Name: אינטגרציה של מיצוי שלב מוצק ממוזער ו LC-MS / MS איתור של 3-Nitrotyrosine בשתן האדם עבור יישומים קליניים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: למד שיטת LC-MS/MS עם מיצוי שלב מוצק ממוזער לכימות 3-nitrotyrosine בשתן אנושי. שיטה זו מספקת רגישות וסלקטיביות גבוהות ליישומים קליניים במחקר מתח חמצוני.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים היו מודים סקוט הווארד אביגיל Marinack לתמיכה כללית ותיאום של עבודה זו.

כל המחקרים שעסקו בדגימות שתן של בני אדם נערכו תוך שמירה על ההליך שאושר על ידי מועצת המנהלים של המוסד הרפואי (Pharmasan / Neuroscience). 1. שתן אוסף דוגמאות וקריאטינין (Cr) קביעת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף 5 מ&quot;ל של דגימות שתן בבוקר לאחר ca. 10 שעות צום לילה בצינור 5 מ&quot;ל תחבורה המכיל 250 μL של 3 N HCl כמו משמר ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשרה ו מערבולת 5 מ&quot;ל שתן התחבורה צינור צנטריפוגה בצנטריפוגה ( למשל Sorvall) (2297 XG, 10 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 1 מ&quot;ל של שתן פעמיים מן צינור 5 מ&quot;ל תחבורה A. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת Cr בשיטת קריאטינין בשתן 26 . </li></ol> 2. הכנה של תקן, IS ו בקרת איכות (QC) דוגמאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון המניות של 3-NT ב 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​במים עם 0.01% HCOOH שלב נייד A (MA) ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עשהפתרון 3-NT תקן עבודה בריכוז של 100 ng / mL על ידי דילול 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​3-NT פתרון המניות עם MA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת תקנים הנעים בין 5 ל 2500 pg / mL על ידי דילול של 100 ng / מ&quot;ל ​​תקן עבודה עם 0.15 M HCl acidified חומצה ריקה חינם של 3-NT יחד עם ריק ריק דוגמאות ריקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון המניות של IS 13 C 9 -3 NT ב 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​במים עם MA חנות ב -20 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך פתרון עובד IS ב 500 pg / mL על ידי דילול של 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל 13 C 9 -3 NT פתרון מלאי עם MA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקים חמש רמות של דגימות QC המכסים את LLOQ, נמוך, בינוני רמות גבוהות ( כלומר , 10, 25, 100, 500 ו 1,250 pg / mL), על ידי דילול של 3-NT תקן העבודה בשתן ריק acidified. </li></ol> 3. הליך מוצק שלב הפקת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההפשרה דגימות שתן וורטקס, תקנים דגימות QC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף דגימות שתן, תקנים ו QC SampLes (250 μL כל אחד) עד 32 בארות של נקי 2 מ&quot;ל 96-גם אוסף צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הציגו את 500 pg / mL IS פתרון עובד (50 μL) לכל טוב, למעט כפול מדגם ריק היטב. הוסף 0.01% HCOOH (50 μL) למדגם ריק כפול היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף LC-MS / MS מים עם 0.1% HCOOH (250 μL). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את התערובת לעיל עם פיפטה 8 ערוצים שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את הצלחת עד טעינת SPE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת מיצוי MCX 96-well ו מאגר מאגר על מעבד לחץ חיובי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התנאי את צלחת מיצוי עם זרימת MeOH (200 μL) דרך sorbent. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן על ידי מים זורמים עם HCOOH 2% (200 μL) דרך סורב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את עוצמת הקול של כל אחד מראש דגימות מעורב על צלחת מיוצר מראש בזהירות עם פיפטה 8 ערוצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר לחץ חיובי נמוך ( למשל , 3 psi) על מעבד הלחץ חיובי כדי לאפשר לתערובת לזרום thrצריך להספיג לאט, להתאים את הלחץ במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הבארות על ידי מים זורמים עם HCOOH 2% (200 μL) דרך סורב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הבארות על ידי מתנול זורם (200 μL) דרך sorbent. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הבארות על ידי מים זורמים (200 μL) דרך sorbent. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש את הבארות לחלוטין עם הגדרת לחץ חיובי גבוהה ( למשל , 40 psi) על מעבד הלחץ חיובי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המאגר עם נקי 2 מ&quot;ל 96-גם צלחת אוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 25 מ&quot;מ NH 4 OAc ב pH 9 (50 μL) כדי elute שמרו את אנליטי ו- IS מהצלחת החילוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה LC-MS מים עם HCOOH 5% 5 (50 μL) כדי לנטרל את eluate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים עם פיפטה 8 ערוצים שלוש פעמים להגיש לתחנת LC-MS / MS לניתוח. </li></ol> 4. LC-MS / MS ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד במדויק 2,000 מ&quot;ל של מים LC-MS עם גליל מדורגת ולהעביר אותו לתוך בקבוק 2 L. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עמ &#39;Ipette 200 μL טהור μL לתוך בקבוק מעל המכיל LC-MS מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב ותווית כמו שלב נייד A (MA). כלול ראשי תיבות, תאריך הכנה ותאריך התפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח בקבוק 2 L של מתנול LC-MS ותווית כמו שלב נייד B (MB) עם תאריך ההתחלה ותאריך התפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר טמפרטורה של דוגם אוטומטי ל 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת אוסף עם דגימות מוכן לתוך autosampler. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים עמודה PFP (150 מ&quot;מ x 2.1 מ&quot;מ מזהה, 3 מיקרומטר) ואת עמוד השומר בתנור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את טמפרטורת התנור ל 30 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן 10 דקות באמצעות שיטת הרכישה עם elution הדרגתי LC כפי שמוצג בטבלה 1 . </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> זמן (דקות) </td><td> מודול </td><td> אירועים </td><td> פָּרָמֶטֶר </td></tr><tr><td> 0 </td><td> משאבות </td><td> משאבה ב &#39;קונק. </td><td> 5 </td></tr><tr><td> 0.5 </td><td> משאבות </td><td> משאבה ב &#39;קונק. </td><td> 20 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> משאבות </td><td> משאבה ב &#39;קונק. </td><td> 50 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> משאבות </td><td> משאבה ב &#39;קונק. </td><td> 80 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> משאבות </td><td> משאבה ב &#39;קונק. </td><td> 90 </td></tr><tr><td> 4.01 </td><td> משאבות </td><td> משאבה ב &#39;קונק. </td><td> 95 </td></tr><tr><td> 5.5 </td><td> משאבות </td><td> משאבה ב &#39;קונק. </td><td> 95 </td></tr><tr><td> 5.6 </td><td> משאבות </td><td> משאבה ב &#39;קונק. </td><td> 5 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> בקר </td><td> תפסיק </td><td></td></tr></tbody></table> טבלה 1: כרומטוגרפיה נוזלית <ol start="10" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת רשימת אצווה כוללסטנדרטים, QC ו דגימות שתן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל את אצווה על ידי הזרקה של דגימות מוכן (12 μL). </li></ol> 5. זיהוי שיא, אינטגרציה ועיבוד נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שליטה רכישת נתונים ועיבוד באמצעות התוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות ולשלב 3-NT ו פסגות IS עבור כל הדגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקים עקומת תקן עם טווח של 10-2,500 pg / mL עבור quantitation 3-NT על ידי רגרסיה ליניארית של יחס שטח שיא של 3-NT ו- IS לעומת ריכוז נומינלי 3-NT עם גורם שקלול של 1 / x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את כל הדגימות באמצעות עקומת תקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע אם דגימות QC ליפול בטווח הוקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמיר את הריכוזים זוהה של דגימות שתן לתוצאות הסופיות ביחידה של nM או nmol / mmol Cr. </li></ol>

