Name: בידוד של תאים ראשיים Murine הרשתית גנגליון (RGCs) על ידי זרימת cytometry (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: למדו לבודד תאי רשתית גנגליון (RGCs) מעכברים בשיטת זרימת cytometry. פרוטוקול מהיר וסטנדרטי זה מאפשר בידוד אוכלוסייה עשירה של תאים חיים לחקר מחלות ניווניות ברשתית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות למר טים היגינס, מאייר בכיר מהמחלקה למיקרוביולוגיה, אימונולוגיה וביוכימיה, לסיוע טכני טכני; ד&quot;ר מתיו ווילסון לדיונים ולחברי המעבדות של ג&#39;בלונסקי ומוראלס-טיראדו על הערותיהם המועילות. עבודה זו נתמכה על ידי מכון המחקר Alcon Research Young Investigator Award (VMM-T), אוניברסיטת Tennessee Research Foundation (VMM-T), המכון הלאומי Eye EY021200 (MMJ), אחוות Gerwin (VMM-T); את אחוות גרובין לפני הדוקטורט (ZKG), את מחלקת המחקר הרפואי של צבא ההגנה ואת פקודת המטען (VMM-T) ואת המענק הבלתי מוגבל ממחקר למניעת עיוורון.

<ol><li>Flammer, J., Orgul, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+nerve+blood-flow+abnormalities+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Optic nerve blood-flow abnormalities in glaucoma.</a> Prog Retin Eye Res. 17 (2), 267-289 (1998).</li>
<li>Bathija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+nerve+blood+flow+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Optom%22%5BJournal%5D)">Optic nerve blood flow in glaucoma.</a> Clin Exp Optom. 83 (3), 180-184 (2000).</li>
<li>Osborne, N. N., Melena, J., Chidlow, G., Wood, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hypothesis+to+explain+ganglion+cell+death+caused+by+vascular+insults+at+the+optic+nerve+head%3A+possible+implication+for+the+treatment+of+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">A hypothesis to explain ganglion cell death caused by vascular insults at the optic nerve head: possible implication for the treatment of glaucoma.</a> Br J Ophthalmol. 85 (10), 1252-1259 (2001).</li>
<li>Morgan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulation+and+axonal+transport+in+the+optic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Circulation and axonal transport in the optic nerve.</a> Eye (Lond). 18 (11), 1089-1095 (2004).</li>
<li>Tian, N., Hwang, T. N., Copenhagen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+excitatory+and+inhibitory+spontaneous+synaptic+activity+in+mouse+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of excitatory and inhibitory spontaneous synaptic activity in mouse retinal ganglion cells.</a> J Neurophysiol. 80 (3), 1327-1340 (1998).</li>
<li>Schmidt, K. G., Bergert, H., Funk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+diseases+of+the+retina+and+potential+for+protection+and+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Neuropharmacol%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative diseases of the retina and potential for protection and recovery.</a> Curr Neuropharmacol. 6 (2), 164-178 (2008).</li>
<li>Dreher, B., Sefton, A. J., Ni, S. Y., Nisbett, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphology%2C+number%2C+distribution+and+central+projections+of+Class+I+retinal+ganglion+cells+in+albino+and+hooded+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Evol%22%5BJournal%5D)">The morphology, number, distribution and central projections of Class I retinal ganglion cells in albino and hooded rats.</a> Brain Behav Evol. 26 (1), 10-48 (1985).</li>
<li>Williams, R. W., Strom, R. C., Rice, D. S., Goldowitz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+environmental+control+of+variation+in+retinal+ganglion+cell+number+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic and environmental control of variation in retinal ganglion cell number in mice.</a> J Neurosci. 16 (22), 7193-7205 (1996).</li>
<li>Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+cell+populations+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The major cell populations of the mouse retina.</a> J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).</li>
<li>Surgucheva, I., Weisman, A. D., Goldberg, J. L., Shnyra, A., Surguchov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-synuclein+as+a+marker+of+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Gamma-synuclein as a marker of retinal ganglion cells.</a> Mol Vis. 14, 1540-1548 (2008).</li>
<li>Nadal-Nicolas, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brn3a+as+a+marker+of+retinal+ganglion+cells%3A+qualitative+and+quantitative+time+course+studies+in+naive+and+optic+nerve-injured+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (8), 3860-3868 (2009).</li>
<li>Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+binding+protein+with+multiple+splicing%3A+a+new+marker+for+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">RNA binding protein with multiple splicing: a new marker for retinal ganglion cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (2), 1052-1058 (2010).</li>
<li>Van Bergen, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recharacterization+of+the+RGC-5+retinal+ganglion+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Recharacterization of the RGC-5 retinal ganglion cell line.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (9), 4267-4272 (2009).</li>
<li>Wood, J. P., Chidlow, G., Tran, T., Crowston, J. G., Casson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+differentiation+protocols+for+RGC-5+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">A comparison of differentiation protocols for RGC-5 cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (7), 3774-3783 (2010).</li>
<li>Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological%2C+morphological%2C+and+electrophysiological+variation+among+retinal+ganglion+cells+purified+by+panning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning.</a> Neuron. 1 (9), 791-803 (1998).</li>
<li>Hong, S., Iizuka, Y., Kim, C. Y., Seong, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+mouse+retinal+ganglion+cells+using+immunopanning-magnetic+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary mouse retinal ganglion cells using immunopanning-magnetic separation.</a> Mol Vis. 18, 2922-2930 (2012).</li>
<li>Julius, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sensitivity+of+exponentials+and+other+curves+to+their+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Biomed+Res%22%5BJournal%5D)">The sensitivity of exponentials and other curves to their parameters.</a> Comput Biomed Res. 5 (5), 473-478 (1972).</li>
<li>Reif, A. E., Allen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Akr+Thymic+Antigen+and+Its+Distribution+in+Leukemias+and+Nervous+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The Akr Thymic Antigen and Its Distribution in Leukemias and Nervous Tissues.</a> J Exp Med. 120, 413-433 (1964).</li>
