Name: פרוטוקולים עבור C- לבנים DNA הרכבה רגילה באמצעות Cpf1 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: למדו את שיטת ההרכבה C-Brick באמצעות חלבון Cpf1 ליצירת מעגלים גנטיים מורכבים בביולוגיה סינתטית. פרוטוקול זה מאפשר הרכבה איטרטיבית ובלתי תלויה ברצף של DNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים שנחאי טולו ביוטק על סיוע טכני שלהם במהלך הפיתוח של תקן C לבנים. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי תוכנית עדיפות אסטרטגית מחקר של האקדמיה הסינית למדעים (מענק מס &#39;XDB19040200).

<ol><li>Canton, B., Labno, A., Endy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refinement+and+standardization+of+synthetic+biological+parts+and+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Refinement and standardization of synthetic biological parts and devices.</a> Nat Biotechnol. 26 (7), 787-793 (2008).</li>
<li>Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+BioBrick+vectors+from+BioBrick+parts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Eng%22%5BJournal%5D)">Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts.</a> J Biol Eng. 2, (2008).</li>
<li>Knight, T. <a target="_blank" href="https://dspace.mit.edu/handle/1721.1/21168">Idempotent Vector Design for Standard Assembly of Biobricks</a>. , MIT Artificial Intelligence Laboratory; MIT Synthetic Biology Working Group. 1-11 (2003).</li>
<li>Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-Brick%3A+A+New+Standard+for+Assembly+of+Biological+Parts+Using+Cpf1%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">C-Brick: A New Standard for Assembly of Biological Parts Using Cpf1.</a> ACS Synth Biol. 5 (12), 1383-1388 (2016).</li>
<li>Anderson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BglBricks%3A+A+flexible+standard+for+biological+part+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Eng%22%5BJournal%5D)">BglBricks: A flexible standard for biological part assembly.</a> J Biol Eng. 4 (1), (2010).</li>
<li>Liu, J. K., Chen, W. H., Ren, S. X., Zhao, G. P., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iBrick%3A+a+new+standard+for+iterative+assembly+of+biological+parts+with+homing+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">iBrick: a new standard for iterative assembly of biological parts with homing endonucleases.</a> PLoS One. 9 (10), e110852(2014).</li>
<li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).</li>
<li>Wright, A. V., Nunez, J. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+and+Applications+of+CRISPR+Systems%3A+Harnessing+Nature%27s+Toolbox+for+Genome+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Biology and Applications of CRISPR Systems: Harnessing Nature's Toolbox for Genome Engineering.</a> Cell. 164 (1-2), 29-44 (2016).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li>
<li>Shanghai Tolo Biotechnology Company Limited. , Shanghai 200233, China. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.tolobio.com/">http://www.tolobio.com/</a> (2017).</li>
<li>Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one+pot%2C+one+step%2C+precision+cloning+method%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A one pot, one step, precision cloning method.</a> PLoS One. 3 (11), e3647(2008).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Casini, A., Storch, M., Baldwin, G. S., Ellis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bricks+and+blueprints%3A+methods+and+standards+for+DNA+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bricks and blueprints: methods and standards for DNA assembly.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 568-576 (2015).</li>
<li>Cameron, D. E., Bashor, C. J., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+history+of+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A brief history of synthetic biology.</a> Nat Rev Microbiol. 12 (5), 381-390 (2014).</li>
<li>Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biology+for+synthetic+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic biology for synthetic chemistry.</a> ACS Chem Biol. 3 (1), 64-76 (2008).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

פרוטוקול זה מתאר הליך עבור תקן ה- DNA הרכבה C-Brick. השלב החשוב ביותר בפרוטוקול זה הוא לינאריזציה של וקטור סטנדרטי לבנים; מחסור שלם של וקטור יכול להשפיע על שיעור ההצלחה. בנוסף, למרות Cpf1 בעיקר cleaves היעד רצפי DNA דפוס &quot;18-23&quot; מחשוף, מחשוף מדויק ליד שני בסיסים התגלה גם 4 , אשר יכול לגרום למספר קטן של מוטציות לאחר הרכבה דנ&quot;א. לכן, רצף סנגר יש צורך לאמת את המבנה התאספו. היעי...

