אינטגרציה של מיצוי שלב מוצק ממוזער ו LC-MS / MS איתור של 3-Nitrotyrosine בשתן האדם עבור יישומים קליניים

המטרה הכללית של בדיקה זו, המשלבת מיניאטוריזציה של מיצוי פאזה מוצקה (solid phase extraction) עם LC-MS/MS, היא לכימות מדויק של 3-nitrotyrosine חופשי בשתן אנושי ליישומים קליניים. 3-nitrotyrosine חופשי משמש כסמן ביולוגי לעקה חמצונית. עם זאת, כימות מדויק של 3-nitrotyrosine בדגימות ביולוגיות ליישומים קליניים נותר אתגר מיוחד בשל רגישות וסלקטיביות לא מספיקות והכנות דגימה מסורבלות.

טכניקה זו, המשלבת מיצוי פאזה מוצקה יעיל עם מערכת LC-MS/MS רגישה ביותר, מאפשרת קביעה מהירה, ספציפית ומדויקת של רמות נמוכות של 3-nitrotyrosine אנדוגני בשתן אנושי ללא צורך בהרכבה או ב-LC דו-ממדי. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות בחקירת עקה חמצונית, ניתן ליישמה גם במצבים פתולוגיים אחרים, כגון הפרעות דלקתיות וניורודגנרטיביות מורכבות. ניתן להרחיב את יישומי הטכניקה הזו לניטור יעילותו של טיפול נוגד חמצון, מכיוון שרמת ה-3-nitrotyrosine יכולה להיות מופחתת על ידי נוגדי חמצון. כדי להתחיל בהליך זה, ערבבו בוורטקס דגימות שתן שהוכנו והופשרו מראש, תמיסות סטנדרט ודגימות QC.

לאחר ערבוב ב-vortex, העברו 250 microliters מכל דגימה ומכל סטנדרט ל-32 בארות של פלטת איסוף נקייה בעלת 96 בארות בנפח שני מיליליטר. הוסיפו 50 microliters של תמיסת עבודה של סטנדרט פנימי שהוכנה מראש לכל בארה, למעט הבארה של דגימת הריק הכפול (double blank). לאחר מכן, הוסיפו 50 microliters של מים בדרגת LC-MS עם 0.01% formic acid לבארה של דגימת הריק הכפול.

לאחר מכן, הוסף לבארות 250 µL של מים בדרגת LC-MS עם 0.1% formic acid. לאחר מכן, ערבב את התמיסות שלוש פעמים באמצעות פיפט שמונה ערוצים וכסה את הפלטה עד להעמסה על ה-SPE. בשלב הבא, הנח מיקרו-פלטה של 96 בארות לסמיכה של חליפת קטיונים במצב מעורב (mixed mode cation exchange) ומכל איסוף על מעבד בלחץ חיובי.

מיצוי פאזה מוצקה (solid phase extraction) באמצעות מיקרו-פלטה של חליפת קטיונים במוד מעורב מאפשר ניקוי דגימה והעשרה סימולטניים של 3-nitrotyrosine במיצוי יחיד. יש להכין את פלטת המיצוי על ידי העברת 200 µL של מתנול בדרגת LC-MS דרך הסורבנט. סובב את כפתור כיוון הלחץ במעבד הלחץ החיובי כדי לקבוע לחץ חיובי נמוך, באופן שיאפשר לתערובת לזרום דרך הסורבנט לאט, תוך התאמת הלחץ במידת הצורך.

בצע שיווי משקל על ידי העברת 200 µL של מים בדרגת LC-MS עם 2% formic acid דרך הסורבנט. באמצעות פיפט שמונה-ערוצי, טעון בזהירות את כל הנפח של כל אחת מהדגימות שהערבבו מראש אל לוח המיצוי שעבר התנייה. הגדר לחץ חיובי נמוך במעבד הלחץ החיובי כדי לאפשר לתערובת לזרום דרך הסורבנט לאט, תוך התאמת הלחץ לפי הצורך.

לאחר מכן, שטפו את הבארות על ידי העברת 200 µL של מים בדרגת LC-MS עם 2% formic acid דרך הסורבנט. לאחר שטיפה עם 200 µL של methanol ומים, הגדירו את מעבד הלחץ החיובי ללחץ גבוה כדי לייבש את הבארות. ברגע שהבארות יבשות, החליפו את המאגר בלוח איסוף נקי של 96 בארות בנפח 2 mL.

