Name: כימות צפיפות הענף בבלוטת החלב עכברוש- mounts כולו באמצעות שיטת ניתוח Sholl (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: למד כיצד לכמת צפיפות והתפצלות ענפים בבלוטת החלב של מכרסמים באמצעות ניתוח Sholl משופץ על תמונות whole-mount. שיטה זו מספקת הערכה אובייקטיבית של התפתחות הבלוטה באמצעות תוכנת ImageJ בקוד פתוח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר מיכאל אסטרלינג (Social and Scientific Systems, Inc., Durham, NC) על עזרתו עם אימות השיטה הזאת וד&quot;ר טיאגו פריירה (אוניברסיטת מקגיל, מונטריאול, קוויבק, קנדה) סיוע עם יישום Sholl.

<ol><li>Sholl, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+organization+of+the+neurons+in+the+visual+and+motor+cortices+of+the+cat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Dendritic organization of the neurons in the visual and motor cortices of the cat.</a> J Anat. 87 (4), 387-406 (1953).</li>
<li>Ferreira, T. A., Iacono, L. L., Gross, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+receptor+1A+modulates+actin+dynamics+and+restricts+dendritic+growth+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Serotonin receptor 1A modulates actin dynamics and restricts dendritic growth in hippocampal neurons.</a> Eur J Neurosci. 32 (1), 18-26 (2010).</li>
<li>Stanko, J. P., Easterling, M. R., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Sholl+analysis+to+quantify+changes+in+growth+and+development+in+rat+mammary+gland+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Application of Sholl analysis to quantify changes in growth and development in rat mammary gland whole mounts.</a> Reprod Toxicol. 54, 129-135 (2015).</li>
<li>Assis, S., Warri, A., Cruz, M. I., Hilakivi-Clarke, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+Mammary+Gland+Morphology+and+Breast+Cancer+Risk+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats.</a> J. Vis. Exp. (44), e2260(2010).</li>
<li>Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Mammary+Gland+Development+and+Function+in+Mouse+Models%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models.</a> J. Vis. Exp. (53), e2828(2011).</li>
<li>Ferreira, T. Sholl Analysis. ImageJ. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://imagej.net/Sholl_Analysis">http://imagej.net/Sholl_Analysis</a> (2012).</li>
<li>Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide. IJ 1.46r. ImageJ. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html</a> (2012).</li>
<li>Tucker, D. K., Foley, J. F., Hayes-Bouknight, S. A., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+High-quality+Hematoxylin+and+Eosin-stained+Sections+from+Rodent+Mammary+Gland+Whole+Mounts+for+Histopathologic+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Preparation of High-quality Hematoxylin and Eosin-stained Sections from Rodent Mammary Gland Whole Mounts for Histopathologic Review.</a> Toxicol Pathol. 44 (7), 1059-1064 (2016).</li>
<li>Fenton, S. E., Hamm, J. T., Birnbaum, L. S., Youngblood, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+abnormalities+in+the+rat+mammary+gland+following+gestational+and+lactational+exposure+to+2%2C3%2C7%2C8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin+%28TCDD%29%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Persistent abnormalities in the rat mammary gland following gestational and lactational exposure to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD).</a> Toxicol Sci. 67 (1), 63-74 (2002).</li>
<li>Murray, T. J., Maffini, M. V., Ucci, A. A., Sonnenschein, C., Soto, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+mammary+gland+ductal+hyperplasias+and+carcinoma+in+situ+following+fetal+bisphenol+A+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Induction of mammary gland ductal hyperplasias and carcinoma in situ following fetal bisphenol A exposure.</a> Reprod Toxicol. 23 (3), 383-390 (2007).</li>
<li>Moral, R., Santucci-Pereira, J., Wang, R., Russo, I. H., Lamartiniere, C. A., Russo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+exposure+to+butyl+benzyl+phthalate+induces+modifications+in+the+morphology+and+the+gene+expression+profile+of+the+mammary+gland%3A+an+experimental+study+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health%22%5BJournal%5D)">In utero exposure to butyl benzyl phthalate induces modifications in the morphology and the gene expression profile of the mammary gland: an experimental study in rats.</a> Environ Health. 10 (1), 5(2011).</li>
<li>Johnson, M. D., Mueller, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+dimensional+multiphoton+imaging+of+fresh+and+whole+mount+developing+mouse+mammary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Three dimensional multiphoton imaging of fresh and whole mount developing mouse mammary glands.</a> BMC Cancer. 13, 373(2013).</li>
<li>Enoch, R. R., Stanko, J. P., Greiner, S. N., Youngblood, G. L., Rayner, J. L., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+gland+development+as+a+sensitive+end+point+after+acute+prenatal+exposure+to+an+atrazine+metabolite+mixture+in+female+Long-Evans+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Persp%22%5BJournal%5D)">Mammary gland development as a sensitive end point after acute prenatal exposure to an atrazine metabolite mixture in female Long-Evans rats.</a> Environ Health Persp. 115 (4), 541-547 (2007).</li>
<li>Hovey, R. C., Coder, P. S., Wolf, J. C., Sielken, R. L., Tisdel, M. O., Breckenridge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+mammary+gland+development+in+female+Long+Evans+rats+following+in+utero+exposure+to+atrazine%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of mammary gland development in female Long Evans rats following in utero exposure to atrazine.</a> Toxicol Sci. 119 (2), 380-390 (2011).</li>
<li>Mandrup, K. R., Hass, U., Christiansen, S., Boberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinatal+ethinyl+oestradiol+alters+mammary+gland+development+in+male+and+female+Wistar+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Inter+J+of+Androl%22%5BJournal%5D)">Perinatal ethinyl oestradiol alters mammary gland development in male and female Wistar rats.</a> Inter J of Androl. 35 (3), 385-396 (2012).</li>
</ol>

