פרוטוקולים עבור C- לבנים DNA הרכבה רגילה באמצעות Cpf1

הסרטונים הבאים מפרטים נוהל לשימוש בתקן C-Brick להרכבת חלקי DNA באמצעות חלבון הקשור ל-CRISPR, Cpf1. שיטה זו יכולה לקדם את פיתוח הרכבת ה-DNA בתחום הביולוגיה הסינתטית. כגון על ידי הקלה על בניית מעגלים גנטיים מסובכים.

היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא בלתי תלויה ברצף ומאפשרת הרכבה איטרטיבית של מבני DNA. הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר שמנו לב ש-Cpf1 מונחה על ידי siRNA יחיד ו-DNA קטליטי שנערם. לכן, יצירת DKNs.

מי שתדגים את ההליך תהיה שי-יואן לי, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי לתקן את תבניות ה-crRNA, השעו מחדש את האוליגונוקלאוטידים הבודדים במים נטולי RNase לריכוז של 10 מיקרומולר. לצינור PCR של 0.2 מיליליטר, הוסף אוליגונוקלאוטיד גדיל עליון, אוליגונוקלאוטיד גדיל תחתון ומאגר חישול פי 10 כמפורט במסמך הנלווה.

ודא שהנפח הכולל הוא 50 מיקרוליטר. טבלה זו מציגה שישה אוליגונוקלאוטידים שונים של גדיל תחתון, שכל אחד מהם צריך להיות מזווג בנפרד עם הגדיל העליון, T7-F. האותיות הקטנות מייצגות את הרצף שיש לתמלל לרצף המנחה של crRNA.

הנח את צינור ה-PCR לתוך תרמו-סייקלר הפעל את תוכנית החישול עם דניטרציה ראשונית ב-95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, ולאחר מכן התקרר מ-95 עד 20 מעלות צלזיוס עם ירידה של מעלה אחת צלזיוס לדקה. לאחר החישול, בצע מיד את השעתוק על ידי שילוב המוצר המחושל עם מים ללא RNase, מאגר שעתוק T-7, תערובת NTP, מעכב RNase רקומביננטי ו-T-7 RNase פולימראז בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.

דגרו את התגובה באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, השתמש בערכת ניקוי וריכוז RNA כדי לטהר את ה-RNA המתועתק. השתמש בספקטרופוטומטר UV-Vis כדי לכמת את ה-RNA.

לאחר מכן, יש לדלל את ה-RNA לריכוז של 10 מיקרו-מולר. אם לא משתמשים בדגימות באופן מיידי, אחסן אותן בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס. בניית חלקי C-Brick יכולה להתבצע במספר שיטות.

בחלק זה של הסרטון, שלוש קלטות כרומופרוטאין, cjBlue, eforRed ו-amilGFP יורכבו בשיטת ההרכבה החלקה. התחל בתכנון והזמנת האוליגונוקלאוטידים להגברת PCR של קלטות הכרומופרוטאין. כאשר האוליגונוקלאוטידים מגיעים, השעו אותם מחדש במים טהורים במיוחד לריכוז של 10 מיקרומולר.

לאחר מכן, כדי להגדיר את תגובות ה-PCR, הנח צינורות PCR של 0.2 מיליליטר על קרח. הוסף מים טהורים במיוחד, שני מאגר XPCR, DNTPs, פריימרים קדימה ואחורה, תבנית כרומופרוטאין ופולימראז DNA בנאמנות גבוהה. הנח את הצינורות ישירות לתוך התרמו-סייקלר והפעל את התוכנית.

השתמש מיד בדגימות או הקפיא ואחסן אותן בחום של 20 מעלות צלזיוס. לאחר ההגברה, יש לטהר את מוצרי ה-PCR באמצעות ערכה. לאחר מכן, כדי לעכל את הווקטור הסטנדרטי של C-Brick עם BamH1, הוסף מים טהורים במיוחד, פלסמיד, מאגר פי 10 ו-BamH1 לשפופרת.

דגירה עד שעתיים בחום של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. טהר את הווקטור הליניארי באמצעות ערכת ניקוי ג'ל. לאחר הניקוי, שלב וקטור ליניארי, מוצר PCR, מאגר הרכבה חלק פי 5 ואנזים הרכבה חלק מערכת הרכבה חלקה בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.

ודא שהנפח הכולל הוא 10 מיקרוליטר. מניחים את זה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר הדגירה יש להשתמש בדגימות מיד או להקפיא אותן על קרח ולאחסן אותן בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס.

ל -90 מיקרוליטר של אי קולי DH10B, הוסף 10 מיקרוליטר מהמבנה. בצע טרנספורמציה כימית. לאחר מכן, מורחים את התאים שעברו טרנספורמציה על צלחת LB, ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

למחרת, בחרו כמה שיבוטים לתרבית בצינורות LB נוזליים של חמישה מיליליטר ודגרו אותם ב-37 מעלות צלזיוס על שייקר ב-220 סל"ד למשך הלילה. חלץ את הפלסמיד באמצעות ערכת הכנת פלסמיד. לאחר מכן, זהה את השיבוטים הנכונים על ידי ריצוף סנגר.