<ol><li>Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomarkers+of+oxidative+damage+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Biomarkers of oxidative damage in human disease.</a> Clin. Chem. 52 (4), 601-623 (2006).</li>
<li>Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+and+peroxynitrite+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease.</a> Physiol. Rev. 87 (1), 315-424 (2007).</li>
<li>Baraldi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-Nitrotyrosine%2C+a+marker+of+nitrosative+stress%2C+is+increased+in+breath+condensate+of+allergic+asthmatic+children%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">3-Nitrotyrosine, a marker of nitrosative stress, is increased in breath condensate of allergic asthmatic children.</a> Allergy. 61 (1), 90-96 (2006).</li>
<li>Ischiropoulos, H., Beckman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+nitration+in+neurodegeneration%3A+Cause%2C+effect%2C+or+association%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and nitration in neurodegeneration: Cause, effect, or association?</a> J. Clin. Invest. 111 (2), 163-169 (2003).</li>
<li>Butterfield, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+levels+of+3-nitrotyrosine+in+brain+from+subjects+with+amnestic+mild+cognitive+impairment%3A+implications+for+the+role+of+nitration+in+the+progression+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Elevated levels of 3-nitrotyrosine in brain from subjects with amnestic mild cognitive impairment: implications for the role of nitration in the progression of Alzheimer's disease.</a> Brain Res. 1148, 243-248 (2007).</li>
<li>Hui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+robust+LC-MS%2FMS+method+for+quantification+of+free+3-nitrotyrosine+in+human+plasma+from+patients+receiving+on-pump+CABG+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">A simple and robust LC-MS/MS method for quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma from patients receiving on-pump CABG surgery.</a> Electrophoresis. 33 (4), 697-704 (2012).</li>
<li>Kato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+modified+tyrosines+in+healthy+and+diabetic+human+urine+using+liquid+chromatography%2Ftandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Biochem.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Quantification of modified tyrosines in healthy and diabetic human urine using liquid chromatography/tandem mass spectrometry.</a> J. Clin. Biochem. Nutr. 44 (1), 67-78 (2009).</li>
<li>Duncan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+approaches+to+the+analysis+of+3-nitrotyrosine%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+acids%22%5BJournal%5D)">A review of approaches to the analysis of 3-nitrotyrosine.</a> Amino acids. 25 (3-4), 351-361 (2003).</li>
<li>Ryberg, H., Caidahl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatographic+and+mass+spectrometric+methods+for+quantitative+determination+of+3-nitrotyrosine+in+biological+samples+and+their+application+to+human+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B%22%5BJournal%5D)">Chromatographic and mass spectrometric methods for quantitative determination of 3-nitrotyrosine in biological samples and their application to human samples.</a> J. Chromatogr. B. 851 (1-2), 160-171 (2007).</li>
<li>Tsikas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+methods+for+3-nitrotyrosine+quantification+in+biological+samples%3A+the+unique+role+of+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+acids%22%5BJournal%5D)">Analytical methods for 3-nitrotyrosine quantification in biological samples: the unique role of tandem mass spectrometry.</a> Amino acids. 42 (1), 45-63 (2012).</li>
<li>Tsikas, D., Duncan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+and+3-nitrotyrosine%3A+strategies%2C+controversies%2C+and+our+current+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry and 3-nitrotyrosine: strategies, controversies, and our current perspective.</a> Mass Spectrom. Rev. 33 (4), 237-276 (2014).</li>
<li>Iwasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+fluorescence+reagents+for+simultaneous+determination+of+hydroxylated+phenylalanine+and+nitrated+tyrosine+by+high-performance+liquid+chromatography+with+fluorescence+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Comparison of fluorescence reagents for simultaneous determination of hydroxylated phenylalanine and nitrated tyrosine by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection.</a> Biomed. Chromatogr. 26 (1), 41-50 (2012).</li>
<li>Saravanabhavan, G., Blais, E., Vincent, R., Kumarathasan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+performance+liquid+chromatography-electrochemical+array+method+for+the+measurement+of+oxidative%2Fnitrative+changes+in+human+urine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">A high performance liquid chromatography-electrochemical array method for the measurement of oxidative/nitrative changes in human urine.</a> J. Chromatogr. A. 1217 (19), 3269-3274 (2010).</li>
<li>Mergola, L., Scorrano, S., Del Sole,, Lazzoi, R., R, M., Vasapollo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+the+synthesis+of+a+water+compatible+molecularly+imprinted+polymer+as+artificial+receptor+for+detection+of+3-nitro-L-tyrosine+in+neurological+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Developments in the synthesis of a water compatible molecularly imprinted polymer as artificial receptor for detection of 3-nitro-L-tyrosine in neurological diseases.</a> Biosens. Bioelectron. 40 (1), 336-341 (2013).</li>
<li>Schwedhelm, E., Tsikas, D., Gutzki, F. M., Frolich, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas+chromatographic-tandem+mass+spectrometric+quantification+of+free+3-nitrotyrosine+in+human+plasma+at+the+basal+state%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Gas chromatographic-tandem mass spectrometric quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma at the basal state.</a> Anal. Biochem. 276 (2), 195-203 (1999).</li>