למחברים אין מה לגלות.

מלידה עד גיל ההתבגרות, הצמיחה בלוטת החלב היא allometric. לאחר גיל ההתבגרות, בלוטת החלב מתפתחת דרך הסתעפות הדוקטריים התארכות, אשר ממשיכים עד אפיתל החלב תופסת את כרית שומן כולו. מאפייני הסניף הם היבט חשוב של התפתחות בלוטת החלב, והיכולת לאמוד באופן אובייקטיבי מאפיינים אלה יכולה להיות שימושית מאוד להערכת התפתחות החלב הנורמלית ולזיהוי התפתחות חריגה בעקבות חשיפות מוקדמות לחיים של רעילות החלב. ניקוד מאפיינים מורפולוגיים...

בלוטת החלב הסתעפות היא מאפיין זה הוא בדרך כלל מוערך כמו אינדיקטור של התפתחות בלוטות, אבל קשה לכמת אובייקטיבי. בשנת 1953, Sholl 1 תיאר שיטה למדידת arborization דנדריטים נוירונים בקורטקס החזותי והמנועי של החתול, ותוסף עבור טכניקה זו פותחה על ידי Ferriera et al 2 . בגלל שני נוירונים בלוטות החלב התערוכה מבנה דומה עץ דמוי, תוסף הועסק לכמת צפיפות הסתעפות האפיתל השד בתמונות 2D של בלוטת החלב peripubertal חולדה. השלב peripubertal נבחר לניתוח בגלל הגמילה היא שלב החיים, כי הוא מוערך לעתים קרובות במעבדות אקדמיות ומבחני מבחן המבחן. ניתוח Sholl הוא תוסף מופץ עם FIJI, המהווה את קוד פתוח עיבוד תמונה ImageJJ, עם תוספים נוספים כלולים. התוסף יוצר סדרה של טבעות קונצנטריות המקיפות פרדף(בדרך כלל סומה של נוירון או המקור של צינור הראשי של בלוטת החלב) והרחבת החוצה לחלק דיסטלי ביותר של האובייקט (רדיוס מצרף). לאחר מכן הוא סופר את מספר הצמתים (N) המתרחשים בכל אחת מהטבעות. תוסף גם מחזירה מקדם רגרסיה Sholl ( k ), המהווה מדידה של קצב ריקבון הסתעפות אפיתל. באמצעות ImageJ, תמונה skeletized של בלוטת החלב כולו הר נוצר ואזור אפיתל החלב (MEA) נמדדת. התמונה מנותחת באמצעות תוסף ניתוח Sholl, וערכים עבור N ו- k , בין ערכים אחרים שאינם מנוצלים כאן, מוחזרים. צפיפות הסתעפות אפיתל החלב נקבעת על ידי חישוב N / MEA. המידה שבה הסתעפות נמשכת באזורים החיצוניים של האפיתל הבלוטתי הוא המורכבות הסתעפות והוא אינדיקטור לצמיחה אפיתלית אחידה דיסטלי. כמו k הוא מדד של ירידה דיסטלית epithאלירי הסתעפות, הוא מדד יעיל של המורכבות הסתעפות אינדיקטור אמין של התפתחות החלב. פרוטוקול זה מתאר שיטה בסיוע מחשב ליצירת תמונות skeletized של בלוטות החלב כולו mounts ו הערכה כמותית המאפיינים הסתעפות החלב ב עכברים peripubertal זכר ונקבה. שיטה זו מהירה יחסית ואינה דורשת שימוש בציוד מיקרוסקופי מיוחד. פיתוח ואישור של שיטה זו מתוארים Stanko et al. (2015) 3 . דוח זה מתאר גם הכנה של בלוטת החלב כולו = mounts. הליכים דומים של כל ההר-חזה תוארו ב- Assis et al. (2010) 4 ו Plante et al. (2011) 5 .