<li>Watanabe, M., Noguchi, T., Tsukada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional%2C+cellular%2C+and+subcellular+distribution+of+Thy-1+antigen+in+rat+nervous+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">Regional, cellular, and subcellular distribution of Thy-1 antigen in rat nervous tissues.</a> Neurochem Res. 6 (5), 507-519 (1981).</li>
<li>Haeryfar, S. M., Hoskin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thy-1%3A+more+than+a+mouse+pan-T+cell+marker%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thy-1: more than a mouse pan-T cell marker.</a> J Immunol. 173 (6), 3581-3588 (2004).</li>
<li>Sahagun, G., Moore, S. A., Fabry, Z., Schelper, R. L., Hart, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+murine+endothelial+cell+cultures+by+flow+cytometry+using+fluorescein-labeled+griffonia+simplicifolia+agglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Purification of murine endothelial cell cultures by flow cytometry using fluorescein-labeled griffonia simplicifolia agglutinin.</a> Am J Pathol. 134 (6), 1227-1232 (1989).</li>
<li>Shoge, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+retinal+ganglion+cells+culture+enriched+with+the+magnetic+cell+sorter%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Rat retinal ganglion cells culture enriched with the magnetic cell sorter.</a> Neurosci Lett. 259 (2), 111-114 (1999).</li>
<li>Chintalapudi, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Molecular+Profiling+of+Primary+Mouse+Retinal+Ganglion+Cells%3A+Comparison+of+Phenotypes+from+Healthy+and+Glaucomatous+Retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Isolation and Molecular Profiling of Primary Mouse Retinal Ganglion Cells: Comparison of Phenotypes from Healthy and Glaucomatous Retinas.</a> Front Aging Neurosci. 8, 93(2016).</li>
<li>Nagdeve, N. G., Yaddanapudi, S., Pandav, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+different+doses+of+ketamine+on+intraocular+pressure+in+anesthetized+children%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatr+Ophthalmol+Strabismus%22%5BJournal%5D)">The effect of different doses of ketamine on intraocular pressure in anesthetized children.</a> J Pediatr Ophthalmol Strabismus. 43 (4), 219-223 (2006).</li>
<li>Ding, C., Wang, P., Tian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+general+anesthetics+on+IOP+in+elevated+IOP+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of general anesthetics on IOP in elevated IOP mouse model.</a> Exp Eye Res. 92 (6), 512-520 (2011).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C%28T%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li>
<li>Aerts, J., Nys, J., Arckens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+reproducible+and+straightforward+method+to+perform+in+vivo+ocular+enucleation+in+the+mouse+after+eye+opening%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A highly reproducible and straightforward method to perform in vivo ocular enucleation in the mouse after eye opening.</a> J Vis Exp. (92), e51936(2014).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+AP-2delta+reduces+retinal+ganglion+cell+numbers+and+axonal+projections+to+the+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Loss of AP-2delta reduces retinal ganglion cell numbers and axonal projections to the superior colliculus.</a> Mol Brain. 9 (1), 62(2016).</li>
<li>Moshiri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+complete+loss+of+retinal+ganglion+cells+in+the+math5%2Fbrn3b+double+knockout+elicits+severe+reductions+of+other+cell+types+during+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Near complete loss of retinal ganglion cells in the math5/brn3b double knockout elicits severe reductions of other cell types during retinal development.</a> Dev Biol. 316 (2), 214-227 (2008).</li>
<li>Danias, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+retinal+ganglion+cell+%28RGC%29+loss+in+aging+DBA%2F2NNia+glaucomatous+mice%3A+comparison+with+RGC+loss+in+aging+C57%2FBL6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of retinal ganglion cell (RGC) loss in aging DBA/2NNia glaucomatous mice: comparison with RGC loss in aging C57/BL6 mice.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (12), 5151-5162 (2003).</li>
<li>Jakobs, T. C., Ben, Y., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD15+immunoreactive+amacrine+cells+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">CD15 immunoreactive amacrine cells in the mouse retina.</a> J Comp Neurol. 465 (3), 361-371 (2003).</li>
<li>Uusitalo, M., Schlotzer-Schrehardt, U., Kivela, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+localization+of+the+HNK-1+carbohydrate+epitope+to+glial+and+neuronal+cells+of+the+human+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural localization of the HNK-1 carbohydrate epitope to glial and neuronal cells of the human retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (3), 961-964 (2003).</li>
<li>Jackson, C. J., Garbett, P. K., Nissen, B., Schrieber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+human+endothelium+to+Ulex+europaeus+I-coated+Dynabeads%3A+application+to+the+isolation+of+microvascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Binding of human endothelium to Ulex europaeus I-coated Dynabeads: application to the isolation of microvascular endothelium.</a> J Cell Sci. 96 ( Pt 2), 257-262 (1990).</li>
<li>Pennartz, S., Perraut, M., Pfrieger, F. Purification of retinal ganglion cells from postnatal rats by magnetic cell sorting. MACSmore. 12 (2), 16-18 (2010).</li>
<li>Nadal-Nicolas, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Displaced+retinal+ganglion+cells+in+albino+and+pigmented+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Displaced retinal ganglion cells in albino and pigmented rats.</a> Front Neuroanat. 8, 99(2014).</li>
<li>Nadal-Nicolas, F. M., Salinas-Navarro, M., Vidal-Sanz, M., Agudo-Barriuso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+methods+to+trace+retinal+ganglion+cells+with+fluorogold%3A+from+the+intact+optic+nerve+or+by+stereotactic+injection+into+the+optic+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Two methods to trace retinal ganglion cells with fluorogold: from the intact optic nerve or by stereotactic injection into the optic tract.</a> Exp Eye Res. 131, 12-19 (2015).</li>
<li>Barnstable, C. J., Drager, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thy-1+antigen%3A+a+ganglion+cell+specific+marker+in+rodent+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Thy-1 antigen: a ganglion cell specific marker in rodent retina.</a> Neuroscience. 11 (4), 847-855 (1984).</li>
<li>Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+labeling+of+retinal+ganglion+cells+by+application+of+fluoro-gold+on+the+surface+of+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