<li>Tsikas, D., Mitschke, A., Suchy, M. T., Gutzki, F. M., Stichtenoth, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+3-nitrotyrosine+in+human+urine+at+the+basal+state+by+gas+chromatography-tandem+mass+spectrometry+and+evaluation+of+the+excretion+after+oral+intake%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B%22%5BJournal%5D)">Determination of 3-nitrotyrosine in human urine at the basal state by gas chromatography-tandem mass spectrometry and evaluation of the excretion after oral intake.</a> J. Chromatogr. B. 827 (1), 146-156 (2005).</li>
<li>Marvin, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+o%2Co%27-dityrosine%2C+o-nitrotyrosine%2C+and+o-tyrosine+in+cat+urine+samples+by+LC%2Felectrospray+ionization-MS%2FMS+using+isotope+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantification of o,o'-dityrosine, o-nitrotyrosine, and o-tyrosine in cat urine samples by LC/electrospray ionization-MS/MS using isotope dilution.</a> Anal. Chem. 75 (2), 261-267 (2003).</li>
<li>Orhan, H., Vermeulen, N. P., Tump, C., Zappey, H., Meerman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+determination+of+tyrosine%2C+phenylalanine+and+deoxyguanosine+oxidation+products+by+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+as+non-invasive+biomarkers+for+oxidative+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B%22%5BJournal%5D)">Simultaneous determination of tyrosine, phenylalanine and deoxyguanosine oxidation products by liquid chromatography-tandem mass spectrometry as non-invasive biomarkers for oxidative damage.</a> J. Chromatogr. B. 799 (2), 245-254 (2004).</li>
<li>Chen, H. J. C., Chiu, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+and+quantification+of+3-nitrotyrosine+and+3-bromotyrosine+in+human+urine+by+stable+isotope+dilution+liquid+chromatography+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection and quantification of 3-nitrotyrosine and 3-bromotyrosine in human urine by stable isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry.</a> Toxicol. Lett. 181 (1), 31-39 (2008).</li>
<li>Marc, D. T., Ailts, J. W., Campeau, D. C. A., Bull, M. J., Olson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitters+excreted+in+the+urine+as+biomarkers+of+nervous+system+activity%3A+validity+and+clinical+applicability%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Biobehav.+Rev%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitters excreted in the urine as biomarkers of nervous system activity: validity and clinical applicability.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 35 (3), 635-644 (2011).</li>
<li>Li, X. G., Li, S., Wynveen, P., Mork, K., Kellermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+specific+and+sensitive+LC-MS%2FMS+method+for+quantification+of+urinary+catecholamines+and+application+in+biological+variation+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a specific and sensitive LC-MS/MS method for quantification of urinary catecholamines and application in biological variation studies.</a> Anal. Bioanal. Chem. 406 (28), 7287-7297 (2014).</li>
<li>Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-analytical+and+analytical+validations+and+clinical+applications+of+a+miniaturized%2C+simple+and+cost-effective+solid+phase+extraction+combined+with+LC-MS%2FMS+for+the+simultaneous+determination+of+catecholamines+and+metanephrines+in+spot+urine+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Pre-analytical and analytical validations and clinical applications of a miniaturized, simple and cost-effective solid phase extraction combined with LC-MS/MS for the simultaneous determination of catecholamines and metanephrines in spot urine samples.</a> Talanta. 159, 238-247 (2016).</li>
<li>Chao, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+of+3-nitrotyrosine+and+3-nitro-4-hydroxyphenylacetic+acid+in+human+urine+by+online+SPE+LC-MS%2FMS+and+their+association+with+oxidative+and+methylated+DNA+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection of 3-nitrotyrosine and 3-nitro-4-hydroxyphenylacetic acid in human urine by online SPE LC-MS/MS and their association with oxidative and methylated DNA lesions.</a> Chem. Res. Toxicol. 28 (5), 997-1006 (2015).</li>
<li>Radabaugh, M. R., Nemirovskiy, O. V., Misko, T. P., Aggarwal, P., Mathews, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoaffinity+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+detection+of+nitrotyrosine+in+biological+fluids+development+of+a+clinically+translatable+biomarker%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Immunoaffinity liquid chromatography-tandem mass spectrometry detection of nitrotyrosine in biological fluids development of a clinically translatable biomarker.</a> Anal. Biochem. 380 (1), 68-76 (2008).</li>
<li>Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00216-015-8934-5">Tailored 96-well µElution solid-phase extraction combined with UFLC-MS/MS: a significantly improved approach for determination of free 3-nitrotyrosine in human urine.</a> Anal. Bioanal. Chem. 407 (25), 7703-7712 (2015).</li>
<li>Roche Diagnostics. Roche Creatinine Jaffé Gen.2, package insert 2011-11, V7. , Mannheim. Available from:
 <a target="_blank" href="https://usdiagnostics.roche.com/products/06407137190/PARAM2083/overlay.html">https://usdiagnostics.roche.com/products/06407137190/PARAM2083/overlay.html</a> 2011-2011 (2011).</li>
<li>Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mixed-mode+solid+phase+extraction+coupled+with+LC-MS%2FMS+for+the+re-evaluation+of+free+3-nitrotyrosine+in+human+plasma+as+an+oxidative+stress+biomarker%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">A novel mixed-mode solid phase extraction coupled with LC-MS/MS for the re-evaluation of free 3-nitrotyrosine in human plasma as an oxidative stress biomarker.</a> Talanta. 140, 45-51 (2015).</li>
<li>Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+approach+for+the+ultra-sensitive+determination+of+catecholamines+in+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+to+assess+neural-immune+communication%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">An integrated liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach for the ultra-sensitive determination of catecholamines in human peripheral blood mononuclear cells to assess neural-immune communication.</a> J. Chromatogr. A. 1449, 54-61 (2016).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם ניגוד עניינים.