<table><tbody><tr><td>לוח חיתוך</td><td>NA</td><td>NA</td><td>חתיכת קלקר בערך 10 "x12" מתאימה.</td></tr>ניתוח בקבוק ספריי <tr><td>T-Pins</td><td>Daigger</td><td>EF7419A</td><td></td></tr><tr><td>עם אתנול</td><td>NA</td><td></td><td>NA 70% אתנול מתאים.</td></tr><tr><td>מספריים לחיתוך מעוקלים</td><td>Fine Science</td><td>Tools 14569-09</td><td></td></tr><tr><td>מספריים ישרים לניתוק</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>14568-09</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים מעוקלים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>11003-12</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 24 x 75 x 1 מ"מ שקופיות מיקרוסקופ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4951PLUS-001</td><td>תרמו סיינטיפיק סופרפרוסט פלוס & שקופיות Colorfrost Plus מחזיקות קטעי רקמה לצמיתות ללא צורך בציפויים יקרים ביישומי IHC ופתולוגיה אנטומית. טיפול זה מפחית את אובדן הרקמות במהלך הצביעה כמו גם שעות של הכנת שקופיות. שקופיות מושכות אלקטרו-סטטית קטעי רקמות קפואות ותכשירים ציטולוגיים וכוללות כימיה דומה לסילאן, אם כי מותאמת לשיפור ביצועי היישום. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4951PLUS4.&nbsp;</td></tr><tr><td>Fisherfinest Premium Cover Glass 24 x 60 x 1 מ"מ</td><td>Fisher scientific</td><td>12-548-5P</td><td></td></tr><tr><td>Bemis Parafilm M סרט עטיפת מעבדה</td><td>Fisher scientific</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית קרחונית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9967</td><td></td></tr><tr><td>אתנול אבסולוט, &ge; 99.8% (GC)&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>24102</td><td></td></tr><tr><td>קסילן</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>אלום קרמין&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1022</td><td></td></tr><tr><td>אלומיניום אשלגן גופרתי&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A6435</td><td></td></tr><tr><td>אמצעי הרכבה פרמאונט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>SP15</td><td></td></tr><tr><td>מקרוסקופ</td><td>Leica</td><td>Z16 APO&nbsp;</td><td>זוהי החומרה והתוכנה ללכידת התמונות המשמשות במעבדה זו. מכיוון שישנן אפשרויות רבות ושונות, השיטות והיישומים עשויים להשתנות בין מעבדות.</td></tr><tr><td>מצלמה דיגיטלית</td><td>Leica</td><td>DFC295</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת מצלמה</td><td>Leica</td><td>Leica Application Suite v3.1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת ImageJ</td> ניתוח <td>קוד פתוח</td><td>http://imagej.net/Welcome</td><td></td></tr><tr><td>Sholl&nbsp;</td><td>http://imagej.net/Sholl_Analysis</td><td></td> <td>קוד פתוח</td></tr></tbody></table>

