כימות צפיפות הענף בבלוטת החלב עכברוש- mounts כולו באמצעות שיטת ניתוח Sholl

המטרה הכללית של שיטה ממוחשבת זו היא לכמת באופן אובייקטיבי את צפיפות ההסתעפות ואת דעיכת ההסתעפות של בלוטת העווית, שני מדדי התפתחות חשובים במכרסמים, וזאת באמצעות יישום של ניתוח שול (sholl analysis) מותאם על תמונות whole-mount של בלוטת העווית. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות בתחום הביולוגיה של בלוטת העווית, כגון כיצד חשיפות כימיות עשויות לשנות את התפתחות בלוטת העווית. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת בתוכנה בקוד פתוח כדי לכמת באופן אובייקטיבי מאפיינים בסיסיים של התפתחות בלוטת העווית.

עבור הליך זה, הכינו תמונות של דגימות שלמות (whole-mounts) המראות את האפיתלל הבלוטתי בהגדלה קבועה. כדי להתחיל, פתחו תמונה ב-ImageJ. לאחר מכן, בחרו בכלי השרטוט החופשי (freehand tool).

סמנו את ההיקף של האפיתל הגלנדולרי ונקו את האזור שסביבו. לאחר מכן, סמנו את ההיקף של קשרית הלימפה והסירו חלק זה מהתמונה באמצעות פקודת החיתוך. אם הרקע של התמונה שחור, יש להמיר אותו ללבן.

לחצו על Edit, לאחר מכן על Options, ואז על Colors. בתיבת הדו-שיח, בחרו בלבן (white) מהתפריט הנפתח של אפשרויות הרקע. למרות שהרקע עשוי להישאר שחור, הוא יטופל כלבנה בעת עיבוד התמונה.

כעת, הפרידו את ערוצי הצבע לשלוש תמונות בגווני אפור של שמונה ביטים. לאחר מכן, בחרו את הערוץ עם הניגודיות הטובה ביותר, שבדרך כלל הוא הערוץ הכחול. כעת, הפחיתו את הרקע מהערוץ הצבעוני שנבחר.

לאחר מכן, המשיכו בבחירת הפרמטרים הרצויים ובתצוגה מקדימה של השינויים. סמנו את תיבת הבחירה של רקע בהיר (light background) ותצוגה מקדימה (preview) בתיבת הדו-שיח, ולאחר מכן כווןנו את מספר הפיקסלים עד להשגת הניגודיות הרצויה. אם נדרשת ניגודיות נוספת, השתמשו באפשרות Unsharp Mask.

סמנו את Preview בתיבת הדו-שיח וכוונו את רדיוס הפיקסלים (pixel radius) ואת משקל המסכה (mask weight) עד לקבלת הניגודיות הרצויה. לאחר הפעלת מסנן ה-unsharp mask, הסירו את השוליים שנוצרו כתוצאה מהסינון. לחצו על כפתור החץ הכפול האדום בסרגל הכלים ובחרו ב-Drawing Tools.

לאחר מכן, בחרו בכלי המחק (Eraser). התאימו את קוטרו על ידי לחיצה ימנית על כפתור כלי המחק, ולאחר מכן לחצו לחיצה ממושכת על לחצון העכבר השמאלי כדי למחוק את הגבול. ניתן לבצע פעולת ביטול (Undo) אחת בלבד במהלך המחיקה, לכן היו זהירים.

לאחר הפעלת אחד המסננים, הסר את הרעש שנותר באופן ידני. התבסס על עותק של התמונה המקורית והסר רעש שזוהה על ידי לחיצה תחילה על כפתור החץ הכפול האדום בסרגל הכלים ובחירה בכלי הרישום. לאחר מכן, בחר בכלי המחק.

כוון את קוטרו על ידי לחיצה ימנית על כפתור כלי המחק. לאחר מכן, החזק את לחצן העכבר השמאלי לחוץ כדי למחוק רעשים. במהלך המחיקה ניתן לבצע ביטול פעולה (undo) ברמה אחת בלבד, לכן יש לפעול בזהירות.