שינויים משמעותיים בריכוזים שפורסמו בעבר בספרות עבור אנדוגני חינם 3-NT בדגימות שתן האדם לחשוף בעיות מתודולוגיות הקשורות מבחני זמין 8 , 9 , 10 , 11 . קביעה מדויקת של רמה בסיסית נמוכה של 3-NT בשתן אנושי נותרה משימה מאתגרת הדורשת אמצעי זהירות מיוחדים עבור הכנת המדגם וניתוח LC-MS / MS. פרוטוקול זה מתאר הליך SPE הרומן בשילוב עם סלקטיבי LC-MS / MS גילוי המאפשר ...

ההשפעות של לחץ חמצוני על מצגת קלינית כבר דחף בחזית בשנים האחרונות 1 . אחד הביומרקרים הנבדקים הוא 3-nitrotyrosine (3-NT), מוצר יציב סוף נוצר כאשר מינים חנקן תגובתי (RNS) אינטראקציה עם טירוזין, מבשר נוירוטרנסמיטר catecholamine. בעוד 3-NT עשוי להיות ערך קליני כמו ביומרקר עבור RNS in vivo, שינויים משמעותיים של תכונות ותפקודים של טירוזין עלול להשפיע לרעה חלבונים המתאימים פונקציות הסלולר 1 , 2 . מחקר מתפתח הציע כי 3-NT עשוי לשחק תפקיד חשוב בתנאים דלקתיים 3 , הפרעות ניווניות 4 , 5 , מחלות לב וכלי דם 6 ו סוכרת 7 כמו גם תנאים הקשורים מתח חמצוני. עם זאת, אלה obseRvations מבוססים על תוצאות מתודולוגיות חסרות רגישות ו / או סלקטיביות 8 , 9 , 10 , 11 . טווחי הריכוז העצומים 3-NT עבור הדגימות הביולוגיות שדווחו בעבר בספרות מגלות כי בעיות אנליטיות חמורות קשורות עם מבחנים אלה ושיפור טכני נדרש כדי לכמת במדויק את רמות 3-NT ולאמת את תפקידו הפתולוגיה של תנאים אלה . הכמות של 3-NT חינם מטריצות ביולוגיות מציג אתגר מיוחד לאדם ולכלי 8 , 9 , 10 , 11 . ראשית, רמת עקבות של אנדוגני 3-NT דורש זיהוי רגיש במיוחד; שנית, את קיומו של מספר רב של אנלוגים דומים מבחינה מבנית, במיוחד טירוזין, אשר קייםעודף עצום, דורש מידה גבוהה של סלקטיביות; שלישית, היווצרות artefactual של 3-NT ידי טיטרציה טירוזין עם חנקתי בכל מקום ניטריט דורש שיקול מיוחד במהלך הכנת המדגם, כדי למנוע overestimation שקר של 3-NT. בין מגוון רחב של מתודולוגיות המשמשות למדידה של 3-NT, MS / MS נחשב לשיטה הסטנדרטית של הזהב, בשל רגישותו הסלקטיבית והבררה שלו 11 , 12 , 13 , 14 . גז כרומטוגרפיה (GC) מצמידים MS / MS מציעה את הרגישות הטובה ביותר, עם זאת, הצעדים derivatization המדגם הכרחי מייגעים מדי זמן רב כדי להיות יעיל עבור כלי קליני 15 , 16 . LC-MS / MS אינו דורש derivatization מדגם מורכב, מה שהופך אותו אופציה מבטיחה יותר. עם זאת, ישנם מספר מכשולים שיש להתגבר עליהםNsitivity של LC-MS / MS שיטות דיווחו בספרות הצרכים כדי לשפר את המדידה של שופע נמוך 3-NT 7 , 17 , 18 ואת זמן התפנית יחסית חייב להיות מקוצר עבור תפוקה גבוהה יישומים 12 , 13 , 17 , 19 . בנוסף, כאשר בוחנים יישומים קליניים, המטריצה ​​הביולוגית המשמשת משחקת תפקיד משמעותי. זה צריך להיות קל וזול להשיג ולא פולשני אם אפשר 20 , 21 , 22 . פלזמה, המדגם המשמש באופן מסורתי בספרות, אינה מטריצה ​​רצויה מבחינה קלינית, ולכן מתודולוגיה המשתמשת בשתן שאינו פולשני וחסכוני. מספר ניסיונות לפתח relIable ספציפיים LC-MS / MS מתודולוגיות נעשו באמצעות שתן 9 , 10 , 11 . עם זאת, כולם נמנעו מלהיות סלקטיביים, אמינים או יעילים מספיק לשימוש קליני. האפקטיביות של ה- SPE השולט באמצעות מחסנית שלב הפוכה המסורתית (C18 סוג) כמו ניקוי מדגם לניתוח 3-NT כבר נחקר ו SPE רציף של חילופי קטיון חזקה (SCX) ואת הפוכה שלב C18-OH הוצע 6 , 7 , 19 . שיטה אחת שפותחה לאחרונה LC-MS / MS השתמשו בתהליך טיהור רב של C18 SPE ידנית, כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (HPLC), ו- SPE באינטרנט לניתוח של 3-NT 23 . למרות ששיטה זו הייתה רגישה מספיק למטרות קליניות, עם LLOQ של 0.041 ננומטר, תהליך הניקוי היה אינטנסיבי ומייגע ו requiאדום 3 מ&quot;ל של שתן, הגבלת הכדאיות שלה עבור תפוקה גבוהה. פולימר מוטבע במולקולה הועסק כמרכיב SPEb כדי לשפר את היעילות של תהליך הניקוי 14 , אך LLOQ שהתקבל (0.7 מיקרוגרם / מ&quot;ל) לא היה נמוך מספיק עבור דגימות קליניות. שיטה נוספת נדרשה דו מימדי LC-MS / MS ו chromatography immunoaffinity עבור ניקוי המדגם על מנת להשיג גבול של גילוי (LOD) של 0.022 nM 24 . בעוד כל השיטות הללו עשו התקדמות בהערכת 3-NT, אף אחד לא השיגו את הרגישות, האמינות, ואת היעילות הדרושים עבור יישומים קליניים. על מנת לחקור את הפתולוגיה של 3-NT חינם ואת תפקידה כסימן ביולוגי של מתח חמצוני בקליני, פיתחנו מתודולוגיה פשוטה, יעילה, מדויקת ומדויקת, המאפשרת יישומים קליניים עתירי תפוקה 25 . מיניאטורה מעורבת מצב קטיון excHange (MCX) 96-microplate החילוץ גם יושמה כדי להשיג ניקוי מדגם פשוט ויעיל והעשרה של 3-NT ב מיצוי אחד עקיפת החסרונות לראות בשיטות הקיימות הדורשים derivatization, אידוי ו- 2D-LC. כרומטוגרפיה נוזלית עם 0.01% HCOOH כתוסף בשלב נייד הציעה תגובת אות משופרת עם זמן מחזור מהיר. הסלקטיביות השתפרה עוד יותר באמצעות יישום של פתרון ALUT מתון NH 4 OAc עבור elution סלקטיבי של 3-NT, ושימוש במעבר MRM הן עבור 3-NT והן בתקן הפנימי (IS). אפקט מטריצה ​​היה פיצוי על ידי שימוש בכמות מופחתת של 13 המועדפת C שכותרתו IS איזוטופי לכימות. עם הופעתה של מתודולוגיה זו, חוקרים וקלינאים יוכלו לאמת את התפקיד של 3-NT בתנאים קליניים נוספת לחקור את ההשפעה של מתח חמצוני.