FACS היא טכניקה של בחירה כדי לטהר אוכלוסיות תאים. שיטות בידוד אחרות כוללות immunopanning, חרוזים מגנטיים, ואת ההשלמה קיבעון משלים. היתרון של FACS על פני מתודולוגיות אחרות אלה מבוסס על זיהוי סימולטני של סמנים פני השטח עם דרגות שונות של אינטנסיביות. עוצמת הניאון של המולקולה פרופורציונלית לכמות ביטוי החלבון. עד כה, הבידוד של RGCs התבסס רק על חיוביות Thy1 (CD90) ו CD48 negativity 15 , 16 , 22...

RGCs הם נוירונים מובחנים סופנית, ולכן, תאים ראשוניים נדרשים לצורך ניסויים. הפיתוח של פרוטוקול לבידוד והעשרה של תאים ראשוניים של תאית גנגליון Murine (RGCs) הוא היסוד לחשוף את המנגנונים של בריאות RGC וניוון במבחנה . זה חשוב במיוחד עבור מחקרים המבקשים ליצור טיפולים פוטנציאליים כדי לקדם את הפונקציה RGC כדי למזער את מותם. התנוונות של RGCs קשורה למחלות ניווניות של הרשתית, כגון גלאוקומה, רטינופתיה סוכרתית והזדקנות נורמלית. למרות שהמנגנונים הסלולריים הספציפיים שבבסיס אובדן RGC אינם ברורים, זוהתה סדרה של גורמי סיכון. חוסר חמצון בראש עצב הראייה 1 , 2 , 3 גורם מוות RGC 4 ופועל כהפרעה של הומאוסטזיס בין ההפעלה של exitatory ואניקולטנים nititory בתוך RGCs בודדים 5 , 6 . שורה של אתגרים מעכבים את ההתקדמות לקראת השימוש בתאים אלה ללימודים מעמיקים. ראשית, מספר RGCs הנוכחי ברשתית Murine הוא קטן. RGCs חשבון עבור פחות מ 1% מכלל תאים הרשתית 7 , 8 , 9 . שנית, רוב RGC ספציפיים סמנים הם תאיים חלבונים 10 , 11 , 12 . הבחירה מבוססת על סמנים אלה משאיר את התאים שאינם קיימא, אשר מונע ניתוח במורד הזרם. לבסוף, הפרוטוקולים הקיימים כיום הם ארוכים וחסרים סטנדרטיזציה 13 , 14 . מוקדם פרוטוקולים בידוד RGC התבססו על שיטות immunopanning. Barres et al. 15 התאימו את החסימה הקלאסיתטכניקה anning והוסיף צעד שני, אשר כלל מונוציטים ותאי האנדותל מהחלק הארי של תאים רשתית לפני הבחירה החיובית המבוססת על אימונוספיטיביות לאנטיגן אנטי תימוציטים (aka Thy1), סמן משטח התא. שנים לאחר מכן, הונג et al. בשילוב טכניקות בידוד מגנטי חרוז עם אסטרטגיות מיון תאים לבודד RGCs עם טוהר 16 . השימוש חרוזים מגנטיים עדיין בשימוש ביישומים מדעיים רבים. יחד, חרוזים מגנטיים ו cytometry זרימת פרוטוקולים שיפרה את הטוהר של תאים בודדים. עם זאת, מערכות טיהור אלה עדיין לא תוקנו לבידוד של RGCs Murine מ Retinae מנותק. זרימת cytometry היא שיטה אנליטית חזקה המודד את המאפיינים אופטיים פלואורסצנטי של השעיות התא. תאים ניתוחים הן כמותית והן איכותית עם רמה גבוהה של רגישות, מתן ניתוח רב מימדי של התא populAtion. האפליה הסלולארית מתבססת על שני מאפיינים פיזיים עיקריים: גודל התא או שטח הפנים והפרשנות או המורכבות הפנימית 17 . ניתוח רב מימדי ניתן לבצע על ידי שילוב של נוגדנים מתוייגים עם fluorochromes כי יש אורכי גל דומים ו פליטות שונות. זרימת cytometry הוא מהיר, לשחזור, ורגיש. לייזרים multitpe היתר אפילו רב יותר מימדי מנתח של תאים בודדים על ידי cytometry הזרימה. לפיכך, זוהי מתודולוגיה אטרקטיבית לחקר דגימות ציטולוגיות. פלואורסצנטי מופעלת תא מיון (FACS) משתמשת הבדלים פנוטיפי רב מימדי מזוהים על ידי cytometry הזרימה למיין תאים בודדים לתוך subpopulations נפרד. בעשור האחרון, משטח מרובה חלבונים תאיים זוהו כסמנים ביולוגיים פוטנציאליים עבור הבחירה של תאים, כולל נוירונים. מחקרים ראשוניים שביקשו לבודד RGCs של חולדות השתמשו Thy1 כמו cel גנגליוןסמן. למרבה הצער, Thy1, aka CD90, יש מספר איסופורמים במינים אחרים מכרסם 18 , 19 , 20 והוא בא לידי ביטוי על ידי מספר סוגי תאים ברשתית 19 , 20 , מה שהופך אותו סמן שאינו ספציפי עבור RGCs. סמן נוסף, CD48, נמצא על אוכלוסיות מונוציטיות ברשתית, כולל מקרופאגים ומיקרוגליאה. באמצעות שני אלה סמנים פני השטח, שונה RGC חתימה- Thy1 + ו CD48 Neg תאים - פותחה 15 , 16 , 21 , 22 . למרבה הצער, אלה שני קריטריונים לבחירה אינם מספיקים כדי לבחור עבור האוכלוסייה RGC מועשר מאוד. כדי לענות על צורך זה unmet, פרוטוקול cytometry זרימה פותחה 23 מבוסס על רב שכבתית בחירה חיובית ושלילית קריטריונים usiNg ידוע סמנים משטח התא כדי להעשיר ולטהר RGCs Murine העיקרי.