דע כי בניית נתיבי C-Brick יכולה להתבצע גם על ידי יישום PCI תגובתי, או על ידי הגבלה בעיכול המיידי של מדיום T4 DNA ligase לקשירה. לאחר מכן, כדי לעכל את וקטור ה-C-Brick עם Cpf1, שלב מים ללא RNase, מאגר Cpf1 פי 10, הפלסמיד, מעכב RNase רקומביננטי ו-Cpf1 בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. כדי להכניס שבר DNA זר לאתרי T1 ו-T2, הוסף מיקרוליטר אחד של crRNA T2, ודגר את הצינור באמבט מים ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

לאחר מכן, שומרים את הצינור באמבט המים, מוסיפים מיקרוליטר אחד של crRNA T1, מיקרוליטר אחד של Cpf1 ודוגרים למשך 30 דקות נוספות. ה-crRNA T2 מתווסף ראשון, מכיוון ששני אתרי הזיהוי קרובים יותר על ה-DNA הווקטורי. קשירת Cpf1 באתר T1 עשויה להשפיע על תשתית אתר T2.

כמו כן, אם אתר T2 היה מחליף את אתר T2, אתר T2 היה מופרע אם ה-crRNA T1 היה מתווסף קודם. הוסף מיקרוליטר אחד של פוספטאז אלקליין רגיש לחום ודגר את הצינור באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה נוספת. בצע אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז וטהר את הווקטור באמצעות ערכת מערכת ניקוי ג'ל.

השתמש מיד בדגימות או הקפיא ואחסן אותן בחום של 20 מעלות צלזיוס. כדי לעכל את שבר ה-DNA המעניין עם Cpf1, שלב מים ללא RNase, מאגר 10x Cpf1, פלסמיד, מעכב RNase רקומביננטי ו-Cpf1 בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. כדי להכניס שבר DNA זר לאתרי T1 ו-T2, הוסף מיקרוליטר אחד של crRNA T1 ומיקרוליטר אחד של crRNA T3 לצינור ודגר אותו באמבט מים ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.

לאחר הדגירה יש לבצע אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז ולטהר את השבר באמצעות ערכת ניקוי ג'ל. השתמש מיד בדגימות או הקפיא ואחסן אותן בחום של 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, כדי לקשר את שבר ה-DNA הזר בווקטור C-Brick, שלב את הווקטור הליניארי ואת שבר ה-DNA בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.

הוסף 10x T4 DNA Ligase Buffer ו-T4 DNA Ligase. לאחר מכן, דגרו במשך שעתיים בחום של 22 מעלות צלזיוס. השתמש מיד בדגימות או הקפיא ואחסן אותן בחום של 20 מעלות צלזיוס.

הוסף 10 מיקרוליטר מתוצרי הקשירה לתאים המוסמכים e coli DH10B, ובצע טרנספורמציה כימית. לאחר מכן, מורחים את האי קולי שעבר טרנספורמציה על צלחות LB, ודוגרים אותם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. למחרת, הוסף מספר שיבוטים לצינורות LB נוזליים של 5 מיליליטר ודגר אותם למשך הלילה על שייקר ב-220 סל"ד ו-37 מעלות צלזיוס.

חלץ את הפלסמיד באמצעות ערכת הכנת פלסמיד. לאחר מכן, זהה את השיבוטים הנכונים על ידי ריצוף סנגר. בצע סיבוב חדש של הרכבת C-Brick.

באמצעות הדגימה, מה שנקרא שיבוטי סדק יכולים לשמש כווקטור C-Brick חדש או חתיכת DNA להרכבה איטרטיבית נוספת של C-Brick. שלוש קלטות כרומופרוטאין, cjBlue, eforRed ו-amilGFP, הורכבו כמתואר בסרטון זה. שלושה כרומופרוטאינים באו לידי ביטוי באי קולי שגדל בצלחת.

חיידקי בקרה שליליים, ללא כרומופרוטאינים, מוצגים בלוח הרביעי. לאחר מכן, שתי קלטות ביטוי צבע הורכבו עוד יותר עם תקן C-Brick כדי ליצור צבעים נוספים. שלושה כרומופרוטאינים ושלושה כרומופרוטאינים כפולים מורכבים באו לידי ביטוי באי קולי שגדל במדיום LB נוזלי.

מאחד עד שש, המבנים המבוטאים הם eforRed, אחד, amilGFP, שתיים, cjBlue, שלוש, amilGFP פלוס eforRed, ארבע, eforRed פלוס cjBlue, חמש, ו-amilGFP פלוס cjBlue, שש. החיידקים הצבעוניים על צלחת אחת, או בצינור מיקרו-צנטריפוגה יחיד, תורבבו משיבוט מאומת ברצף יחיד. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שבוע, אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שכל החומרים צריכים להיות נטולי RNase, להכנת siRNA וניקוי Cpf1. אני עדיין ממליץ, טקטיקה זו סייעה כדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה הסינתטית לבנות חלון ראווה גנטי של מסלולים מטבוליים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להרכיב נתיב DNA באמצעות תקן C-Brick.