<table><tbody><tr><td>3-ניטרו-L-טירוזין</td><td>סיגמא</td><td>N7389-5 גרם</td><td></td></tr><tr><td>3-ניטרו-L-טירוזין-13C<תת>9</תת></td><td>סיגמא</td><td>652296-5.0 מ"ג</td><td></td></tr><tr><td>מפרט מסה שתן זהב גולדן</td><td>ווסט ביולוגי</td><td>MSG 5000-1L</td><td></td></tr><tr><td>אואזיס MCX 96-באר ומיקרו; צלחת אלוטיון</td><td>מים</td><td>186001830BA</td><td></td></tr><tr><td>2 מ"ל 96 צלחת איסוף בארות</td><td>פנומנקס&nbsp; &nbsp;</td><td>AH0-7194</td><td></td></tr><tr><td>96 מעבד חיובי</td><td>מים&nbsp;</td><td></td><td></td>186005521</tr><tr><td>LC-MS Ultra CHROMASOLV מתנול&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>14262-2L</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS Ultra CHROMASOLV מים</td><td>Sigma</td><td>14263-2L</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פורמית לספקטרומטריית מסה</td><td>Sigma</td><td>94318-50ML-F</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת אמוניום הידרוקסיד</td><td>Sigma</td><td>338818-1L</td><td></td></tr><tr><td>Ultra PFP פרופיל עמודים</td><td>Restek</td><td>9179362</td><td></td></tr><tr><td>5500 Triple quad</td><td>AB Sciex&nbsp;</td><td>/</td><td>צור קשר עם היצרן לפרטים נוספים</td></tr><tr><td>UFLC-XR</td><td>Shimadzu&nbsp;</td><td>/</td><td>צור קשר עם היצרן לפרטים נוספים</td></tr><tr><td>Integra 400 Plus&nbsp;</td><td>רוש</td><td>/</td><td>קריאטינין בשתן Jaff&eacute; שיטת Gen 2</td></tr><tr><td>LCMS מוסמך 12 x 32 מ"מ בקבוקון צוואר בורג</td><td>מים</td><td>600000751CV</td><td></td></tr><tr><td>LCGC מוסמך 12 x 32 מ"מ צוואר בורג בקבוקון התאוששות כולל</td><td>מים</td><td>186000384C</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל צינור הובלה</td><td>פניקס</td><td>TT-3205</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור צנטריפוגה</td><td>קריסטלגן&nbsp;</td><td>23-2263</td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה 15 מ"ל</td><td>קריסטלגן&nbsp;</td><td>23-2266</td><td></td></tr><tr><td>eLine פיפטה אלקטרונית</td><td>Sartorius</td><td>730391</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה מיקרופוגה&nbsp;</td><td>בקמן קולטר</td><td>A46474</td><td></td></tr><tr><td>OHAUS איזון&nbsp; &nbsp;</td><td>קנדי סקאלס בע"מ</td><td>מערבל מערבולת 735</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>ברנסטד תרמולין</td><td>M16715</td><td></td></tr></tbody></table>

אינטגרציה של מיצוי שלב מוצק ממוזער ו lc-ms / ms איתור של 3-nitrotyrosine בשתן האדם עבור יישומים קליניים

Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications

חינם 3-nitrotyrosine (3-NT) כבר בשימוש נרחב כמו ביומרקר אפשרי עבור מתח חמצוני. רמות מוגברות של 3-NT דווחו במגוון רחב של מצבים פתולוגיים. עם זאת, שיטות קיימות חסרים את הרגישות ו / או הספציפיות הנדרשת כדי למדוד את רמת אנדוגני נמוך של 3-NT אמין והם מסורבלים מדי עבור יישומים קליניים. לפיכך, שיפור אנליטית יש צורך בדחיפות כדי לכמת במדויק את רמות 3-NT ולאמת את התפקיד של 3-NT בתנאים פתולוגיים. פרוטוקול זה מציג את הפיתוח של כרומטוגרפיה נוירומטית חדשה של ספקטרומטריית מסה (LC-MS / MS) בשילוב עם מיצוי שלב מוצק מוצק (SPE) למדידה מהירה ומדויקת של 3-NT בשתן אנושי כמו ביומרקר לא פולשני עבור מתח חמצוני. SPE באמצעות צלחת 96-היטב להפשיט באופן משמעותי את התהליך על ידי שילוב ניקוי המדגם והעשרה אנליטית ללא derivatization מייגע צעדים אידוי, הפחתת צריכת ממס, סילוק פסולת, סיכון של זיהום זמן עיבוד הכולל. העסקת 25 מ&quot;מ אמוניום אצטט (NH 4 OAc) ב pH 9 כמו פתרון elution SPE משופרת באופן משמעותי את הסלקטיביות. תגובת אותות ספקטרומטריית מסה השתפרה באמצעות התאמת מעברי הניטור המרובים (MRM). שימוש של 0.01% HCOOH כתוסף על עמודה pentafluorophenyl (PFP) (150 מ&quot;מ x 2.1 מ&quot;מ, 3 מיקרומטר) שיפור האות בתגובה עוד פי 2.5 וקצר את זמן הריצה הכולל עד 7 דקות. מגבלה נמוכה יותר של quantitation (LLOQ) של 10 pg / mL (0.044 ננומטר) הושגה, המייצג שיפור רגישות משמעותי על מבחני דיווח. שיטה פשוטה, מהירה, סלקטיבית ורגישה זו מאפשרת שתי צלחות של דגימות שתן (n = 192) להיות מעובדות תוך 24 שעות. בהתחשב בביצועים האנליטיים המשופרים במידה ניכרת, ובדגימת שתן לא פולשנית וזולה, המבחן המוצע מועיל לטיפול פרה-קליני וקלינילימודים.

איור 1 ממחיש כי 3-NT מופרד לחלוטין chromatographically אחרים דומים מבנית tyrosine דומה אנלוגים תחת תנאי LC אופטימיזציה, אשר מבטלת את שיתוף eluting הפרעות בשל אלה תרכובות מופרז בהרבה וכתוצאה מכך משפר את מידת הסלקטיביות assay. בנוסף, elution שיפוע עם 0.01% HCOOH כתוסף ב MA ו מתנול בקצב זרימה של 0.45 מ&quot;ל / דקה מאפשר elution מהירה של 3-NT ( כלומר , 3 דקות עם זמן אספקה ​​של 7 דקות). <p class="jove_content"...

כרומטוגרפיה סלקטיבית ורגישה כרומטוגרפית מסודרת (LC-MS / MS) שיטה בשילוב עם מוצק שלב מוצק שלב על מצב מעורבת קטיון (MCX) 96 מיקרופלטה גם פותחה למדידת חינם nitrotyrosine 3 ( 3-NT) בשתן אנושי עם תפוקה גבוהה, אשר מתאים ליישומים קליניים.

אינטגרציה של מיצוי שלב מוצק ממוזער ו LC-MS / MS איתור של 3-Nitrotyrosine בשתן האדם עבור יישומים קליניים

Free 3-nitrotyrosine (3-NT) has been extensively used as a possible biomarker for oxidative stress. Increased levels of 3-NT have been reported in a wide ...