כימות צפיפות הענף בבלוטת החלב עכברוש- mounts כולו באמצעות שיטת ניתוח sholl

Quantifying Branching Density in Rat Mammary Gland Whole-mounts Using the Sholl Analysis Method

מספר גדל והולך של מחקרים מנצלים את בלוטת החלב המכרעת כנקודת קצה להערכת הרעילות ההתפתחותית של חשיפה כימית. ההשפעות האלה חשיפות יש על התפתחות בלוטת החלב מוערכים בדרך כלל באמצעות מדידות ממדי בסיסי או על ידי ניקוד מאפיינים מורפולוגיים. עם זאת, טווח רחב של שיטות לפרש שינויים התפתחותיים עלול להוביל לתרגומים לא עקביים על פני מעבדות. יש צורך בשיטת הערכה מקובלת, כדי שיוכלו להיווצר פרשנויות מתאימות ממידע שנאסף על פני מחקרים. המחקר הנוכחי מתאר את היישום של שיטת ניתוח Sholl כדי לכמת מאפיינים הסתעפות בלוטת החלב. שיטת Sholl פותחה במקור לשימוש בכימות דפוסי דנדריטים נוירונים. באמצעות ImageJ, קוד פתוח תמונה ניתוח חבילת תוכנה, וכן תוסף שפותח עבור ניתוח זה, בלוטת החלב צפיפות צפיפות המורכבות של AMבלוטת החלב מתוך חולדה נקבה peripubertal נקבעו. השיטות המתוארות כאן יאפשרו את השימוש בניתוח Sholl ככלי יעיל לכימות מאפיין חשוב של התפתחות בלוטת החלב.

הערכים עבור רדיוס סגורה נמדד, MEA, N, k , וצפיפות הסתעפות מחושב עבור בלוטת החלב ניתח בפרוטוקול זה מדווחים בטבלה 1 . ניתוח Sholl מייצר מגרשים ליניארי ו חצי יומן של מספר צמתים בכל רדיוס ( איור 9 ), ואם נבחר, מפת חום של צמתים ( איור 10 ). בלוטות פחות מפותחות התערוכה פחות צמתים בתוך MEA זהה ולכן יש צפיפות הסתעפות נמוכה יותר. בלוטה מפותח ימשיך סניף אחידה לאורך כל האפית...

התפתחות בלוטת החלב במכרסם הוערכה בדרך כלל באמצעות הערכות תיאוריות או על ידי מדידת תכונות פיזיות בסיסיות. צפיפות הענף היא אינדיקטור להתפתחות החלב שקשה לכמת באופן אובייקטיבי. פרוטוקול זה מתאר שיטה אמינה להערכת כמותית של מאפייני הבלוטות החלב.

כימות צפיפות הענף בבלוטת החלב עכברוש- mounts כולו באמצעות שיטת ניתוח Sholl

An increasing number of studies are utilizing the rodent mammary gland as an endpoint for assessing the developmental toxicity of a chemical exposure. The ...

