אינטגרציה של מיצוי שלב מוצק ממוזער ו LC-MS / MS איתור של 3-Nitrotyrosine בשתן האדם עבור יישומים קליניים

המטרה הכוללת של מיצוי פאזה מוצק ממוזער זה בשילוב עם בדיקת LC-MS/MS היא לכמת במדויק 3-ניטרוטירוזין חופשי בשתן אנושי ליישומים קליניים. 3-ניטרוטירוזין חופשי מסייע בתפוקות וסמן ביולוגי לעקה חמצונית. עם זאת, זה יישאר אתגר מיוחד לכמת במדויק 3-ניטרוטירוזין במצבי חירום ביולוגיים ליישומים קליניים עקב רגישות לא מספקת, סלקטיביות והכנות דגימות מסורבלות.

טכניקה זו המשלבת מיצוי פאזה מוצק יעיל באינטראקציה רגישה ביותר LC-MS/MS מאפשרת קביעה מהירה, ספציפית ומדויקת של רמות נמוכות של 3-ניטרוטירוזין אנדוגני בשתן אנושי ללא צורך בחוקה ו-LC דו מימדי. ניתן להרחיב את ההשלכות של טכניקה זו לניטור היעילות של טיפול נוגד חמצון מכיוון שניתן להפחית את רמת ה-3-ניטרוטירוזין על ידי נוגדי חמצון. כדי להתחיל בהליך זה, וורטקס הכינה והפשירה בעבר דגימות שתן, תקנים ודגימות QC.

לאחר המערבולת, הוסף 250 מיקרוליטר מכל דגימה ותקן ל-32 בארות של צלחת איסוף נקייה של שני מיליליטר של 96 בארות. הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת עבודה סטנדרטית פנימית שהוכנה בעבר לכל באר למעט באר הדגימה הריקה הכפולה. לאחר מכן הוסף 50 מיקרוליטר מים בדרגת LC-MS עם 0.01% של חומצה פורמית לבאר הדגימה הריקה הכפולה.

לאחר מכן, הוסף לבארות 250 מיקרוליטר מים בדרגת LC-MS עם 0.1% חומצה פורמית. לאחר מכן מערבבים את התמיסות שלוש פעמים עם פיפטה בעלת שמונה ערוצים ומכסים את הצלחת עד לטעינת SPE. לאחר מכן, הנח מיקרופלייט חילופי קטיון במצב מעורב של 96 בארות ומאגר איסוף על מעבד לחץ חיובי.

מיצוי הפאזה המוצקה תוך שימוש במיקרו-פלטת חילופי קטיון במצב מעורב מאפשר ניקוי דגימה בו זמנית והעשרה של 3-ניטרוטירוזין במיצוי יחיד. התנה את צלחת המיצוי על ידי הזרמת 200 מיקרוליטר של מתנול בדרגת LC-MS דרך הספיגה. סובב את כפתור כוונון הלחץ במעבד הלחץ החיובי כדי להגדיר לחץ חיובי נמוך על מנת לאפשר לתערובת לזרום דרך הספיגה לאט, תוך התאמת הלחץ במידת הצורך.

שיווי משקל על ידי הזרמת 200 מיקרוליטר של מים בדרגת LC-MS עם 2% חומצה פורמית דרך הספיגה. בעזרת פיפטה בעלת שמונה ערוצים, טען בזהירות את כל הנפח של כל אחת מהדגימות המעורבבות מראש על צלחת החילוץ המותנית מראש. הגדר לחץ חיובי נמוך על מעבד הלחץ החיובי כדי לאפשר לתערובת לזרום דרך הספיגה לאט, והתאם את הלחץ לפי הצורך.

לאחר מכן, שטפו את הבארות על ידי הזרמת 200 מיקרוליטר של מים בדרגת LC-MS עם 2% חומצה פורמית דרך הספיגה. לאחר שטיפה עם 200 מיקרוליטר מתנול ומים, הגדר את מעבד הלחץ החיובי ללחץ גבוה על מנת לייבש את הבארות. לאחר שהבארות יבשות, החלף את המאגר בצלחת איסוף נקייה של שני מיליליטר של 96 בארות.