סטנדרטיזציה של חלקים ביולוגיים DNA חשוב לפיתוח של ביולוגיה סינתטית 1 . פיתוח של תהליך הרכבה דנ&quot;א יכול להחליף עיצובים ניסיוניים אד הוק ולהסיר רבים של תוצאות בלתי צפויות המתעוררות במהלך הרכבה של רכיבים גנטיים לתוך מערכות גדולות. תקן ה- BioBrick (BBF RFC 10) היה אחד התקני ה- DNA הראשונים שהוצעו. הוא משתמש ברצף קידומת (המכיל EcoRI ו XBAI חיתוך אתרים) ואת רצף הסיומת (המכיל Spei ו PSTI חיתוך אתרים) 2 , 3 . כי XbaI ו SpeI יש משלים מלוכדת משלימים, BioBrick חלקים DNA שנחתכים עם XbaI ו SpeI ניתן לחבר יחד, יצירת BioBrick חדש להרכבה איטרטיבי נוסף. פגמים מסוימים זוהו עם השימוש של תקן BioBrick 4 . לדוגמה, הוא מייצר צלקת 8-bpבין חלקי ה- DNA, אשר אינו מאפשר בניית חלבונים בתוך היתוך. חוץ מזה, ארבעה סוגי הנ&quot;ל של אתרים 6-bp הגבלה יש להסיר את החלקים DNA, וזה מאוד לא נוח. תקן BglBrick הוקמה כדי לפתור את הבעיה הראשונה 5 . זה יוצר 6 &quot;BP&quot; GGATCT &quot;צלקת, לייצר Gly-Ser ומאפשר היתוך של חלבונים מרובים או תחומים חלבון. IBrick פותחה כדי להתמודד עם הבעיה השנייה 6 . היא משתמשת endonucleases ביתית (HE) כי לזהות רצפים דנ&quot;א ארוך. כמו אתרי זיהוי HE לעתים רחוקות קיימים רצפי DNA טבעי, תקן iBrick ניתן להשתמש לבנייה ישירה של חלקים iBrick ללא שינוי רצפי DNA שלהם. עם זאת, תקן iBrick משאיר צלקת bp 21 בין חלקי ה- DNA, אשר עשוי להיות הסיבה הפופולריות שלה. בשנים האחרונות, מקובצים באופן קבוע חוזרים interinded קצר palindromic (CRISיחסי ציבור) מערכת פיתחה במהירות 7 , 8 . בין CRISPR הקשורים (חלבונים) Cas, CAS9 endonuclease מ streptococcus pyogenes כיום בשימוש נרחב. זה בעיקר מציג הפסקות דנ&quot;א כפול תקועים (DSBs) עם הקצוות קהה 9 . בשנת 2015, ג &#39;אנג ו coworkers מאופיינים Cpf1 (CRISPR מ Prevotella ו Francisella 1) בפעם הראשונה. זה שייך בכיתה 2 סוג CRISPR-Cas המערכת היא CRNARNA CRNA (CRRNA) מונחה endonuclease 10 . שלא כמו Cas9, Cpf1 מציג DSB עם 4 או 5 nt 5 &#39;overhang 10 . בהתבסס על מאפיין זה, Cpf1 שימש לפיתוח תקן הרכבה דנ&quot;א, C-Brick 4 . על וקטור סטנדרטי בריק C, ארבעה Cpf1 אתרי היעד של T1 / T2 קידומת ו סיומות T3 / T4 צדי החלקים הביולוגיים; זה דומה תקן BioBrick. כמו מחשוף של T2 ו T3 אתרים עמ &#39;מייצרת קצוות דביקים משלימים, ניתן לבצע את הרכבה האיטרטיבית של חלקי ה- DNA תוך יצירת צלקת &quot;GGATCC&quot; בין החלקים. יש לציין, תקן C-Brick יש שני יתרונות עיקריים: זיהוי רצפים יעד ארוך לעזוב צלקות קצרות. 6 &quot;BP&quot; צלקת &quot;GGATCC&quot; שנוצר על ידי C- לבנים מקודד Gly-Ser, אשר מאפשר את בניית חלבונים היתוך. יתר על כן, תקן C- לבנים הוא גם תואם חלקית עם BglBrick ו BioBrick סטנדרטים.