<table><tbody><tr><td>נגד עכבר CD15 PE</td><td>BioLegend</td><td>125606</td><td>שיבוט MC-480</td></tr><tr><td>נגד עכבר CD48 PE-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>103424</td><td>שיבוט HM48-1</td></tr><tr><td>נגד עכבר CD57</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6680-100TST</td><td>שיבוט VC1.1</td></tr><tr><td>נגד עכבר CD90.2 AF700</td><td>BioLegend</td><td>105320</td><td>שיבוט 30-H12</td></tr><tr><td>סגול מבריק 421 עז נגד עכבר IgG</td><td>BioLegend</td><td>405317</td><td>שיבוט Poly4053</td></tr><tr><td>מטוהר נגד עכבר CD16/32</td><td>BioLegend</td><td>101302</td><td>בלוק FcgRII/III, שיבוט 93</td></tr><tr><td>זומבי אקווה&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>423102</td><td>אפליה בין תאים חיים / תאים מתים</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td>ממקור ארה"</td></tr>ב <tr><td>AbC ערכת חרוזים לפיצוי נוגדנים כולל Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A10497</td><td>רב מינים Ig</td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103049</td><td>הוסף סרום למדיה לפני התרבית.</td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049</td><td>תמיסת</td></tr><tr><td>מלח דיסקציה מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td>SZ-PT דגם</td><td>סטריאו מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>סורוול צנטריפוגה</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>ST 16R</td><td>כל הצנטריפוגות שבוצעו&nbsp;</td></tr><tr><td>בצלחת בסיס RT &ndash; דיסקציה Pan</td><td>Fisher Scientific</td><td>SB15233FIM</td><td>ניתן להשתמש גם בצלחת שעווה</td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>Aesculap</td><td>5002-7</td><td>4 &frac12; אינץ'</td></tr><tr><td>מספריים איריס, ישר</td><td>Aesculap</td><td>1360</td><td>5 &frac12; אינץ'</td></tr><tr><td>פלקון 15 מ"ל צינורות חרוטיים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>352097</td><td>צינורות פוליפרופילן</td></tr><tr><td>פלקון 50 מ"ל צינורות חרוטיים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>צינורות</td><td>פוליפרופילן</td></tr><tr><td>352098 צינורות BD FACS</td> צינורות <td>פישר סיינטיפיק</td><td>352003</td><td>פוליפרופילן</td></tr><tr><td>40 מ"מ כלים</td><td>MidSci</td><td>TP93040</td><td>תרבית רקמות מטופלת</td></tr><tr><td>70 &mu; מסננת ניילון M</td><td>MidSci</td><td>70ICS</td><td>סטרילית</td></tr><tr><td>40 &mu; מסננת ניילון M</td><td>MidSci</td><td>40ICS</td><td>סטרילי</td></tr><tr><td>&nbsp; מזרק BD 10 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>301604</td><td>מזרק חד פעמי ללא מחט</td></tr><tr><td>עליים</td><td>MidSci</td><td>PEST</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני חיטה סטריליים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>986734</td><td>ללא אניה</td></tr><tr><td>BD 30 גרם מחט פישר</td><td>סיינטיפיק</td><td>305128</td><td>1 אינץ'</td></tr><tr><td>Hausser Scientific Bright-Line תא ספירת זכוכית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>0267151B</td><td>המוציטומטר</td></tr><tr><td>Gibco טריפן כחול 0.4% תמיסה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>15250061</td><td>כדאיות צבע</td></tr><tr><td>צינורות אפנדורף</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>05-402-25</td><td>1.5 מ"ל</td></tr><tr><td>EVOS פלואיד הדמיית תאים</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>447113</td><td>הדמיית פלואורסצנטי עם אובייקט 20X</td></tr><tr><td>100% אתנול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>04-355-452</td><td>משמש לייצור 70% אתנול</td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS פיפטה L-1000XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014282</td><td>LTS</td></tr><tr><td>פיפטה Pipet-Lite LTS פיפטה L-200XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014391</td><td>LTS פיפטה</td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS פיפטה L-20XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014392</td><td>LTS מתלה פיפטות</td></tr><tr><td>LTS 1000 מ"ל &ndash; GPS-L1000S</td><td>Rainin</td><td>17005088</td><td>מתלה כחול מתלה טיפים סטריליים</td></tr><tr><td>מתלה LTS 250 מ"ל &ndash; GPS-L250S</td><td>Rainin</td><td>17005092</td><td>מתלה ירוק מתלה סטרילי</td></tr><tr><td>טיפים מתלה LTS 20 מ"ל &ndash; GPS-L10S</td><td>Rainin</td><td>17005090</td><td>מתלה אדום טיפים סטריליים</td></tr><tr><td>FACSAria II Cell Sorter</td><td>BD Biosciences</td><td>N / A</td><td>הזמנה מותאמת אישית</td></tr><tr><td>LSR II Cymeter</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>הזמנה מותאמת אישית</td></tr><tr><td>Abca8a</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00462440_m1</td><td>M&uuml; ller cells</td></tr><tr><td>Aldh1al</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00657317_m1</td><td>M&uuml; ller cells</td></tr><tr><td>Aqp4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00802131_m1</td><td>Astrocytes</td></tr><tr><td>Calb2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00801461_m1</td><td>Amacrine, Horizontal</td></tr><tr><td>Cd68</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm03047340_m1</td><td>תאי אפיתל פיגמנט רשתית</td></tr><tr><td>Gad2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00484623_m1</td><td>Amacrine</td></tr><tr><td>Hprt</td><td>Thermo Fisher Scientific Mm01545399_m1</td><td></td><td>שמירת בית gene</td></tr><tr><td>Lhx1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm01297482_m1</td><td>Horizontal</td></tr><tr><td>Lim2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00624623_m1</td><td>Horizontal</td></tr><tr><td>Nrl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00476550_m1</td><td>Photoreceptors</td></tr><tr><td>Ntrk1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm01219406_m1</td><td>Horizontal</td></tr><tr><td>Pcp4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00500973_m1</td><td>דו קוטבי, Amacrine</td></tr><tr><td>Pou4f1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm02343791_m1</td><td>תאי</td></tr> <tr>גנגליון ברשתית<td>Prdx6</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00725435_s1</td><td>Astrocytes</td></tr><tr><td>Prkca</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00440858_m1</td><td>Bipolar</td></tr><tr><td>Prox1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00435969_m1</td><td>Horizontal</td></tr><tr><td>Pvalb</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00443100_m1</td><td>Amacrine</td></tr><tr><td>Rbpms</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm02343791_m1</td><td>תאי גנגליון רשתית</td></tr><tr><td>Rom1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00436364_g1</td><td>Photoreceptors</td></tr><tr><td>Rpe65</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00504133_m1</td><td>תאי אפיתל פיגמנט רשתית</td></tr><tr><td>Slc1a3</td><td>Thermo Fisher Mm00600697_m1 מדעי</td><td></td><td>אסטרוציטים</td></tr><tr><td>Slc6a9</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00433662_m1</td><td>Amacrine</td></tr><tr><td>Sncg</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00488345_m1</td><td>תאי גנגליון רשתית</td></tr> <tr><td>Tubb3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00727586_s1</td><td>תאי גנגליון רשתית</td></tr> <tr><td>Vim</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm01333430_m1</td><td>M&uuml; תאי ller</td></tr><tr><td>Taqman Universal Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4440047</td><td>qPCR Reagent</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>בידוד RNA</td></tr><tr><td>SuperScript VILO cDNA ערכת סינתזה</td><td>תרמו פישר</td><td>11754250</td><td>סינתזת cDNA</td></tr><tr><td>Taqman PreAmp Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4391128</td><td>שלב הגברה מראש</td></tr><tr><td>BD Cytofix / Cytoperm</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td>קיבוע / מאגר פרמביליזציה</td></tr><tr><td>BD סלסול / שטיפה</td><td>BD Biosciences</td><td>554723</td><td>תמיסת חדירות</td></tr><tr><td>RBPMS</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-86815</td><td>נוגדן תוך-תאי</td></tr><tr><td>SNCG</td><td>Gene Tex</td><td>GTX110483</td><td>נוגדן תוך-תאי</td></tr><tr><td>BRN3A</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>נוגדן תוך-תאי</td> <td>SC-8429</td></tr><tr><td>TUJ1</td><td>BioLegend</td><td>801202</td><td>נוגדן תוך-תאי</td></tr></tbody></table>

