזהות רצפים דנ&quot;א ארוך. כמו אתרי זיהוי HE לעתים רחוקות קיימים רצפי DNA טבעי, תקן iBrick ניתן להשתמש לבנייה ישירה של חלקים iBrick ללא שינוי רצפי DNA שלהם. עם זאת, תקן iBrick משאיר צלקת bp 21 בין חלקי ה- DNA, אשר עשוי להיות הסיבה הפופולריות שלה. בשנים האחרונות, מקובצים באופן קבוע חוזרים interinded קצר palindromic (CRISיחסי ציבור) מערכת פיתחה במהירות 7 , 8 . בין CRISPR הקשורים (חלבונים) Cas, CAS9 endonuclease מ streptococcus pyogenes כיום בשימוש נרחב. זה בעיקר מציג הפסקות דנ&quot;א כפול תקועים (DSBs) עם הקצוות קהה 9 . בשנת 2015, ג &#39;אנג ו coworkers מאופיינים Cpf1 (CRISPR מ Prevotella ו Francisella 1) בפעם הראשונה. זה שייך בכיתה 2 סוג CRISPR-Cas המערכת היא CRNARNA CRNA (CRRNA) מונחה endonuclease 10 . שלא כמו Cas9, Cpf1 מציג DSB עם 4 או 5 nt 5 &#39;overhang 10 . בהתבסס על מאפיין זה, Cpf1 שימש לפיתוח תקן הרכבה דנ&quot;א, C-Brick 4 . על וקטור סטנדרטי בריק C, ארבעה Cpf1 אתרי היעד של T1 / T2 קידומת ו סיומות T3 / T4 צדי החלקים הביולוגיים; זה דומה תקן BioBrick. כמו מחשוף של T2 ו T3 אתרים עמ &#39;מייצרת קצוות דביקים משלימים, ניתן לבצע את הרכבה האיטרטיבית של חלקי ה- DNA תוך יצירת צלקת &quot;GGATCC&quot; בין החלקים. יש לציין, תקן C-Brick יש שני יתרונות עיקריים: זיהוי רצפים יעד ארוך לעזוב צלקות קצרות. 6 &quot;BP&quot; צלקת &quot;GGATCC&quot; שנוצר על ידי C- לבנים מקודד Gly-Ser, אשר מאפשר את בניית חלבונים היתוך. יתר על כן, תקן C- לבנים הוא גם תואם חלקית עם BglBrick ו BioBrick סטנדרטים.