המטרה הכללית של שיטה ממוחשבת זו היא לכמת באופן אובייקטיבי את צפיפות ההסתעפות ואת דעיכת ההסתעפות של בלוטת העווית, שני מדדי התפתחות חשובים במכרסמים, וזאת באמצעות יישום של ניתוח שול (sholl analysis) מותאם על תמונות whole-mount של בלוטת העווית. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות בתחום הביולוגיה של בלוטת העווית, כגון כיצד חשיפות כימיות עשויות לשנות את התפתחות בלוטת העווית. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת בתוכנה בקוד פתוח כדי לכמת באופן אובייקטיבי מאפיינים בסיסיים של התפתחות בלוטת העווית.עבור הליך זה, הכינו תמונות של דגימות שלמות (whole-mounts) המראות את האפיתלל הבלוטתי בהגדלה קבועה. כדי להתחיל, פתחו תמונה ב-ImageJ. לאחר מכן, בחרו בכלי השרטוט החופשי (freehand tool).סמנו את ההיקף של האפיתל הגלנדולרי ונקו את האזור שסביבו. לאחר מכן, סמנו את ההיקף של קשרית הלימפה והסירו חלק זה מהתמונה באמצעות פקודת החיתוך. אם הרקע של התמונה שחור, יש להמיר אותו ללבן.לחצו על Edit, לאחר מכן על Options, ואז על Colors. בתיבת הדו-שיח, בחרו בלבן (white) מהתפריט הנפתח של אפשרויות הרקע. למרות שהרקע עשוי להישאר שחור, הוא יטופל כלבנה בעת עיבוד התמונה.כעת, הפרידו את ערוצי הצבע לשלוש תמונות בגווני אפור של שמונה ביטים. לאחר מכן, בחרו את הערוץ עם הניגודיות הטובה ביותר, שבדרך כלל הוא הערוץ הכחול. כעת, הפחיתו את הרקע מהערוץ הצבעוני שנבחר.לאחר מכן, המשיכו בבחירת הפרמטרים הרצויים ובתצוגה מקדימה של השינויים. סמנו את תיבת הבחירה של רקע בהיר (light background) ותצוגה מקדימה (preview) בתיבת הדו-שיח, ולאחר מכן כווןנו את מספר הפיקסלים עד להשגת הניגודיות הרצויה. אם נדרשת ניגודיות נוספת, השתמשו באפשרות Unsharp Mask.סמנו את Preview בתיבת הדו-שיח וכוונו את רדיוס הפיקסלים (pixel radius) ואת משקל המסכה (mask weight) עד לקבלת הניגודיות הרצויה. לאחר הפעלת מסנן ה-unsharp mask, הסירו את השוליים שנוצרו כתוצאה מהסינון. לחצו על כפתור החץ הכפול האדום בסרגל הכלים ובחרו ב-Drawing Tools.לאחר מכן, בחרו בכלי המחק (Eraser). התאימו את קוטרו על ידי לחיצה ימנית על כפתור כלי המחק, ולאחר מכן לחצו לחיצה ממושכת על לחצון העכבר השמאלי כדי למחוק את הגבול. ניתן לבצע פעולת ביטול (Undo) אחת בלבד במהלך המחיקה, לכן היו זהירים.לאחר הפעלת אחד המסננים, הסר את הרעש שנותר באופן ידני. התבסס על עותק של התמונה המקורית והסר רעש שזוהה על ידי לחיצה תחילה על כפתור החץ הכפול האדום בסרגל הכלים ובחירה בכלי הרישום. לאחר מכן, בחר בכלי המחק.כוון את קוטרו על ידי לחיצה ימנית על כפתור כלי המחק. לאחר מכן, החזק את לחצן העכבר השמאלי לחוץ כדי למחוק רעשים. במהלך המחיקה ניתן לבצע ביטול פעולה (undo) ברמה אחת בלבד, לכן יש לפעול בזהירות.בשלב הבא, התאימו את סף התמונה (threshold). הזזי את המכוונים כדי להתאים את ערכי הסף המינימליים והמקסימליים לצורך שיפור תמונת הבלוטה. לאחר מכן, לחצו על Apply.הסר רעשים נוספים באופן אוטומטי באמצעות אחת משתי שיטות. האפשרות הראשונה היא להשתמש בפקודה despeckle. האפשרות השנייה היא להשתמש בפקודה remove outliers.תהליך זה מחליף פיקסל בחציון של סביבתו המיידית רק אם הפיקסל חורג מהחציון בערך הגבוה מסף שהוגדר על ידי המשתמש. כעת, באמצעות שימוש בתמונה המקורית לצורך השוואה, שחזרו חלקים מהאפיתליום הגלנדולרי שהוסרו במהלך הגדרת הסף והסרת הרעשים. בעת שחזור התמונה, הקפידו לבצע זאת בזהירות ובמידה מינימלית כדי לשמור על שלמות התמונה.בחרו את כלי ספריי הצבע מתוך כלי הרישום. לחצו קליק ימני על כפתור כלי ספריי הצבע כדי להתאים את גודל הכלי, ולאחר מכן מלאו בזהירות את החלקים החסרים של הבלוטה באמצעות המקש השמאלי של העכבר. לאחר מכן, צרו תמונת שלד (skeletonized image) של הבלוטה לצורך ניתוח Sholl.ראשית, העבירו את התמונה לפורמט בינארי. לאחר מכן, בצעו שלדון (skeletonization) של התמונה. תהליך זה מסיר שוב ושוב פיקסלים מקצוות התמונה הבינארית עד שהיא מצומצמת לצורה ברוחב פיקסל אחד.כעת, בצעו הרחבה (dilate) של התמונה פעם אחת כדי לסגור את הפערים שנוצרו כתוצאה מתהליכי הסף (thresholding) והשלד (skeletonizing). לאחר מכן, שמרו את התמונה כקובץ חדש באמצעות פקודת "שמור בשם" (save as). לבסוף, בדקו את דיוק תמונת השלד אל מול המקור על ידי הנחת שתי התמונות זו על זו (overlaying).