בשלב הבא, התאימו את סף התמונה (threshold). הזזי את המכוונים כדי להתאים את ערכי הסף המינימליים והמקסימליים לצורך שיפור תמונת הבלוטה. לאחר מכן, לחצו על Apply.

הסר רעשים נוספים באופן אוטומטי באמצעות אחת משתי שיטות. האפשרות הראשונה היא להשתמש בפקודה despeckle. האפשרות השנייה היא להשתמש בפקודה remove outliers.

תהליך זה מחליף פיקסל בחציון של סביבתו המיידית רק אם הפיקסל חורג מהחציון בערך הגבוה מסף שהוגדר על ידי המשתמש. כעת, באמצעות שימוש בתמונה המקורית לצורך השוואה, שחזרו חלקים מהאפיתליום הגלנדולרי שהוסרו במהלך הגדרת הסף והסרת הרעשים. בעת שחזור התמונה, הקפידו לבצע זאת בזהירות ובמידה מינימלית כדי לשמור על שלמות התמונה.

בחרו את כלי ספריי הצבע מתוך כלי הרישום. לחצו קליק ימני על כפתור כלי ספריי הצבע כדי להתאים את גודל הכלי, ולאחר מכן מלאו בזהירות את החלקים החסרים של הבלוטה באמצעות המקש השמאלי של העכבר. לאחר מכן, צרו תמונת שלד (skeletonized image) של הבלוטה לצורך ניתוח Sholl.

ראשית, העבירו את התמונה לפורמט בינארי. לאחר מכן, בצעו שלדון (skeletonization) של התמונה. תהליך זה מסיר שוב ושוב פיקסלים מקצוות התמונה הבינארית עד שהיא מצומצמת לצורה ברוחב פיקסל אחד.

כעת, בצעו הרחבה (dilate) של התמונה פעם אחת כדי לסגור את הפערים שנוצרו כתוצאה מתהליכי הסף (thresholding) והשלד (skeletonizing). לאחר מכן, שמרו את התמונה כקובץ חדש באמצעות פקודת "שמור בשם" (save as). לבסוף, בדקו את דיוק תמונת השלד אל מול המקור על ידי הנחת שתי התמונות זו על זו (overlaying).

בתיבת הדו-שיח להוספת תמונה, בחרו את תמונת השלד והגדירו את השקיפות שלה ל-30%. לאחר מכן, שמרו את השכבה העליונה כתמונה חדשה לעיון עתידי. כדי להתחיל, פתחו תמונת שלד והמירו את התמונה לפורמט בינארי. כעת, הגדירו את קנה המידה של התמונה.

הזינו את מספר הפיקסלים למילימטר, לאחר מכן הגדירו הן את המרחק הידוע (known distance) והן את יחס רבד הפיקסל (pixel aspect ratio) כ-1, הזינו מילימטרים כיחידת אורך והפעילו את האפשרות הגלובלית כדי להחיל את קנה המידה על כל התמונות. לאחר מכן, קבעו את רדיוס הסיום עבור ניתוח השול (sholl analysis) באמצעות כלי שרטוט הקווים. שרטטו קו מתחילת התעלה הראשית ועד לנקודה הדיסטלית ביותר של האפיתל הגלנדולרי.

לאחר מכן לחצו על מקש M והמרחק של הקו יוצג. כעת, הזינו את ההגדרות עבור ניתוח שול (sholl analysis). ראשית, בחרו אפשרויות בסעיף הגדרת המעטפות (definition of shells), הגדירו את רדיוס ההתחלה ל-0.00 millimeters והגדירו את גודל צעד הרדיוס ל-0.1 millimeters.

הגדירו את מספר הדגימות לאחת. אורך הקו ששורטט כעת יוזן באופן אוטומטי בשדה רדיוס הסיום. עבור אפשרויות של מספר דגימות לרדיוס, בחרו ב-mean (ממוצע) לצורך האינטגרציה.