<table><tbody><tr><td>Comercial Oligonucleotide</td><td>Sangon Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x Taq PCR Buffer</td><td>Transgen</td><td>#J40928</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Pure Dispected</td><td>Water Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>5x RNA Transcription Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0441</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA פולימראז</td><td>Thermo Scientific</td><td>#EP0111</td><td></td></tr><tr><td>תערובת NTP</td><td>סנגון</td><td>#ND0056</td><td></td></tr><tr><td>RRI (מעכב RNase רקומביננטי)</td><td>Takara</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>RNA נקי & רכז-5</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis ספקטרומטר</td><td>תרמו מדעי</td><td>ננו-טיפה 2000c</td><td></td></tr><tr><td>2x מאגר פנטה מקס</td><td>Vazyme</td><td>PB505</td><td>PCR מאגר</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Transgen</td><td>AD101</td><td></td></tr><tr><td>Phanta Max סופר-נאמנות DNA פולימראז</td><td>Vazyme</td><td>P505-d1</td><td></td></tr><tr><td>Ezmax לשיבוט טולוביו בשלב אחד</td><td></td><td>24303-1</td><td>ערכת הרכבה חלקה</td></tr><tr><td>5x מאגר לשיבוט Ezmax שלב אחד</td><td>Tolobio</td><td>32006</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>#R0136L</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>NEB</td><td>#R3136L</td><td></td></tr><tr><td>BglII&nbsp;</td><td>NEB</td><td>#R0144L</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td>#R0145L</td><td></td></tr><tr><td>SpeI</td><td>NEB</td><td>#R3133L</td><td></td></tr><tr><td>10x מאגר 3</td><td>NEB</td><td>#B7003S</td><td></td></tr><tr><td>10x CutSmart Buffer</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 DNA ligase Buffer</td><td>Tolobio</td><td>32002</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>Tolobio</td><td>32206</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>Tolobio</td><td>32210</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>NEB</td><td>#R01762</td><td></td></tr><tr><td>SV ג'ל ומערכת ניקוי PCR</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>פלסמיד מיני ערכת</td> I <td>אומגה</td><td>D6943-02</td><td>ערכת הכנת פלסמיד</td></tr><tr><td>פוספטאז אלקליין רגיש לחום&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>#EF0651</td><td>FastAP</td></tr><tr><td>10x Cpf1 buffer</td><td>Tolobio</td><td>32008</td><td></td></tr><tr><td>Cpf1</td><td>Tolobio</td><td>32105</td><td>FnCpf1</td></tr><tr><td>thermocycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>veriti 96 well</td><td></td></tr><tr><td>C-Brick וקטור סטנדרטי</td><td>Tolobio</td><td>98101</td><td></td></tr><tr><td>E. coli [DH10B]</td> <td>Invitrogen</td><td>18297010</td><td></td></tr><tr><td>מדיה לוריא-ברטנית (טריפטון)</td><td>אוקסואיד</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>מדיה לוריא-ברטאני (תמצית שמרים)</td><td>אוקסואיד</td><td>LP0021</td><td></td></tr><tr><td>מדיה לוריא-ברטני (NaCl)</td><td>סנגון ביוטק</td><td>B126BA0007</td><td></td></tr></tbody></table>

פרוטוקולים עבור c- לבנים dna הרכבה רגילה באמצעות cpf1

Protocols for C-Brick DNA Standard Assembly Using Cpf1

CRISPR הקשורים חלבון Cpf1 cleaves פעמיים תקועים DNA תחת הדרכת CRISPR רנ&quot;א (crRNA), יצירת הקצוות דביקים. בגלל זה מאפיין, Cpf1 שימש להקמת תקן הרכבה דנ&quot;א בשם C-Brick, אשר יש את היתרון של אתרי הכרה ארוכה צלקות קצרות. על וקטור C- לבנים רגיל, ישנם ארבעה אתרי זיהוי Cpf1 - קידומת (T1 ו T2 אתרים) ואת הסיומת (T3 ו T4 אתרים) - צף חלקים DNA ביולוגי. המחשוף של אתרי T2 ו- T3 מייצר קצוות דביקים משלימים, המאפשרים הרכבה של חלקי DNA עם אתרי T2 ו- T3. בינתיים, צלקת קצרה &quot;GGATCC&quot; נוצר בין חלקים לאחר הרכבה. כמו פלסמיד החדש שנוצר שוב מכיל את ארבעת אתרי Cpf1 מחשוף, השיטה מאפשרת הרכבה איטרטיבי של חלקי ה- DNA, אשר דומה לאלה של תקנים BioBrick ו BglBrick. הליך המתאר את השימוש בתקן C-Brick להרכבת חלקי DNAמתואר כאן. תקן C-Brick יכול להיות בשימוש נרחב על ידי מדענים, בוגר סטודנטים לתואר ראשון, ואפילו חובבים.

<html> פרוטוקול זה הוכיח את הרכבה של שלוש קלטות chromoprotein (cjBlue (BBa_K592011), eforRed (BBa_K592012), ו amilGFP (BBa_K592010)). ראשית, רצפי ההקלדה של שלושת הגנים והטרמינלים הנ&quot;ל הושככו בנפרד לתוך וקטור סטנדרטי של C-Brick. חלקים דנ&quot;א קצר, האמרגן ואת הטרמינטור, הוכנסו לתוך וקטור C- לבנים באמצעות הגברה PCR באמצעות primers המכילים את חלקי ה- DNA קצר על מסוף 5 &#39;. זה היה ואחריו שיטת קשירת עצמי. שלושה רצפים chromoprotein קידוד היו הראשו...