בתיבת הדו-שיח להוספת תמונה, בחרו את תמונת השלד והגדירו את השקיפות שלה ל-30%. לאחר מכן, שמרו את השכבה העליונה כתמונה חדשה לעיון עתידי. כדי להתחיל, פתחו תמונת שלד והמירו את התמונה לפורמט בינארי. כעת, הגדירו את קנה המידה של התמונה.הזינו את מספר הפיקסלים למילימטר, לאחר מכן הגדירו הן את המרחק הידוע (known distance) והן את יחס רבד הפיקסל (pixel aspect ratio) כ-1, הזינו מילימטרים כיחידת אורך והפעילו את האפשרות הגלובלית כדי להחיל את קנה המידה על כל התמונות. לאחר מכן, קבעו את רדיוס הסיום עבור ניתוח השול (sholl analysis) באמצעות כלי שרטוט הקווים. שרטטו קו מתחילת התעלה הראשית ועד לנקודה הדיסטלית ביותר של האפיתל הגלנדולרי.לאחר מכן לחצו על מקש M והמרחק של הקו יוצג. כעת, הזינו את ההגדרות עבור ניתוח שול (sholl analysis). ראשית, בחרו אפשרויות בסעיף הגדרת המעטפות (definition of shells), הגדירו את רדיוס ההתחלה ל-0.00 millimeters והגדירו את גודל צעד הרדיוס ל-0.1 millimeters.הגדירו את מספר הדגימות לאחת. אורך הקו ששורטט כעת יוזן באופן אוטומטי בשדה רדיוס הסיום. עבור אפשרויות של מספר דגימות לרדיוס, בחרו ב-mean (ממוצע) לצורך האינטגרציה.עבור התיאורים (descriptors) ואפשרויות התאמת העקום, הגדירו את ערך החיתוך של רדיוס ההיקפי (enclosing radius cutoff) לאחד. בחרו ב-infer from starting radius עבור מספר הענפים הראשוניים, ובחרו באפשרויות linear ו-best fitting degree. לאחר מכן, תחת profiles without normalization, בחרו ב-most informative.כעת, תחת סעיף שיטות ה-sholl, בחרו ב-area for normalized profile. לבסוף, בסעיף הפלט (output), בחרו ב-create intersections mask כדי ליצור מפת חום של נקודות החיתוך. כעת, פתחו חלון תצוגה מקדימה של התמונה עם הטבעות ואשרו את שטח הניתוח.אם הכל נראה תקין, לחצו על אישור כדי להריץ את הניתוח. הרצת הניתוח תיצור חלון ליניארי של פרופיל Sholl, חלון חצי-לוגריתמי של פרופיל Sholl, חלון תוצאות Sholl המכיל את כל ערכי הפלט של ה-Sholl, וחלון שמות קבצים של פרופילי Sholl המספק את מספר ההצטלבויות בכל רדיוס כפי שנקבע על ידי הפולינום. כדי למדוד את ה-MEA, עבדו עם תמונת השלד (skeleton) של הבלוטה ב-ImageJ.פתחו את כלי הפוליגון ושרטטו פוליגון סביב היקף הבלוטה. השתמשו בלחיצות עכבר כדי להוסיף מקטעי קו. כאשר כל השטח האפיתליאלי הוקף, לחצו לחיצה כפולה כדי לסגור את הפוליגון.לאחר מכן, לחצו על מקש M כדי לפתוח חלון תוצאות. הערך בעמודת השטח (area) מתאים ל-MEA. אם האפיתל הבלוטתי חורג מגבולות קשרי הלימפה, הפחיתו את שטח קשרי הלימפה מה-MEA בעת חישוב צפיפות ההסתעפות.ניתן למדוד את שטח קשרי הלימפה באופן דומה ל-MEA. באמצעות השיטות המתוארות, נותחו שתי קבוצות של חולדות בעלות גיל תואם. החיות בקבוצה B טופלו בחומר כימי הידוע כגורם להתפתחות מוקדמת של בלוטות החלב.שרטוט מספר נקודות ההצטלבות של הענפים לאורך הרדיוס מהבלוטה ממחיש את השונות בתוצאות. תוצאות ניתוח ה-sholl חשפו הבדל ברור במספר הממוצע של נקודות ההצטלבות בין הקבוצות. עם זאת, יש לנרמל את נתוני ההצטלבות לשטח בלוטת החלב כדי להסיק מסקנות.ניתוח השול (sholl analysis) ומדידות שטח האפיתל של בלוטת העלה מספקים שני פרמטרים פיזיולוגיים שימושיים לביצוע ניתוח השוואתי. ניכר כי גודל הבלוטות היה גדול בהרבה בקבוצת הטיפול. ניתוח השול מחזיר את הערך עבור Sum N, המשמש לחישוב צפיפות ההסתעפות והערך עבור k.בקבוצת הטיפול, צפיפות ההסתעפות הממוצעת הגבוהה יותר והערך הממוצע הנמוך יותר של k, המשקף קצב נמוך יותר של דעיכת הסתעפות, מעידים על כך שבבעלי החיים שעברו טיפול היו בלוטות מפותחות יותר מאשר בבעלי החיים שלא טופלו. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי הסרת הרעש היא השלב הקריטי ביותר. הסרה מרובה מדי או מעטה מדי עלולה לפגוע בשלמות הבלוטה ולהטות את התוצאות.בעת שימוש בשיטה זו, חשוב להתחיל עם דגימת רקמה שלמה ונקייה של בלוטת החלב. לא ניתן להשיג תמונה שלדית (skeletonized) מדויקת אם קיימים פגמים, כגון קרעים או קפלים. יצירת תמונה שלדית מדויקת דורשת סבלנות ותרגול.לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו ב-15 עד 20 דקות לכל בלוטה מנותחת, במידה והיא מבוצעת כראוי.