<table><tbody><tr><td>Comercial Oligonucleotide</td><td>Sangon Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x Taq PCR Buffer</td><td>Transgen</td><td>#J40928</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Pure Dispected</td><td>Water Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>5x RNA Transcription Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0441</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA פולימראז</td><td>Thermo Scientific</td><td>#EP0111</td><td></td></tr><tr><td>תערובת NTP</td><td>סנגון</td><td>#ND0056</td><td></td></tr><tr><td>RRI (מעכב RNase רקומביננטי)</td><td>Takara</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>RNA נקי & רכז-5</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis ספקטרומטר</td><td>תרמו מדעי</td><td>ננו-טיפה 2000c</td><td></td></tr><tr><td>2x מאגר פנטה מקס</td><td>Vazyme</td><td>PB505</td><td>PCR מאגר</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Transgen</td><td>AD101</td><td></td></tr><tr><td>Phanta Max סופר-נאמנות DNA פולימראז</td><td>Vazyme</td><td>P505-d1</td><td></td></tr><tr><td>Ezmax לשיבוט טולוביו בשלב אחד</td><td></td><td>24303-1</td><td>ערכת הרכבה חלקה</td></tr><tr><td>5x מאגר לשיבוט Ezmax שלב אחד</td><td>Tolobio</td><td>32006</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>#R0136L</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>NEB</td><td>#R3136L</td><td></td></tr><tr><td>BglII&nbsp;</td><td>NEB</td><td>#R0144L</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td>#R0145L</td><td></td></tr><tr><td>SpeI</td><td>NEB</td><td>#R3133L</td><td></td></tr><tr><td>10x מאגר 3</td><td>NEB</td><td>#B7003S</td><td></td></tr><tr><td>10x CutSmart Buffer</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 DNA ligase Buffer</td><td>Tolobio</td><td>32002</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>Tolobio</td><td>32206</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>Tolobio</td><td>32210</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>NEB</td><td>#R01762</td><td></td></tr><tr><td>SV ג'ל ומערכת ניקוי PCR</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>פלסמיד מיני ערכת</td> I <td>אומגה</td><td>D6943-02</td><td>ערכת הכנת פלסמיד</td></tr><tr><td>פוספטאז אלקליין רגיש לחום&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>#EF0651</td><td>FastAP</td></tr><tr><td>10x Cpf1 buffer</td><td>Tolobio</td><td>32008</td><td></td></tr><tr><td>Cpf1</td><td>Tolobio</td><td>32105</td><td>FnCpf1</td></tr><tr><td>thermocycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>veriti 96 well</td><td></td></tr><tr><td>C-Brick וקטור סטנדרטי</td><td>Tolobio</td><td>98101</td><td></td></tr><tr><td>E. coli [DH10B]</td> <td>Invitrogen</td><td>18297010</td><td></td></tr><tr><td>מדיה לוריא-ברטנית (טריפטון)</td><td>אוקסואיד</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>מדיה לוריא-ברטאני (תמצית שמרים)</td><td>אוקסואיד</td><td>LP0021</td><td></td></tr><tr><td>מדיה לוריא-ברטני (NaCl)</td><td>סנגון ביוטק</td><td>B126BA0007</td><td></td></tr></tbody></table>

פרוטוקולים עבור c- לבנים dna הרכבה רגילה באמצעות cpf1

Protocols for C-Brick DNA Standard Assembly Using Cpf1

CRISPR הקשורים חלבון Cpf1 cleaves פעמיים תקועים DNA תחת הדרכת CRISPR רנ&quot;א (crRNA), יצירת הקצוות דביקים. בגלל זה מאפיין, Cpf1 שימש להקמת תקן הרכבה דנ&quot;א בשם C-Brick, אשר יש את היתרון של אתרי הכרה ארוכה צלקות קצרות. על וקטור C- לבנים רגיל, ישנם ארבעה אתרי זיהוי Cpf1 - קידומת (T1 ו T2 אתרים) ואת הסיומת (T3 ו T4 אתרים) - צף חלקים DNA ביולוגי. המחשוף של אתרי T2 ו- T3 מייצר קצוות דביקים משלימים, המאפשרים הרכבה של חלקי DNA עם אתרי T2 ו- T3. בינתיים, צלקת קצרה &quot;GGATCC&quot; נוצר בין חלקים לאחר הרכבה. כמו פלסמיד החדש שנוצר שוב מכיל את ארבעת אתרי Cpf1 מחשוף, השיטה מאפשרת הרכבה איטרטיבי של חלקי ה- DNA, אשר דומה לאלה של תקנים BioBrick ו BglBrick. הליך המתאר את השימוש בתקן C-Brick להרכבת חלקי DNAמתואר כאן. תקן C-Brick יכול להיות בשימוש נרחב על ידי מדענים, בוגר סטודנטים לתואר ראשון, ואפילו חובבים.