בידוד של תאים ראשיים murine הרשתית גנגליון (rgcs) על ידי זרימת cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

מחלות ניווניות לעיתים קרובות יש השפעה הרסניות על אלה שנפגעו. תא גנגליון התא (RGC) הפסד הוא מעורב במערך של מחלות, כולל רטינופתיה סוכרת וגלאוקומה, בנוסף להזדקנות נורמלית. למרות החשיבות שלהם, RGCs כבר מאוד קשה ללמוד עד עכשיו בין השאר בשל העובדה שהם מהווים רק אחוז קטן של מגוון רחב של תאים ברשתית. בנוסף, שיטות בידוד הנוכחי להשתמש סמנים תאיים כדי לזהות RGCs, אשר מייצרים תאים שאינם קיימא. טכניקות אלה כוללות גם פרוטוקולי בידוד ארוכים, ולכן יש חוסר שיטות מעשיות, סטנדרטי, אמין כדי להשיג ולבודד RGCs. עבודה זו מתארת ​​שיטה יעילה, מקיפה ואמינה לבידוד RGCs ראשוניים מעכברים retinae באמצעות פרוטוקול המבוסס על קריטריונים לבחירה חיובית ושלילית. השיטות המוצגות מאפשרות את המחקר העתידי של RGCs, במטרה להבין טוב יותר את העיקרוןירידה בחדות הראייה הנובעת מאובדן RGCs תפקודית במחלות ניווניות.

<html> המחקר מעמיק של RGCs מונע על ידי גורמים רבים, כולל תדירות נמוכה שלהם ואת חוסר מתודולוגיה חזקה ומתוקננת לבידוד שלהם. איור 1 מציג את המתודולוגיה המשמשת לבידוד retinae. וריאציות בהליך enucleation קיימות על סמך סוג הניתוח, כגון אם האנקלאציה היא חלק מהניסוי של vivo 27 . Enucleation בפרוטוקול זה מבוצע על עכברים מורדמים. כפי שמוצג בתרשים 1A -B</strong...

מיליוני אנשים סובלים ממחלות ניוונית של הרשתית הגורמות עיוורון בלתי הפיך. מרכיב נפוץ של רבים ממחלות אלה הוא אובדן תאי הגנגליון ברשתית (RGCs). פרוטוקול מפורט זה מתאר את הבידוד של RGCs Murine העיקרי על ידי בחירה חיובית ושלילית עם cytometry הזרימה.