המטרה הכללית של בדיקה זו, המשלבת מיניאטוריזציה של מיצוי פאזה מוצקה (solid phase extraction) עם LC-MS/MS, היא לכימות מדויק של 3-nitrotyrosine חופשי בשתן אנושי ליישומים קליניים. 3-nitrotyrosine חופשי משמש כסמן ביולוגי לעקה חמצונית. עם זאת, כימות מדויק של 3-nitrotyrosine בדגימות ביולוגיות ליישומים קליניים נותר אתגר מיוחד בשל רגישות וסלקטיביות לא מספיקות והכנות דגימה מסורבלות.טכניקה זו, המשלבת מיצוי פאזה מוצקה יעיל עם מערכת LC-MS/MS רגישה ביותר, מאפשרת קביעה מהירה, ספציפית ומדויקת של רמות נמוכות של 3-nitrotyrosine אנדוגני בשתן אנושי ללא צורך בהרכבה או ב-LC דו-ממדי. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות בחקירת עקה חמצונית, ניתן ליישמה גם במצבים פתולוגיים אחרים, כגון הפרעות דלקתיות וניורודגנרטיביות מורכבות. ניתן להרחיב את יישומי הטכניקה הזו לניטור יעילותו של טיפול נוגד חמצון, מכיוון שרמת ה-3-nitrotyrosine יכולה להיות מופחתת על ידי נוגדי חמצון. כדי להתחיל בהליך זה, ערבבו בוורטקס דגימות שתן שהוכנו והופשרו מראש, תמיסות סטנדרט ודגימות QC.לאחר ערבוב ב-vortex, העברו 250 microliters מכל דגימה ומכל סטנדרט ל-32 בארות של פלטת איסוף נקייה בעלת 96 בארות בנפח שני מיליליטר. הוסיפו 50 microliters של תמיסת עבודה של סטנדרט פנימי שהוכנה מראש לכל בארה, למעט הבארה של דגימת הריק הכפול (double blank). לאחר מכן, הוסיפו 50 microliters של מים בדרגת LC-MS עם 0.01% formic acid לבארה של דגימת הריק הכפול.לאחר מכן, הוסף לבארות 250 µL של מים בדרגת LC-MS עם 0.1% formic acid. לאחר מכן, ערבב את התמיסות שלוש פעמים באמצעות פיפט שמונה ערוצים וכסה את הפלטה עד להעמסה על ה-SPE. בשלב הבא, הנח מיקרו-פלטה של 96 בארות לסמיכה של חליפת קטיונים במצב מעורב (mixed mode cation exchange) ומכל איסוף על מעבד בלחץ חיובי.מיצוי פאזה מוצקה (solid phase extraction) באמצעות מיקרו-פלטה של חליפת קטיונים במוד מעורב מאפשר ניקוי דגימה והעשרה סימולטניים של 3-nitrotyrosine במיצוי יחיד. יש להכין את פלטת המיצוי על ידי העברת 200 µL של מתנול בדרגת LC-MS דרך הסורבנט. סובב את כפתור כיוון הלחץ במעבד הלחץ החיובי כדי לקבוע לחץ חיובי נמוך, באופן שיאפשר לתערובת לזרום דרך הסורבנט לאט, תוך התאמת הלחץ במידת הצורך.בצע שיווי משקל על ידי העברת 200 µL של מים בדרגת LC-MS עם 2% formic acid דרך הסורבנט. באמצעות פיפט שמונה-ערוצי, טעון בזהירות את כל הנפח של כל אחת מהדגימות שהערבבו מראש אל לוח המיצוי שעבר התנייה. הגדר לחץ חיובי נמוך במעבד הלחץ החיובי כדי לאפשר לתערובת לזרום דרך הסורבנט לאט, תוך התאמת הלחץ לפי הצורך.לאחר מכן, שטפו את הבארות על ידי העברת 200 µL של מים בדרגת LC-MS עם 2% formic acid דרך הסורבנט. לאחר שטיפה עם 200 µL של methanol ומים, הגדירו את מעבד הלחץ החיובי ללחץ גבוה כדי לייבש את הבארות. ברגע שהבארות יבשות, החליפו את המאגר בלוח איסוף נקי של 96 בארות בנפח 2 mL.כעת, יש להוסיף 50 µL של תמיסת ammonium acetate בריכוז 25 mM כדי להבליט (elute) באיטיות את האנליט שנשאר ואת התקן הפנימי מלוחית המיצוי. לאחר מכן, יש להוסיף 50 µL של מים בדרגת LC-MS עם 5% formic acid כדי לנטרל את התמיסה שנבלטה. השימוש בתמיסת ammonium acetate מרוככת לצורך בליטת 3-nitrotyrosine מספק שיפור משמעותי בסלקטיביות וברגישות.ערבב את הדגימות באמצעות פיפט שמונה-ערוצי שלוש פעמים כהכנה לניתוח כרומטוגרפיה נוזלית מספקטרומטריית מסות בטור (LC-MS/MS). לאחר הגדרת מכשיר ה-LC-MS/MS, בצע שיווי משקל לשיטת ה-LC-MS/MS עבור 3-nitrotyrosine למשך 10 דקות באמצעות אלואציה של גרדיאנט ה-LC. על ידי ביצוע שיווי משקל לשיטה, גרדיאנט ה-LC יגיע למצב של שיווי משקל עם אלואציית הגרדיאנט הראשונית.טמפרטורת הדוגם האוטומטי תכוון ל-4 °C וטמפרטורת התנור תכוון ל-30 °C. צרו רשימת סדרה (batch list) הכוללת את דגימות השתן, התמיסות הסטנדרטיות ודגימות בקרת האיכות (QC). לאחר מכן, התחילו את הסדרה על ידי הזרקת הדגימות שהוכנו.לאחר השלמת כל ההזרקות, הגדירו עקומת סטנדרט בטווח של 10 עד 2,500 picograms per milliliter לצורך כימות של 3-nitrotyrosine, באמצעות רגרסיה לינארית של יחס שטח השיא של 3-nitrotyrosine לסטנדרט פנימי אל מול ריכוז ה-3-nitrotyrosine הנומינלי. לבסוף, כמתו את שאר הדגימות באמצעות עקומת הסטנדרט שהוגדרה, וקבעו האם דגימות ה-QC נמצאות בטווח שנקבע. נתוני LC של דגימות שתן אנושיות מראים כי 3-nitrotyrosine מופרד כרומטוגרפית מאנלוגים אחרים של tyrosine בעלי מבנה דומה תחת התנאים המותאמים, דבר שמונע הפרעות של אלוציה משותפת (co-eluting) עקב תרכובות אלו הנמצאות בכמויות גדולות באופן משמעותי, ובכך משפר את רמת הסלקטיביות של הבדיקה.לא נצפה אות של 3-nitrotyrosine בכרומטוגרמה של ה-multiple reaction monitoring של דגימת הבלנק הכפול, מה שמעיד על כך ש-3-nitrotyrosine אינו נוצר במהלך התהליך כולו. מוצגות כאן כרומטוגרמות multiple reaction monitoring מייצגות של 3-nitrotyrosine ושל סטנדרט פנימי עבור אדם בריא. לא נצפו אותות מפריעים בזמני השהייה של 3-nitrotyrosine ושל הסטנדרט הפנימי.עקומת סטנדרט מייצגת מוצגת כאן. גבול הגילוי, המוגדר כהריכוז הנמוך ביותר עם יחס אות לרעש הגבוה משלושה, נקבע כ-2 picograms per milliliter. הגבול התחתון של הכמות נקבע כ-10 picograms per milliliter ומוגדר כהריכוז הנמוך ביותר בטווח של 20% של חוסר דיוק ודיוק עם יחס אות לרעש הגבוה מ-10.בדיקת האינטגרציה המכווננת מספקת שיפור משמעותי בספציפיות, ברגישות ובקיבולת (throughput), לצד הפחתה באפקט המטריצה, בשימוש בסופח ובפינוי הפסולת. באמצעות בדיקה פשוטה ומהירה זו, ניתן לעבד דגימת שתן בתוך 24 שעות. יש לקחת בחשבון את העובדה שדגימת השתן היא לא פולשנית ואינה יקרה.שיטה משופרת להפליא זו מתאימה היטב להערכת תפקידו של 3-nitrotyrosine כסמן ביולוגי לעקה חמצונית במחקרים פרה-קליניים וקליניים.

integration-miniaturized-solid-phase-extraction-lc-msms-detection-3

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

בהתחשב רוק הדגימה עבור יישומים קליניים בעתיד, כמו סוכריה על מקל (LLUF) בדיקה ultrafiltration היה מפוברק להשתלב בחלל הפה האנושי. ניתוח ישיר של רוק לא מעוכל על ידי NanoLC-LTQ ספקטרומטריית מסה הפגינו את היכולת של בדיקות LLUF להסיר חלבונים גדולים וחלבונים שפע גבוהות, ולהפוך נמוך שפע לזיהוי פפטידים יותר.