<html> פרוטוקול זה הוכיח את הרכבה של שלוש קלטות chromoprotein (cjBlue (BBa_K592011), eforRed (BBa_K592012), ו amilGFP (BBa_K592010)). ראשית, רצפי ההקלדה של שלושת הגנים והטרמינלים הנ&quot;ל הושככו בנפרד לתוך וקטור סטנדרטי של C-Brick. חלקים דנ&quot;א קצר, האמרגן ואת הטרמינטור, הוכנסו לתוך וקטור C- לבנים באמצעות הגברה PCR באמצעות primers המכילים את חלקי ה- DNA קצר על מסוף 5 &#39;. זה היה ואחריו שיטת קשירת עצמי. שלושה רצפים chromoprotein קידוד היו הראשו...

CRISPR הקשורים חלבון Cpf1 יכול להיות מונחה על ידי CRNA RNA (CRRNA) שתוכנן במיוחד כדי לדבוק DNA כפול תקועים באתרים הרצוי, יצירת הקצוות דביקים. בהתבסס על מאפיין זה, תקן DNA הרכבה (C-Brick) הוקמה, ופרוטוקול המפרט את השימוש שלה מתואר כאן.

פרוטוקולים עבור C- לבנים DNA הרכבה רגילה באמצעות Cpf1

CRISPR-associated protein Cpf1 cleaves double-stranded DNA under the guidance of CRISPR RNA (crRNA), generating sticky ends. Because of this ...