כעת, יש למרוח 50 מיקרוליטר של תמיסת אמוניום אצטט של 25 מילי-מולרית כדי לחסל לאט לאט את האנליט השמור ואת התקן הפנימי מלוח החילוץ. לאחר מכן הוסף 50 מיקרוליטר מים בדרגת LC-MS עם 5% חומצה פורמית כדי לנטרל את חומר הניקוי. היישום של תמיסת אמוניום אצטט עדינה לפליטה של 3-ניטרוטירוזין מספק סלקטיביות ורגישות משופרות משמעותיות.

מערבבים את הדגימות עם פיפטה בת שמונה ערוצים שלוש פעמים כהכנה לניתוח ספקטרומטריית מסה טנדם של כרומטוגרפיה נוזלית. לאחר הגדרת מכשיר LC-MS/MS, אזן את שיטת LC-MS/MS 3-ניטרוטירוזין למשך 10 דקות עם שיפוע LC. על ידי איזון השיטה, שיפוע ה-LC יתאזן לפליטת השיפוע הראשונית.

טמפרטורת הדגימה האוטומטית תוגדר לארבע מעלות צלזיוס וטמפרטורת התנור תוגדר ל-30 מעלות צלזיוס. צור רשימת אצווה הכוללת את דגימות השתן, התקנים ודגימות QC. לאחר מכן התחל את האצווה על ידי הזרקת הדגימות המוכנות.

לאחר השלמת כל ההזרקות, קבע עקומה סטנדרטית עם טווח של 10 עד 2, 500 פיקוגרם למיליליטר לכימות 3-ניטרוטירוזין על ידי רגרסיה ליניארית של יחס שטח השיא של 3-ניטרוטירוזין והתקן הפנימי לעומת הריכוז הנומינלי של 3-ניטרוטירוזין. לבסוף, כמת את כל הדגימות האחרות באמצעות העקומה הסטנדרטית שנקבעה וקבע אם דגימות ה-QC נופלות בטווח שנקבע. נתוני LC של דגימות שתן אנושיות מראים כי 3-ניטרוטירוזין מופרד כרומטוגרפית מאנלוגים אחרים של טירוזין הדומים מבחינה מבנית בתנאי אופטימלי, מה שמבטל הפרעות משותפות עקב תרכובות מוגזמות מאוד אלה וכתוצאה מכך משפר את מידת הסלקטיביות של הבדיקה.

אות 3-ניטרוטירוזין אינו נצפה בכרומטוגרמה לניטור התגובה המרובה של הדגימה הריקה הכפולה, מה שמצביע על כך ש-3-ניטרוטירוזין לא נוצר במהלך כל התהליך. כרומטוגרמות מייצגות לניטור תגובות מרובות של 3-ניטרוטירוזין ותקן פנימי לאדם בריא מוצגות כאן. לא נצפו אותות מפריעים בזמני השמירה של 3-ניטרוטירוזין ותקן פנימי.

עקומה סטנדרטית מייצגת מוצגת כאן. גבול הגילוי שהוגדר כריכוז הנמוך ביותר עם יחס אות לרעש גדול משלושה נקבע כשתי פיקוגרמות למיליליטר. הגבול התחתון של הכימות נקבע כ-10 פיקוגרם למיליליטר והוא מוגדר כריכוז הנמוך ביותר בטווח של 20% מחוסר דיוק ודיוק עם יחס אות לרעש של יותר מ-10.

מבחן האינטגרציה המכוונן מספק שיפור משמעותי בספציפיות, ברגישות ובתפוקה עם אפקט מטריצה מופחת, שימוש בספיגה וסילוק פסולת. בעזרת בדיקה פשוטה ומהירה זו, ניתן לעבד דגימת שתן תוך 24 שעות. קחו בחשבון את דגימת השתן הלא פולשנית והזולה.

שיטה משופרת להפליא זו מתאימה היטב להערכת תפקידו של 3-ניטרוטירוזין כסמן ביולוגי של עקה חמצונית במחקרים פרה-קליניים וקליניים.