CRISPR הקשורים חלבון Cpf1 יכול להיות מונחה על ידי CRNA RNA (CRRNA) שתוכנן במיוחד כדי לדבוק DNA כפול תקועים באתרים הרצוי, יצירת הקצוות דביקים. בהתבסס על מאפיין זה, תקן DNA הרכבה (C-Brick) הוקמה, ופרוטוקול המפרט את השימוש שלה מתואר כאן.

פרוטוקולים עבור C- לבנים DNA הרכבה רגילה באמצעות Cpf1

CRISPR-associated protein Cpf1 cleaves double-stranded DNA under the guidance of CRISPR RNA (crRNA), generating sticky ends. Because of this ...

הסרטונים הבאים מפרטים נוהל לשימוש בתקן C-Brick להרכבת חלקי DNA באמצעות חלבון הקשור ל-CRISPR, Cpf1. שיטה זו יכולה לקדם את פיתוח הרכבת ה-DNA בתחום הביולוגיה הסינתטית. כגון על ידי הקלה על בניית מעגלים גנטיים מסובכים.היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא בלתי תלויה ברצף ומאפשרת הרכבה איטרטיבית של מבני DNA. הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר שמנו לב ש-Cpf1 מונחה על ידי siRNA יחיד ו-DNA קטליטי שנערם. לכן, יצירת DKNs.מי שתדגים את ההליך תהיה שי-יואן לי, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי לתקן את תבניות ה-crRNA, השעו מחדש את האוליגונוקלאוטידים הבודדים במים נטולי RNase לריכוז של 10 מיקרומולר. לצינור PCR של 0.2 מיליליטר, הוסף אוליגונוקלאוטיד גדיל עליון, אוליגונוקלאוטיד גדיל תחתון ומאגר חישול פי 10 כמפורט במסמך הנלווה.ודא שהנפח הכולל הוא 50 מיקרוליטר. טבלה זו מציגה שישה אוליגונוקלאוטידים שונים של גדיל תחתון, שכל אחד מהם צריך להיות מזווג בנפרד עם הגדיל העליון, T7-F. האותיות הקטנות מייצגות את הרצף שיש לתמלל לרצף המנחה של crRNA.הנח את צינור ה-PCR לתוך תרמו-סייקלר הפעל את תוכנית החישול עם דניטרציה ראשונית ב-95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, ולאחר מכן התקרר מ-95 עד 20 מעלות צלזיוס עם ירידה של מעלה אחת צלזיוס לדקה. לאחר החישול, בצע מיד את השעתוק על ידי שילוב המוצר המחושל עם מים ללא RNase, מאגר שעתוק T-7

protocols-for-c-brick-dna-standard-assembly-using-cpf1

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

אוטומטי קיימא ויסות מערכת חיידקים לטיפול של זיהומי נפט תוכנן באמצעות חלקי DNA החלפה סטנדרטיים (BioBricks).

Toolkit כדי לאפשר גיור פחמימן בסביבות מימיות

הומולוגי רקומבינציה טכניקות מאוד...

Recombineering הומולוגי רקומבינציה בבונה<em&gt; דרוזופילה</em

סינתזה של פלסמידים מותאמים אישית גוזלת עבודה וזמן. פרוטוקול זה מתאר את השימוש בשיבוט הרכבה של גיבסון כדי להפחית את העבודה ומשך הליך שיבוט ה-DNA המותאם אישית. הפרוטוקול המתואר מייצר גם מבני חלבון מתויגים אמינים לביטוי יונקים בעלות דומה לשיבוט ה-DNA המסורתי של גזירה והדבקה.