בידוד של תאים ראשיים Murine הרשתית גנגליון (RGCs) על ידי זרימת cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לבודד אוכלוסייה הומוגנית ומועשרת של תאי גנגליון רטינליים ראשוניים של עכבר. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות בתחום של תאי גנגליון רטינליים בנוגע למנגנונים העומדים בבסיס הירידה בחדות הראייה באוכלוסיות מזדקנות ובאוכלוסיות הסובלות ממחלות ניווניות של הרשתית. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מציעה פרוטוקול מהיר, נראה לעין, הניתן לשחזור וסטנדרטי לבידוד של תאי גנגליון רטינליים ראשוניים מועשרים של עכבר.הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר סומנה צ'ינטאלפודי (Sumana Chintalapudi), שהייתה אז סטודנטית לתואר שני במעבדתי והמחברת הראשונה של מחקר זה, הציגה במועדון כתבי העת שלנו מאמר משנת 2013 של קרישנה מורתיאדול (Krishna Murtheadol); מחקרם הדגים בבירור שקו התאים RGC five, שנוצר במקור כקו תאים של תאי גנגליונים ברשתית של חולדה שהושרת להם חיי אלמוות, כבר לא היה ממקור של חולדה, ולא הפגין את הפנוטיפ של RGC. היה זה ברור לנו כי בעיה זו השאירה פער גדול במשאבים הזמינים לקהילת מחקרי הראייה, כולל במעבדה שלנו. סומנה ואני יצרנו קשר עם ד"ר מוראלס-טיראדו (Dr. Morales-Tirado), ושלושתנו פיתחנו יחד שיטה חדשה לבידוד תאי RGC חיים ומעשירים מאוד.בדרך כלל, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקלו בקשיים, כיוון שמטרות השיטה הן לבודד אוכלוסיית תאים חיה ומעשירה מאוד, שניתן לטפח כתאים ראשוניים או להנציח כקו תאים. בשל כך, יש להיזהר מאוד שלא לפגוע בתאים שאותם מנסים לבודד. בנוסף, יש להתאים את הפרמטרים של שיטת מיון התאים לסוג התאים הספציפיים שמבקשים לבודד.שתי השיטות דורשות מערך מיומנויות מיוחד. את הפרוצדורות ידגימו ד"ר Xiang Di Wang, עמית מחקר מהמעבדה של ד"ר Jablonski, ומר Zach Goldsmith, דוקטורנט מהמעבדה שלי. כדי לבצע דנוקליאציה (הוצאה) של העין, יש להחדיר תחילה פינצטה מתחת לגלגל העין.אחזו בעצב האופטי ומשכו כלפי מעלה. גלגל העין יחלץ כאשר העצב האופטי שלם. הניחו את העין במבחנה עם PBS על קרח, וחלצו את העין השנייה.לאחר איסוף כל העיניים, הניחו עין אחת בצלחת פטרי עם PBS טרי תחת מיקרוסקופ דיסקציה, והשתמשו בפינצטה כדי לתפוס בזהירות את גלגל העין בבסיס העצב האופטי. בעזרת מחט חדה בנפח 30 gauge, נקבו את הקרנית כדי לאפשר לנוזל העין (aqueous humor) להתנקז, דבר המקל על החזקת העין באמצעות הפינצטה. תוך כדי החזקת הקרנית בפינצטה, השתמשו במספריים כדי לבצע חתך קטן ברקמת הקרנית, והשתמשו בפינצטה כדי לקלף בעדינות את הקרנית ואת הלובנה (sclera).כאשר גלגל העין קולף עד למחציתו, השתמשו בפינצטה כדי להוציא את הרשתית ואת העדשה. הניחו את הרשתית בתוך צלחת פטרי קטנה בקוטר 40 millimeter המכילה PBS ו-1%FPS בתוך קבינה לבטיחות ביולוגית, ושטפו את הרשתית שלוש פעמים ב-PBS טרי בתוספת FBS עבור כל שטיפה. לאחר שכל העיניים נשטפו, הניחו עד 12 רשתית על מסננת ניילון סטרילית של 70 micron המולחחת ב-PBS וב-FBS, ומעכו בעדינות את הרשתית באמצעות הקצה האחורי של בוכנה של מזרק 10 milliliter, תוך כדי תנועה סיבובית.כאשר כל התאים התפרקו, הניחו את המסננת מעל מבחנת איסוף מפוליפרופילן והשתמשו בפיפט P1000 כדי לסנן את התאים דרך המסננת אל תוך מבחנת האיסוף. שטפו את המסננת ב-PBS וב-FBS, ואספו את נוזלי השטיפה למבחנת האיסוף. הוסיפו מספיק PBS בתוספת FBS כדי להביא את הנפח הסופי ל-1 ml של תמיסה לכל רשתית, ואספו את התאים באמצעות סנטריפוגציה.לאחר מכן, אם סימון אימונו-היסטוכימי (immunolabeling) אמור להתבצע באופן מיידי, השעו את המשקע ב-PBS בתוספת FBS בריכוז של מיליליטר אחד של מצע לכל חמש רשתיות. לחלופין, הדגרירו את התאים שהושעו במצע לתאי עצב למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C במצב אופקי. כדי לסמן אימונו-היסטוכימית את תאי הרשתית, סבבו את תגלי התאי הרשתית בצנטריפוגה, והשעו את המשקע ב-50 µL של PBS טרי בתוספת FBS בתוך מבחנה מסוג fax.הפרידו חמישה תאים של 10⁶ עבור ביקרת השלילה ללא סימון. לאחר מכן, חסמו כל קישור לא ספציפי לקולטן FC בכל מבחנה באמצעות מיקרוליטר אחד של נוגדן anti mouse CD 16 32 לכל 10⁶ תאים, למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. בתום דגירת החסימה, הוסיפו לתאים את תערובת הנוגדנים הרצויה באמצעות פיפוט עדין, לדגירה של 30 דקות על קרח בהגנה מאור.