הסרטונים הבאים מפרטים נוהל לשימוש בתקן C-Brick להרכבת חלקי DNA באמצעות חלבון הקשור ל-CRISPR, Cpf1. שיטה זו יכולה לקדם את פיתוח הרכבת ה-DNA בתחום הביולוגיה הסינתטית. כגון על ידי הקלה על בניית מעגלים גנטיים מסובכים.היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא בלתי תלויה ברצף ומאפשרת הרכבה איטרטיבית של מבני DNA. הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר שמנו לב ש-Cpf1 מונחה על ידי siRNA יחיד ו-DNA קטליטי שנערם. לכן, יצירת DKNs.מי שתדגים את ההליך תהיה שי-יואן לי, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי לתקן את תבניות ה-crRNA, השעו מחדש את האוליגונוקלאוטידים הבודדים במים נטולי RNase לריכוז של 10 מיקרומולר. לצינור PCR של 0.2 מיליליטר, הוסף אוליגונוקלאוטיד גדיל עליון, אוליגונוקלאוטיד גדיל תחתון ומאגר חישול פי 10 כמפורט במסמך הנלווה.ודא שהנפח הכולל הוא 50 מיקרוליטר. טבלה זו מציגה שישה אוליגונוקלאוטידים שונים של גדיל תחתון, שכל אחד מהם צריך להיות מזווג בנפרד עם הגדיל העליון, T7-F. האותיות הקטנות מייצגות את הרצף שיש לתמלל לרצף המנחה של crRNA.הנח את צינור ה-PCR לתוך תרמו-סייקלר הפעל את תוכנית החישול עם דניטרציה ראשונית ב-95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, ולאחר מכן התקרר מ-95 עד 20 מעלות צלזיוס עם ירידה של מעלה אחת צלזיוס לדקה. לאחר החישול, בצע מיד את השעתוק על ידי שילוב המוצר המחושל עם מים ללא RNase, מאגר שעתוק T-7, תערובת NTP, מעכב RNase רקומביננטי ו-T-7 RNase פולימראז בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.דגרו את התגובה באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, השתמש בערכת ניקוי וריכוז RNA כדי לטהר את ה-RNA המתועתק. השתמש בספקטרופוטומטר UV-Vis כדי לכמת את ה-RNA.לאחר מכן, יש לדלל את ה-RNA לריכוז של 10 מיקרו-מולר. אם לא משתמשים בדגימות באופן מיידי, אחסן אותן בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס. בניית חלקי C-Brick יכולה להתבצע במספר שיטות.בחלק זה של הסרטון, שלוש קלטות כרומופרוטאין, cjBlue, eforRed ו-amilGFP יורכבו בשיטת ההרכבה החלקה. התחל בתכנון והזמנת האוליגונוקלאוטידים להגברת PCR של קלטות הכרומופרוטאין. כאשר האוליגונוקלאוטידים מגיעים, השעו אותם מחדש במים טהורים במיוחד לריכוז של 10 מיקרומולר.לאחר מכן, כדי להגדיר את תגובות ה-PCR, הנח צינורות PCR של 0.2 מיליליטר על קרח. הוסף מים טהורים במיוחד, שני מאגר XPCR, DNTPs, פריימרים קדימה ואחורה, תבנית כרומופרוטאין ופולימראז DNA בנאמנות גבוהה. הנח את הצינורות ישירות לתוך התרמו-סייקלר והפעל את התוכנית.השתמש מיד בדגימות או הקפיא ואחסן אותן בחום של 20 מעלות צלזיוס. לאחר ההגברה, יש לטהר את מוצרי ה-PCR באמצעות ערכה. לאחר מכן, כדי לעכל את הווקטור הסטנדרטי של C-Brick עם BamH1, הוסף מים טהורים במיוחד, פלסמיד, מאגר פי 10 ו-BamH1 לשפופרת.דגירה עד שעתיים בחום של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. טהר את הווקטור הליניארי באמצעות ערכת ניקוי ג'ל. לאחר הניקוי, שלב וקטור ליניארי, מוצר PCR, מאגר הרכבה חלק פי 5 ואנזים הרכבה חלק מערכת הרכבה חלקה בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.ודא שהנפח הכולל הוא 10 מיקרוליטר. מניחים את זה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר הדגירה יש להשתמש בדגימות מיד או להקפיא אותן על קרח ולאחסן אותן בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס.ל -90 מיקרוליטר של אי קולי DH10B, הוסף 10 מיקרוליטר מהמבנה. בצע טרנספורמציה כימית. לאחר מכן, מורחים את התאים שעברו טרנספורמציה על צלחת LB, ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.למחרת, בחרו כמה שיבוטים לתרבית בצינורות LB נוזליים של חמישה מיליליטר ודגרו אותם ב-37 מעלות צלזיוס על שייקר ב-220 סל"ד למשך הלילה. חלץ את הפלסמיד באמצעות ערכת הכנת פלסמיד. לאחר מכן, זהה את השיבוטים הנכונים על ידי ריצוף סנגר.