quantifying-branching-density-rat-mammary-gland-whole-mounts-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

פרוטוקול שלנו מתאר כיצד לנתח את בלוטת החלב בטן עכברוש ואיך להכין mounts בלוטת החלב כולו. הוא גם מתאר כיצד לנתח מורפולוגיה בלוטת החלב באמצעות שלוש נקודות קצה (מספר ניצנים סוף סופני, התארכות בידול אפיתל) ולהשתמש התוצאות הללו כדי לחזות את הסיכון לסרטן השד אצל חולדות אשר נחשפו שינויים...

שינויים במורפולוגיה בלוטת החלב ואת הסיכון לסרטן השד אצל חולדות

שיטה זו מתארת ​​כיצד לנתח ולהעריך התפתחות תפקוד בלוטת החלב ומן העכברים. בלוטות החלב נכרת מוערכים לתואר הפיתוח באמצעות הר שלם תוך פליטה החלב מוערך באמצעות אוקסיטוצין מבוססי assay myoepithelial התכווצות התא.

הערכת התפתחות בלוטת החלב פונקציה ועל מודלים עכבר

אנו מציגים גישת רישום תמונה לשחזור נפח היסטולוגיה תלת מימדית (תלת מימדית), המאפשרת לחקור את השינויים של איבר ברמת מבני המאקרו המורכבים מתאים. באמצעות גישה זו, חקרנו את השינויים התלת-ממדיים בין בלוטות חלב מסוג בר לבלוטות חלב Igfbp7-null.