לאחר מכן, שטפו את התאים פעמיים בנפח סופי של PBS ו-FBS. סמנו את התאים באמצעות נוגדן שני מתאים למשך 30 דקות נוספות על קרח, תוך הגנה מאור, ולאחר מכן בצעו שתי שטיפות ב-PBS בתוספת FBS כפי שהודגם זה עתה. השעיו את המשקעים ב-PBS ו-FBS טריים לצורך ספירת תאים.כדי לכוון את הפיצוי (compensation), הוסיפו שלוש טיפות של מיקרוספירות פוליסטירן לשפרוret סטרילי עבור כל florafor, ומיקרוגרם אחד של ה-florafor המתאים לכל שפרוret. דגרו את המיקרוספירות למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, במיגון מאור. לאחר מכן, שטפו את המיקרוספירות בשלושה מיליליטר של PBS ו-FBS והסירו בזהירות את supernatant.שחזר את משקעי המיקרוספירות ב-250 microliters של PBS ו-FBS והכנס את מבחנת הדגימה ללא התיוג לתוך הציטומטר הזרימתי. בתוכנת הציטומטר הזרימתי, בחר בניסוי (experiment), בהגדרת פיצוי (compensation set up), וצור בקרות פיצוי. הוסף את הבקרות הספציפיות ל-florafor מהרשימה המוצגת ולחץ על OK. ודא את פיזור האור הקדמי (forward scattered) והצדי (side scattered), ובצע gating לאוכלוסייה הראשונית.לאחר מכן, התקינו את מבחנת ביקרת השלילה בציטומטר ולחצו על load. ודאו שאוכלוסיית העניין או P1 מוצגת ובחרו באוכלוסייה זו. לחצו עם המקש הימני על שער P1 ובחרו ב-calculate compensation.לאחר מכן לחצו על record data. כשסיום ההקלטה, לחצו על unload כדי להוציא את המבחנה והכניסו את מבחנת הבקרה הבאה כדי לכוונן את בקרות הפיצוי (compensation controls). כאשר כל דגימות הבקרה הוקלטו, צרו תרשים פיזור של forward versus side scatter עבור המבחנה הניסויית הראשונה, ובצעו gating לאוכלוסיית P1.בשלב הבא, פתחו תרשים פסאודו-צבע של גובה פיזור צדי (side scatter height) מול רוחב פיזור צדי (side scatter width) ובצעו gating לתאים בודדים. באמצעות התאים הבודדים, צרו תרשים של גובה פיזור קדמי (forward scatter height) מול רוחב פיזור קדמי (forward scatter width), ובצעו gating כדי להוציא את הדובלטים. לאחר מכן, צרו תרשים פסאודו-צבע של CD48 מול CD90.2 ובצעו gating לתאים חיוביים ל-CD90.2 ושליליים ל-CD48 כדי לסנן את המונוציטים, ולאחר מכן תרשים פסאודו-צבע של CD57 מול CD15 כדי לסנן זיהומים של תאי אמקרין.כעת הגדירו את האוכלוסיות שייאספו עבור הדגימה בגיליון תכנון המיון (sort layout sheet), ומיינו את התאים. בסיום המיון, השתמשו במנה של 2.5 × 10⁴ תאים כדי לאשש את טהרת אוכלוסיית התאים המבודדת. לאחר סינון הרשתות במסננת תאים, ניתן להבחין בתאי רשת פנימיים רבים, למרות שתאי הגנגליון של הרשת איבדו את המורפולוגיה האופיינית להם עקב אקסוטומיה (axotomy) במהלך הליך בידוד התאים.הפנוטיפ השטחי הקלאסי של Dye 1 חיובי ו-CD48 שלילי אינו מספיק לזיהוי ובידוד של תאי גנגליונים ברשתית של עכברים, שכן תאים אלו מבטאים גנים הקשורים לתאי אמקרין, תאי מילר, תאים ביפולריים, תאים אופקיים, פוטו-רצפטורים ותאי אפיתל של פיגמנט הרשתית. התאים המומיאים מבטאים גם סממנים תוך-תאיים הקשורים לתאי גנגליונים ברשתית, כגון synuclein gamma, BRN3A, TUJ1 ו-RBPMS, כאשר המיקום התוך-תאי של הסממנים אושר עוד יותר באמצעות ציטומטריית זרימה המבוססת על דימוי (imaging flow cytometry). חלק מהתאים המומיאים אף מתחילים להפגין מורפולוגיה של תאי גנגליונים ברשתית לאחר תרבית תאים במעבדה (in vitro).יתרה מכך, ניתוח qPCR של אוכלוסיית התאים הממוינת והמועשרת מאוד מגלה עלייה של פי כמה בגנים המקודדים לסמנים תוך-תאיים ספציפיים לתאי גנגליון ברשתית. לאחר השליטה בשיטה, ניתן להשלים אותה בפחות משש שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמור על סטריליות של תמיסת התאים, לחסום את רצפטורי ה-FC מתמיסת התאים כדי למנוע קישור לא ספציפי של הנוגדנים, ולהתייעץ עם מפעיל ממיין התאים לגבי פרטי המיון או האסטרטגיה.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון QPCR כדי לענות על שאלות נוספות בנוגע לפרופיל ביטוי גנים. זכרו כי עבודה עם ציוד ייעודי, כגון ממייין תאים (cell sorter), דורשת מפעיל מומחה. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הראייה לסייע בהבנת מנגנוני הישרדות ומוות בתאי גנגליון ברשתית, לצורך פיתוח טיפולים חדשניים לשימור הראייה.לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של האופן שבו ניתן לבודד אוכלוסייה הומוגנית ומועשרת של תאי גנגליונים רשתיתיים ראשוניים מעכברים.