דע כי בניית נתיבי C-Brick יכולה להתבצע גם על ידי יישום PCI תגובתי, או על ידי הגבלה בעיכול המיידי של מדיום T4 DNA ligase לקשירה. לאחר מכן, כדי לעכל את וקטור ה-C-Brick עם Cpf1, שלב מים ללא RNase, מאגר Cpf1 פי 10, הפלסמיד, מעכב RNase רקומביננטי ו-Cpf1 בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. כדי להכניס שבר DNA זר לאתרי T1 ו-T2, הוסף מיקרוליטר אחד של crRNA T2, ודגר את הצינור באמבט מים ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.לאחר מכן, שומרים את הצינור באמבט המים, מוסיפים מיקרוליטר אחד של crRNA T1, מיקרוליטר אחד של Cpf1 ודוגרים למשך 30 דקות נוספות. ה-crRNA T2 מתווסף ראשון, מכיוון ששני אתרי הזיהוי קרובים יותר על ה-DNA הווקטורי. קשירת Cpf1 באתר T1 עשויה להשפיע על תשתית אתר T2.כמו כן, אם אתר T2 היה מחליף את אתר T2, אתר T2 היה מופרע אם ה-crRNA T1 היה מתווסף קודם. הוסף מיקרוליטר אחד של פוספטאז אלקליין רגיש לחום ודגר את הצינור באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה נוספת. בצע אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז וטהר את הווקטור באמצעות ערכת מערכת ניקוי ג'ל.השתמש מיד בדגימות או הקפיא ואחסן אותן בחום של 20 מעלות צלזיוס. כדי לעכל את שבר ה-DNA המעניין עם Cpf1, שלב מים ללא RNase, מאגר 10x Cpf1, פלסמיד, מעכב RNase רקומביננטי ו-Cpf1 בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. כדי להכניס שבר DNA זר לאתרי T1 ו-T2, הוסף מיקרוליטר אחד של crRNA T1 ומיקרוליטר אחד של crRNA T3 לצינור ודגר אותו באמבט מים ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.לאחר הדגירה יש לבצע אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז ולטהר את השבר באמצעות ערכת ניקוי ג'ל. השתמש מיד בדגימות או הקפיא ואחסן אותן בחום של 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, כדי לקשר את שבר ה-DNA הזר בווקטור C-Brick, שלב את הווקטור הליניארי ואת שבר ה-DNA בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.הוסף 10x T4 DNA Ligase Buffer ו-T4 DNA Ligase. לאחר מכן, דגרו במשך שעתיים בחום של 22 מעלות צלזיוס. השתמש מיד בדגימות או הקפיא ואחסן אותן בחום של 20 מעלות צלזיוס.הוסף 10 מיקרוליטר מתוצרי הקשירה לתאים המוסמכים e coli DH10B, ובצע טרנספורמציה כימית. לאחר מכן, מורחים את האי קולי שעבר טרנספורמציה על צלחות LB, ודוגרים אותם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. למחרת, הוסף מספר שיבוטים לצינורות LB נוזליים של 5 מיליליטר ודגר אותם למשך הלילה על שייקר ב-220 סל"ד ו-37 מעלות צלזיוס.חלץ את הפלסמיד באמצעות ערכת הכנת פלסמיד. לאחר מכן, זהה את השיבוטים הנכונים על ידי ריצוף סנגר. בצע סיבוב חדש של הרכבת C-Brick.באמצעות הדגימה, מה שנקרא שיבוטי סדק יכולים לשמש כווקטור C-Brick חדש או חתיכת DNA להרכבה איטרטיבית נוספת של C-Brick. שלוש קלטות כרומופרוטאין, cjBlue, eforRed ו-amilGFP, הורכבו כמתואר בסרטון זה. שלושה כרומופרוטאינים באו לידי ביטוי באי קולי שגדל בצלחת.חיידקי בקרה שליליים, ללא כרומופרוטאינים, מוצגים בלוח הרביעי. לאחר מכן, שתי קלטות ביטוי צבע הורכבו עוד יותר עם תקן C-Brick כדי ליצור צבעים נוספים. שלושה כרומופרוטאינים ושלושה כרומופרוטאינים כפולים מורכבים באו לידי ביטוי באי קולי שגדל במדיום LB נוזלי.מאחד עד שש, המבנים המבוטאים הם eforRed, אחד, amilGFP, שתיים, cjBlue, שלוש, amilGFP פלוס eforRed, ארבע, eforRed פלוס cjBlue, חמש, ו-amilGFP פלוס cjBlue, שש. החיידקים הצבעוניים על צלחת אחת, או בצינור מיקרו-צנטריפוגה יחיד, תורבבו משיבוט מאומת ברצף יחיד. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שבוע, אם היא מבוצעת כראוי.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שכל החומרים צריכים להיות נטולי RNase, להכנת siRNA וניקוי Cpf1. אני עדיין ממליץ, טקטיקה זו סייעה כדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה הסינתטית לבנות חלון ראווה גנטי של מסלולים מטבוליים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להרכיב נתיב DNA באמצעות תקן C-Brick.