עבור התיאורים (descriptors) ואפשרויות התאמת העקום, הגדירו את ערך החיתוך של רדיוס ההיקפי (enclosing radius cutoff) לאחד. בחרו ב-infer from starting radius עבור מספר הענפים הראשוניים, ובחרו באפשרויות linear ו-best fitting degree. לאחר מכן, תחת profiles without normalization, בחרו ב-most informative.

כעת, תחת סעיף שיטות ה-sholl, בחרו ב-area for normalized profile. לבסוף, בסעיף הפלט (output), בחרו ב-create intersections mask כדי ליצור מפת חום של נקודות החיתוך. כעת, פתחו חלון תצוגה מקדימה של התמונה עם הטבעות ואשרו את שטח הניתוח.

אם הכל נראה תקין, לחצו על אישור כדי להריץ את הניתוח. הרצת הניתוח תיצור חלון ליניארי של פרופיל Sholl, חלון חצי-לוגריתמי של פרופיל Sholl, חלון תוצאות Sholl המכיל את כל ערכי הפלט של ה-Sholl, וחלון שמות קבצים של פרופילי Sholl המספק את מספר ההצטלבויות בכל רדיוס כפי שנקבע על ידי הפולינום. כדי למדוד את ה-MEA, עבדו עם תמונת השלד (skeleton) של הבלוטה ב-ImageJ.

פתחו את כלי הפוליגון ושרטטו פוליגון סביב היקף הבלוטה. השתמשו בלחיצות עכבר כדי להוסיף מקטעי קו. כאשר כל השטח האפיתליאלי הוקף, לחצו לחיצה כפולה כדי לסגור את הפוליגון.

לאחר מכן, לחצו על מקש M כדי לפתוח חלון תוצאות. הערך בעמודת השטח (area) מתאים ל-MEA. אם האפיתל הבלוטתי חורג מגבולות קשרי הלימפה, הפחיתו את שטח קשרי הלימפה מה-MEA בעת חישוב צפיפות ההסתעפות.

ניתן למדוד את שטח קשרי הלימפה באופן דומה ל-MEA. באמצעות השיטות המתוארות, נותחו שתי קבוצות של חולדות בעלות גיל תואם. החיות בקבוצה B טופלו בחומר כימי הידוע כגורם להתפתחות מוקדמת של בלוטות החלב.

שרטוט מספר נקודות ההצטלבות של הענפים לאורך הרדיוס מהבלוטה ממחיש את השונות בתוצאות. תוצאות ניתוח ה-sholl חשפו הבדל ברור במספר הממוצע של נקודות ההצטלבות בין הקבוצות. עם זאת, יש לנרמל את נתוני ההצטלבות לשטח בלוטת החלב כדי להסיק מסקנות.

ניתוח השול (sholl analysis) ומדידות שטח האפיתל של בלוטת העלה מספקים שני פרמטרים פיזיולוגיים שימושיים לביצוע ניתוח השוואתי. ניכר כי גודל הבלוטות היה גדול בהרבה בקבוצת הטיפול. ניתוח השול מחזיר את הערך עבור Sum N, המשמש לחישוב צפיפות ההסתעפות והערך עבור k.

בקבוצת הטיפול, צפיפות ההסתעפות הממוצעת הגבוהה יותר והערך הממוצע הנמוך יותר של k, המשקף קצב נמוך יותר של דעיכת הסתעפות, מעידים על כך שבבעלי החיים שעברו טיפול היו בלוטות מפותחות יותר מאשר בבעלי החיים שלא טופלו. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי הסרת הרעש היא השלב הקריטי ביותר. הסרה מרובה מדי או מעטה מדי עלולה לפגוע בשלמות הבלוטה ולהטות את התוצאות.

בעת שימוש בשיטה זו, חשוב להתחיל עם דגימת רקמה שלמה ונקייה של בלוטת החלב. לא ניתן להשיג תמונה שלדית (skeletonized) מדויקת אם קיימים פגמים, כגון קרעים או קפלים. יצירת תמונה שלדית מדויקת דורשת סבלנות ותרגול.

לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו ב-15 עד 20 דקות לכל בלוטה מנותחת, במידה והיא מבוצעת כראוי.