כעת, יש להוסיף 50 µL של תמיסת ammonium acetate בריכוז 25 mM כדי להבליט (elute) באיטיות את האנליט שנשאר ואת התקן הפנימי מלוחית המיצוי. לאחר מכן, יש להוסיף 50 µL של מים בדרגת LC-MS עם 5% formic acid כדי לנטרל את התמיסה שנבלטה. השימוש בתמיסת ammonium acetate מרוככת לצורך בליטת 3-nitrotyrosine מספק שיפור משמעותי בסלקטיביות וברגישות.

ערבב את הדגימות באמצעות פיפט שמונה-ערוצי שלוש פעמים כהכנה לניתוח כרומטוגרפיה נוזלית מספקטרומטריית מסות בטור (LC-MS/MS). לאחר הגדרת מכשיר ה-LC-MS/MS, בצע שיווי משקל לשיטת ה-LC-MS/MS עבור 3-nitrotyrosine למשך 10 דקות באמצעות אלואציה של גרדיאנט ה-LC. על ידי ביצוע שיווי משקל לשיטה, גרדיאנט ה-LC יגיע למצב של שיווי משקל עם אלואציית הגרדיאנט הראשונית.

טמפרטורת הדוגם האוטומטי תכוון ל-4 °C וטמפרטורת התנור תכוון ל-30 °C. צרו רשימת סדרה (batch list) הכוללת את דגימות השתן, התמיסות הסטנדרטיות ודגימות בקרת האיכות (QC). לאחר מכן, התחילו את הסדרה על ידי הזרקת הדגימות שהוכנו.

לאחר השלמת כל ההזרקות, הגדירו עקומת סטנדרט בטווח של 10 עד 2,500 picograms per milliliter לצורך כימות של 3-nitrotyrosine, באמצעות רגרסיה לינארית של יחס שטח השיא של 3-nitrotyrosine לסטנדרט פנימי אל מול ריכוז ה-3-nitrotyrosine הנומינלי. לבסוף, כמתו את שאר הדגימות באמצעות עקומת הסטנדרט שהוגדרה, וקבעו האם דגימות ה-QC נמצאות בטווח שנקבע. נתוני LC של דגימות שתן אנושיות מראים כי 3-nitrotyrosine מופרד כרומטוגרפית מאנלוגים אחרים של tyrosine בעלי מבנה דומה תחת התנאים המותאמים, דבר שמונע הפרעות של אלוציה משותפת (co-eluting) עקב תרכובות אלו הנמצאות בכמויות גדולות באופן משמעותי, ובכך משפר את רמת הסלקטיביות של הבדיקה.

לא נצפה אות של 3-nitrotyrosine בכרומטוגרמה של ה-multiple reaction monitoring של דגימת הבלנק הכפול, מה שמעיד על כך ש-3-nitrotyrosine אינו נוצר במהלך התהליך כולו. מוצגות כאן כרומטוגרמות multiple reaction monitoring מייצגות של 3-nitrotyrosine ושל סטנדרט פנימי עבור אדם בריא. לא נצפו אותות מפריעים בזמני השהייה של 3-nitrotyrosine ושל הסטנדרט הפנימי.

עקומת סטנדרט מייצגת מוצגת כאן. גבול הגילוי, המוגדר כהריכוז הנמוך ביותר עם יחס אות לרעש הגבוה משלושה, נקבע כ-2 picograms per milliliter. הגבול התחתון של הכמות נקבע כ-10 picograms per milliliter ומוגדר כהריכוז הנמוך ביותר בטווח של 20% של חוסר דיוק ודיוק עם יחס אות לרעש הגבוה מ-10.

בדיקת האינטגרציה המכווננת מספקת שיפור משמעותי בספציפיות, ברגישות ובקיבולת (throughput), לצד הפחתה באפקט המטריצה, בשימוש בסופח ובפינוי הפסולת. באמצעות בדיקה פשוטה ומהירה זו, ניתן לעבד דגימת שתן בתוך 24 שעות. יש לקחת בחשבון את העובדה שדגימת השתן היא לא פולשנית ואינה יקרה.

שיטה משופרת להפליא זו מתאימה היטב להערכת תפקידו של 3-nitrotyrosine כסמן ביולוגי לעקה חמצונית במחקרים פרה-קליניים וקליניים.