protocols-for-c-brick-dna-standard-assembly-using-cpf1

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

אוטומטי קיימא ויסות מערכת חיידקים לטיפול של זיהומי נפט תוכנן באמצעות חלקי DNA החלפה סטנדרטיים (BioBricks).

Toolkit כדי לאפשר גיור פחמימן בסביבות מימיות

הומולוגי רקומבינציה טכניקות מאוד...

Recombineering הומולוגי רקומבינציה בבונה<em&gt; דרוזופילה</em

סינתזה של פלסמידים מותאמים אישית גוזלת עבודה וזמן. פרוטוקול זה מתאר את השימוש בשיבוט הרכבה של גיבסון כדי להפחית את העבודה ומשך הליך שיבוט ה-DNA המותאם אישית. הפרוטוקול המתואר מייצר גם מבני חלבון מתויגים אמינים לביטוי יונקים בעלות דומה לשיבוט ה-DNA המסורתי של גזירה והדבקה.

דור של פלסמיד וקטורים לבטא חלבונים מתויג FLAG על פי תקנות ההסדרה של יזם אדם התארכות Factor-1α שימוש גיבסון עצרת

כאן, אנו מציגים כימרה הרכבה על ידי התאוששות פלסמיד והגבלת אנזים האתר הכניסה (CAPRRESI), פרוטוקול המבוסס על החדרת אתרי אנזים הגבלה לתוך רצפי DNA נרדף התאוששות פלסמיד פונקציונלי. פרוטוקול זה הוא שיטה מהירה בעלות נמוכה עבור מיזוג גנים מקודדים חלבונים.

CAPRRESI: כימרה האסיפה על ידי פלסמיד השחזור והגבלת אנזים האתר הכנס

הזיהוי של האינטראקציות פיזי בין גנים לבין אלמנטים התקינה הוא מאתגר אבל כבר בהנחייתם של כרומוזום קונפורמציה ללכידת שיטות. שינוי זה בפרוטוקול 4C-seq מפחית את הסיכון של ה-PCR הטיה על-ידי צמצום יתר הגברה של תבניות ה-PCR ומגדיל את mappability את הקריאות על-ידי שילוב צעד תקציר של אנזים הגבלה תוספת.

זיהוי תפוקה גבוהה של ג'ין רצפים תקינה באמצעות רצף הדור הבא של כרומוזום מעגלי קונפורמציה ללכוד (4C-seq)

אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור עיצוב, הדמיה, רטוב-מעבדת ניסויים וניתוח עבור מתלה reconfigurable של אקורדיון הדנ א של 6 על ידי 6 רשתות.

עיצוב, סינתזה של ארון אקורדיון דנ א Reconfigurable

כאן, אנו מציגים מחרוזת הרכבה gRNA שיבוט (STAgR), שיטה בקלות מגה-פלקס gRNA וקטורים עבור גישות CRISPR/Cas9. STAgR הופך gRNA ריבוב פשוטה ויעילה, הניתנים להתאמה אישית.

פרוטוקול ניתן להתאמה אישית עבור מחרוזת הרכבה gRNA שיבוט (STAgR)

מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט עבור T4 מצדו ולטיהור denaturing דף קטן מולקולות DNA מעגלי, חישול, ניתוח דף מקורית של אריחים מעגלית, בהרכבת AFM הדמיה של nanostructures ה-DNA 1 י ו- 2D, כמו גם agarose ג'ל אלקטרופורזה וטיהור צנטריפוגה של סופי אן nanostructures.

המוטיבים אן יציב, 1 י ו- 2D Nanostructures בנוי מולקולות DNA מעגלי קטן

כאן אנו מציגים בפירוט התאמה של טכניקת לכידת קונפורמציית הכרומוזומים (3C) עם דגש על מעורבות ולמידה לתואר ראשון.

קבלת A עם 3Cs: לכידת קונפורמציה כרומוזומים לסטודנטים לתואר ראשון

מאמר זה מציג פרוטוקול צעד-אחר-צעד המדגים כיצד ניתן להתאים שיבוט מודולרי (MoClo) לשיבוט של אופרון פוליציסטרוני.

הרכבה מודולרית סטנדרטית של אופרון פוליציסטרוני עם שיבוט מודולרי (MoClo) באמצעות ערכת הכלים In-Cloning

אנו מתארים פרוטוקול לשיטת שיבוט בתפוקה גבוהה, שיבוט מעבורת מבוסס CRISPR (שיבוט CRISPRshuttle), המאפשר העברת מקטעי DNA מעניינים בין וקטורים ללא צורך בהגברת PCR של שברי ה-DNA.

שיבוט מעבורות מבוסס CRISPR: שיטת שיבוט בתפוקה גבוהה

למדו את שיטת ההרכבה C-Brick באמצעות חלבון Cpf1 ליצירת מעגלים גנטיים מורכבים בביולוגיה סינתטית. פרוטוקול זה מאפשר הרכבה איטרטיבית ובלתי תלויה ברצף של DNA.

פרוטוקולים עבור C- לבנים DNA הרכבה רגילה באמצעות Cpf1

גלה סרטונים נוספים