רוק הדגימה האדם Peptidome ילידים באמצעות בדיקה Lollipop-Like Ultrafiltration: פשט ולשפר גילוי פפטיד של ספקטרומטריית מסה קלינית

לא ממוקד metabolomics מספק השערת יצירת תמונת מצב של פרופיל מטבולי. פרוטוקול זה יהיה להדגים את המיצוי והניתוח של מטבוליטים מתאי, סרום, או רקמות. מגוון המטבוליטים סקר באמצעות מיצוי שלב נוזלי נוזלי, microflow ultraperformance כרומטוגרפיה נוזלית / רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה (UPLC-HRMS) מצמידים את תוכנת ניתוח ההפרש.

Metabolomics לא ממוקדים ממקורות ביולוגיים באמצעות Ultraperformance כרומטוגרפיה נוזלית-רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה (UPLC-HRMS)

Α-hydroxylation של nitrosamines מסרטנים מאת ציטוכרום P450s הוא מסלול מטבולי מקובל שמייצר מזיקות-DNA intermediates, לגרום מוטציות. עם זאת, נתונים חדשים מציין עוד חמצון כדי nitrosamides יכול להתרחש. אנו מתארים גנרל שיטה לגילוי nitrosamides המופק במבחנה ציטוכרום P450 מזורז מטבוליזם של nitrosamines.

שיטה כללית לגילוי Nitrosamide היווצרות בחילוף החומרים במבחנה של Nitrosamines מאת ציטוכרום P450s

נציג של מיצוי מוצק-פאזי נוח מצמידים כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (HPLC) עם זיהוי אלקטרוכימי (ECD) נחישות סימולטני של נוירוטרנסמיטרים מונואמין שלוש ושתיים של מטבוליטים שלהם בשתן תינוקות. אנחנו גם לזהות את המטבוליט MHPG כמו סמן פוטנציאלי לאבחון מוקדם של נזק מוחי תינוקות.

שיטה נוחה עבור חילוץ וניתוח עם כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה של נוירוטרנסמיטורים קטכולאמין מטבוליטים שלהם

אנו מציגים שיטה כדי לזהות שינויים כימיים 3-nitrotyrosine של חלבונים אטמוספרי עם 6 מ מ קוטר סבבים של אוויר סמפלר prefilters באמצעות ביצועים גבוהים נוזלי כרומטוגרפיה-אלקטרוכימיות גלאי (HPLC-ECD).

זיהוי של 3-Nitrotyrosine סביבות אטמוספרי דרך ביצועים גבוהים מערכת גלאי אלקטרוכימי-כרומטוגרפיה נוזלית

כאן נתאר שיטת תפוקה גבוהה למעקב סמים מקיף המאפשר רזולוציית משופרת וזיהוי של לוחות גדולים של סמים של התעללות מטבוליטים שלהם, עם בקרת איכות המבוססת על הזרקת multisegment-נים אלקטרופורזה-ספקטרומטריית.

מעקב סמים תפוקה גבוהה ומקיף באמצעות ספקטרומטר מסה אלקטרופורזה הזרקה-נימי Multisegment

פרופיל פרוטאומומית של טירולך-nitrated חלבונים כבר טכניקה מאתגרת בשל השפע הנמוך של שינוי 3-ניטרוטירולי. כאן אנו מתארים גישה מקורית להעשרה וליצירת פרופילים של ניטרוגליצרין באמצעות אנגיוטנסין II כמודל. שיטה זו ניתנת להארכה עבור  אחרים בתחום החוץ הגופית או במערכות vivo .

ניטרופפטיד פרופיל וזיהוי מאויר על ידי אנגיוטנסין השני

המתואר כאן הוא פרוטוקול לקביעת ארבעה מטבוליטים שונים טריפטופן שנוצר במסלול קינורנין (קינורנין, 3-hydroxykynurenine, חומצה xanthurenic, 3-hydroxyanthranilic חומצה) במדיום שנאסף מתרביות תאים סרטניים נותחו על ידי כרומטוגרפיה נוזלית יחד עם ספקטרומטריית מסה מרובעת אחת.

כימות בו זמני של קינורנינים נבחרים שנותחו על ידי ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית במדיום שנאסף מתרביות תאים סרטניים

הפרוטוקול נועד להציג את השימוש בספקטרומטר מסה מרובע משולש לניטור תגובה מרובה (MRM) של חלבונים מדגימות קליניות. סיפקנו זרימת עבודה שיטתית החל מהכנת מדגם לניתוח נתונים עבור דגימות קליניות עם כל אמצעי הזהירות הדרושים שיש לנקוט.

זרימת עבודה של פרוטאומיה כמותית באמצעות זיהוי מבוסס ניטור תגובה מרובה של חלבונים מרקמת המוח האנושית

פרוטוקול זה מתאר בדיקת סמנים ביולוגיים סינתטיים בשתן סינתטי בתיווך CRISPR-Cas, המאפשרת אבחון סרטן נקודתי באמצעות ניתוח ex vivo של פעילויות פרוטאז הקשורות לגידול.

בדיקת סמנים ביולוגיים סינתטיים בשתן סינתטי בתיווך CRISPR-Cas לאבחון נייד

למד שיטת LC-MS/MS עם מיצוי שלב מוצק ממוזער לכימות 3-nitrotyrosine בשתן אנושי. שיטה זו מספקת רגישות וסלקטיביות גבוהות ליישומים קליניים במחקר מתח חמצוני.

אינטגרציה של מיצוי שלב מוצק ממוזער ו LC-MS / MS איתור של 3-Nitrotyrosine בשתן האדם עבור יישומים קליניים

גלה סרטונים נוספים