isolation-primary-murine-retinal-ganglion-cells-rgcs-flow

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

מאמר זה מספק תיאור של איך לנתח ולתעד מן ההכנה רשתית מבודד העכבר. בפרט, אנו מתארים כיצד לרשום בתגובות אור אוכלוסייה שכותרתו fluorescently תא הגנגליון ובהמשך לזהות ולנתח את המורפולוגיה שלה.

הכנה רשתית מבודד להקליט תגובה האור תווית גנטית לתאי הגנגליון ברשתית

סרטון זה מדגים את ההליך לבידוד תאי גנגליון רשתית ראשוניים (RGCs) באמצעות ציטומטריית זרימה. שיטה זו מאפשרת מחקר עתידי של RGCs, במטרה להבין טוב יותר את הירידה הגדולה בחדות הראייה הנובעת מאובדן RGCs פונקציונליים במחלות נוירודגנרטיביות.

בידוד תאי גנגליון רשתית מורין באמצעות מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות

מקור: Laboissonniere, et. al. רצף RNA של תא בודד של תת-קבוצות מוגדרות של תאי גנגליון ברשתית. J. Vis. exp.{{}} (2017).  }סרטון זה מדגים טכניקת מעקב פלואורסצנטית לזיהוי תת-סוגים של תאי גנגליון ברשתית (RGC) ברשתית של עכבר טרנסגני. התהליך כולל אבטחת הרשתית המבודדת בתא הקלטה, שמירה על כדאיות התא עם זלוף מחומצן, והתמקדות ב-RGCs עם תווית פלואורסצנטית באמצעות פיפטה עם עוקב. על ידי ניתוח מורפולוגיה וריבוד דנדריטי, השיטה מאפשרת סיווג של תת-סוגים מובהקים של RGC.

זיהוי תת-סוגים של תאי גנגליון ברשתית עכבר באמצעות מעקב פלואורסצנטי

phagocytosis microglial הוא קריטי לשמירה על הומאוסטזיס רקמות ותפקוד לקוי phagocytic הייתה מעורב פתולוגיה. עם זאת, להערכת תפקוד microglia in vivo מבחינה טכנית מאתגרת. פתחנו טכניקה פשוטה אך חזקה לניטור בדיוק וכימות פוטנציאל phagocytic של microglia בסביבה פיזיולוגית.

להערכת תפקוד רשתית microglial Phagocytic<em&gt; In vivo</em&gt; שימוש cytometry זרימה מבוסס Assay

כאן, אנו מציגים גישה קומבינטורית לסיווג סוגי תאים נוירונים לפני הבידוד ועל אפיון לאחר מכן של transcriptomes תא בודד. פרוטוקול זה מייעל את ההכנה של דגימות עבור רצף RNA מוצלח (RNA-Seq) ומתאר מתודולוגיה שתוכננה במיוחד עבור הבנה משופרת של מגוון הסלולר.

יחיד תא RNA-Seq של קבוצות מוגדרות של תאים גנגליון רשתית

פרוטוקול זה מציג שתי טכניקות לבודד את התאים התת-תאיים של קולטני מוט מורין לניתוח חלבונים. השיטה הראשונה משתמשת בשרשתית חיה ונייר סינון תאית כדי להפריד מקטעים חיצוניים מוט, ואילו השני משתמש ברשתית ליופילית וקלטת דבק כדי לקלף שכבות מגזר פנימיות וחיצוניות מוט.

שתי שיטות פילינג לבידוד תאי קולטני אור ברשתית העכבר לניתוח חלבונים

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד תאי אנדותל רשתית לאחר הלידה הממוטבת לתפוקת התאים, טוהר וכדאיות. תאים אלה מתאימים לגישות ריצוף מהדור הבא.

בידוד תאי אנדותל רשתית מורין לריצוף הדור הבא

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט לבידוד תאי גליית הרשתית מעיני עכבר. הפרוטוקול מתחיל באינקולציה ודיסקציה של עיני עכבר, ואחריו בידוד, זריעה וטיפוח של תאי מולר.

בידוד תאי גליית גליה ראשוניים ברשתית העכבר

אפיתל פיגמנט ברשתית (RPE) פועל כמחסום מכריע בין הכורואיד לרשתית, ומקדם את בריאותם ותפקודם של סוגי תאי רשתית, כגון פוטורצפטורים. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול פשוט ויעיל לבידוד וטיפוח RPE של מורין בוגר.

שיטה פשוטה לבידוד ותרבית של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית מעכברים בוגרים

פרוטוקול זה מתאר את ההליך לבידוד רשתית העכבר בהרכבה שלמה וביצוע immunostaining כדי לתייג את כל תאי גנגליון הרשתית (RGCs). התהליך מלווה בהדמיה וספירה אוטומטית של RGCs באמצעות תוכנה מבוססת בינה מלאכותית, המספקת שיטה פשוטה, מהירה ומדויקת לכימות RGCs בכל רשתית העכבר.

Immunostaining בהר שלם וספירה אוטומטית של תאי גנגליון רשתית עכבר

מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לבידוד תאי מולר ראשוניים ברשתית מחולדות Sprague-Dawley (SD) יילודים. ההליך כולל הוצאת גלגלי העין, דיסקציה של רקמת הרשתית, מיצוי וזיהוי תאים, ושיקולים מרכזיים לתרבית תאים לאחר מכן.

בידוד ותרבית של תאי מולר רשתית ראשוניים מחולדות Sprague-Dawley (SD)

למדו לבודד תאי רשתית גנגליון (RGCs) מעכברים בשיטת זרימת cytometry. פרוטוקול מהיר וסטנדרטי זה מאפשר בידוד אוכלוסייה עשירה של תאים חיים לחקר מחלות ניווניות ברשתית.

בידוד של תאים ראשיים Murine הרשתית גנגליון (RGCs) על ידי זרימת cytometry

גלה סרטונים נוספים