דור של פלסמיד וקטורים לבטא חלבונים מתויג FLAG על פי תקנות ההסדרה של יזם אדם התארכות Factor-1α שימוש גיבסון עצרת

כאן, אנו מציגים כימרה הרכבה על ידי התאוששות פלסמיד והגבלת אנזים האתר הכניסה (CAPRRESI), פרוטוקול המבוסס על החדרת אתרי אנזים הגבלה לתוך רצפי DNA נרדף התאוששות פלסמיד פונקציונלי. פרוטוקול זה הוא שיטה מהירה בעלות נמוכה עבור מיזוג גנים מקודדים חלבונים.

CAPRRESI: כימרה האסיפה על ידי פלסמיד השחזור והגבלת אנזים האתר הכנס

הזיהוי של האינטראקציות פיזי בין גנים לבין אלמנטים התקינה הוא מאתגר אבל כבר בהנחייתם של כרומוזום קונפורמציה ללכידת שיטות. שינוי זה בפרוטוקול 4C-seq מפחית את הסיכון של ה-PCR הטיה על-ידי צמצום יתר הגברה של תבניות ה-PCR ומגדיל את mappability את הקריאות על-ידי שילוב צעד תקציר של אנזים הגבלה תוספת.

זיהוי תפוקה גבוהה של ג'ין רצפים תקינה באמצעות רצף הדור הבא של כרומוזום מעגלי קונפורמציה ללכוד (4C-seq)

אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור עיצוב, הדמיה, רטוב-מעבדת ניסויים וניתוח עבור מתלה reconfigurable של אקורדיון הדנ א של 6 על ידי 6 רשתות.

עיצוב, סינתזה של ארון אקורדיון דנ א Reconfigurable

כאן, אנו מציגים מחרוזת הרכבה gRNA שיבוט (STAgR), שיטה בקלות מגה-פלקס gRNA וקטורים עבור גישות CRISPR/Cas9. STAgR הופך gRNA ריבוב פשוטה ויעילה, הניתנים להתאמה אישית.

פרוטוקול ניתן להתאמה אישית עבור מחרוזת הרכבה gRNA שיבוט (STAgR)

מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט עבור T4 מצדו ולטיהור denaturing דף קטן מולקולות DNA מעגלי, חישול, ניתוח דף מקורית של אריחים מעגלית, בהרכבת AFM הדמיה של nanostructures ה-DNA 1 י ו- 2D, כמו גם agarose ג'ל אלקטרופורזה וטיהור צנטריפוגה של סופי אן nanostructures.

המוטיבים אן יציב, 1 י ו- 2D Nanostructures בנוי מולקולות DNA מעגלי קטן

כאן אנו מציגים בפירוט התאמה של טכניקת לכידת קונפורמציית הכרומוזומים (3C) עם דגש על מעורבות ולמידה לתואר ראשון.

קבלת A עם 3Cs: לכידת קונפורמציה כרומוזומים לסטודנטים לתואר ראשון

מאמר זה מציג פרוטוקול צעד-אחר-צעד המדגים כיצד ניתן להתאים שיבוט מודולרי (MoClo) לשיבוט של אופרון פוליציסטרוני.

הרכבה מודולרית סטנדרטית של אופרון פוליציסטרוני עם שיבוט מודולרי (MoClo) באמצעות ערכת הכלים In-Cloning

אנו מתארים פרוטוקול לשיטת שיבוט בתפוקה גבוהה, שיבוט מעבורת מבוסס CRISPR (שיבוט CRISPRshuttle), המאפשר העברת מקטעי DNA מעניינים בין וקטורים ללא צורך בהגברת PCR של שברי ה-DNA.

שיבוט מעבורות מבוסס CRISPR: שיטת שיבוט בתפוקה גבוהה

למדו את שיטת ההרכבה C-Brick באמצעות חלבון Cpf1 ליצירת מעגלים גנטיים מורכבים בביולוגיה סינתטית. פרוטוקול זה מאפשר הרכבה איטרטיבית ובלתי תלויה ברצף של DNA.

פרוטוקולים עבור C- לבנים DNA הרכבה רגילה באמצעות Cpf1

גלה סרטונים נוספים