שחזור נפח היסטולוגיה 3 ממדים ויישומו לחקר מאוס החלב בלוטות

צמתים בין-תאיים הם דרישות עבור פונקציות ספציפיות של בלוטת החלב והתפתחותן. כתב היד מספק פרוטוקול מפורט לחקר האינטראקציות בין חלבונים לחלבון (PPI) לבין שיתוף לוקליזציה באמצעות בלוטות החלב Murine. טכניקות אלה מאפשרות לחקור את הדינמיקה של הקשר הפיזי בין צמתים בין-תאיים בשלבי התפתחות שונים.

ניתוח אינטראקציות חלבון חלבון שיתוף לוקליזציה בין רכיבי פערים, צמודים, ו adherens צמתים Murine בלוטות החלב

פיתחנו שיטה כדי להסיר בהצלחה, לעבד, קטע, כתם, להערכה histopathological, רקמת החלב שנקבע במקור על שקופיות כמו mounts שלם. שיטה זו עשויה לקדם את איסוף והערכה של בלוטת החלב כולו mounts במחקרים הנחייה מבחן הרבייה.

חתך בלוטות החלב שלמות מלא עבור זיהוי הנגע

כאן, אנו מציגים עבור בידודו של שלמה, שלמה עכבר פרוטוקול עטין לחקור מורפולוגיה ductal וביטוי מטריצה חוץ-תאית (ECM). בלוטות בטן העכבר #4 היו מופק עכברים nulliparous נקבה שבוע 8-10, קבוע בפורמלין במאגר נייטרלי, למחלקה והמוכתמות בעזרת אימונוהיסטוכימיה ECM חלבונים.

בידוד של בלוטות מוגדלות ללא פגע, כל עכבר לניתוח של בלוטת מורפולוגיה וביטוי מטריצה חוץ-תאית

מאמר זה מתאר שיטת השתלת להשתיל השתל בפטמות האפיתל התאים לתוך משטח שומן לבן של בעלי חיים הנמען. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לבחון את השפעות המארחים ו/או התורמים בהתפתחות האפיתל של הפטמות ומבטלת את הצורך בניקוי מראש, ובכך מרחיב את התועלת שבטכניקה זו.

חולדה השתלת תא האפיתל לתוך משטח שומן לבן הגלימה

פרוטוקול זה מתאר חלון הדמיה חדש של יונקים עם מכסה הניתן להחלפה (R.MIW). מיקרוסקופיה תוך-ורידית לאחר השתלת ה-R.MIW מאפשרת הדמיה אורכית ורב-יומית של בלוטת החלב הבריאה והחולה עם רזולוציה תאית בשלבי ההתפתחות השונים.

מיקרוסקופיה תוך-ורידית אורכית באמצעות חלון הדמיה של יונקים עם מכסה הניתן להחלפה

מתואר הליך להעברת תמיסה אבלטיבית כימית לעץ צינור החלב של החולדה לטיפול מונע מונחה הדמיה בסרטן השד. ניתן למקד תאי אפיתל של החלב עם נזק מינימלי לרקמות אגביות באמצעות קנולציה ישירות לתוך פתח הפטמה ועירוי תוך דוקטלי של תמיסה אבלטיבית מבוססת אתנול 70%.

הדמיית רנטגן של טיפול אבלטיבי מבוסס אתנול תוך דוקטלי למניעת סרטן השד במודלים של חולדות

כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט וחסכוני לביצוע כימות בלתי משוחד של צפיפות כלי הדם הריאתיים עבור רקמת ריאה של עכברים שלמים באמצעות צביעה יחידה של איזולקטין B4.

כימות צפיפות כלי הדם הריאתיים בעכברים על פני אונות

למד כיצד לכמת צפיפות והתפצלות ענפים בבלוטת החלב של מכרסמים באמצעות ניתוח Sholl משופץ על תמונות whole-mount. שיטה זו מספקת הערכה אובייקטיבית של התפתחות הבלוטה באמצעות תוכנת ImageJ בקוד פתוח.

כימות צפיפות הענף בבלוטת החלב עכברוש- mounts כולו באמצעות שיטת ניתוח Sholl

גלה סרטונים נוספים